張 劍，張 彤，王宏偉，張繼紅，張保禎，董欣敏

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 1.放療科；2.普外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，全世界每年的新診病例可達(dá)136萬(wàn)，病死率居惡性腫瘤的第4位[1]。中國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率、病死率盡管處于非高發(fā)水平，但其發(fā)病總例數(shù)及死亡總例數(shù)均高居世界第1位，且仍逐年上升[2]。微RNA(microRNAs,miRNAs)是一類非編碼、內(nèi)源性、長(zhǎng)度19～25個(gè)堿基的小分子RNA，通過(guò)對(duì)3′非編碼區(qū)的3′-UTR特異結(jié)合，與多種mRNA發(fā)生反應(yīng)，通過(guò)不完全互補(bǔ)反應(yīng)以抑制mRNA翻譯，通過(guò)完全互補(bǔ)反應(yīng)以促進(jìn)mRNA降解，調(diào)控、誘導(dǎo)多種編碼蛋白質(zhì)的基因表達(dá)，從而參與機(jī)體幾乎所有細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生命活動(dòng)[3]，并參與腫瘤細(xì)胞增殖、血管生長(zhǎng)，或在遠(yuǎn)處臟器構(gòu)建利于轉(zhuǎn)移的微環(huán)境，進(jìn)一步誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移、侵襲[4]。miR-433是位于第12號(hào)染色體的編碼基因，研究表明其高表達(dá)可以抑制細(xì)胞的遷移、增殖和分化，與腫瘤的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)[5]；胃癌、肝癌中miR-433作為抑癌基因存在，而其高表達(dá)與漿液性卵巢癌不良進(jìn)展預(yù)后亦高度相關(guān)[6]。但目前尚缺乏miR-433與結(jié)直腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究，本研究擬分析miR-433在結(jié)直腸癌中表達(dá)狀況及miR-433對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的影響以及二者的相關(guān)性，以期尋找結(jié)直腸癌新的靶向治療方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及試劑：人類結(jié)腸癌細(xì)胞系(HT-29、HCT-116和SW480)、人正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞系(NCM460)(中國(guó)細(xì)胞庫(kù))。

實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒、RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；碘化丙啶、Giemsa(Sigma-Adrich公司)；CCK-8試劑盒(同仁化學(xué)研究所)；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑、miR-433模擬物(上海吉瑪生物有限公司)；細(xì)胞培養(yǎng)基及血清(Gibco公司)。

1.1.2 入組人群和組織樣本：獲取2018年5月至2019年6月收治的125例結(jié)直腸癌患者的組織樣本檢測(cè)miR-433表達(dá)。其中女52例、男73例，平均年齡(47.8±10.5)歲；所有納入對(duì)象心、肝、腎、骨髓功能正常。病理學(xué)診斷為結(jié)直腸癌患者且接受了手術(shù)切除治療；排除標(biāo)準(zhǔn)：家族性腺瘤息肉病、遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌、多個(gè)病灶的原發(fā)癌，以及術(shù)前接受放療或化療、新輔助治療的患者。第1組：結(jié)直腸癌患者的癌組織樣本、癌旁組織樣本和癌病灶遠(yuǎn)端的正常結(jié)直腸黏膜,第2組：Ⅰ～Ⅳ 期(根據(jù)UICC分期系統(tǒng))結(jié)直腸癌患者樣本。組織樣本從手術(shù)室取得，清洗后并立即于液氮或-80 ℃冷凍儲(chǔ)存?zhèn)溆?。本研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[WZ(2021023)]，患者均于參與本研究前簽署書面知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)mRNA：用RNA提取試劑盒從結(jié)直腸癌組織樣本和結(jié)直腸癌細(xì)胞中分離提取組織或細(xì)胞中的總RNA定量。定量后將提取到的總RNA使用PrimeScript RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，由此產(chǎn)生的cDNA在miR-433引物作用下，使用SYBR PCR反應(yīng)混合液進(jìn)行擴(kuò)增。miR-433的相對(duì)量化水平應(yīng)用2-ΔΔCt方法計(jì)算。

1.2.2 穩(wěn)定和瞬時(shí)過(guò)表達(dá)miR-433結(jié)直腸癌細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染：構(gòu)建miR-433過(guò)表達(dá)載體，在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中通過(guò)克隆含完整的miR-433 cDNA編碼區(qū)的DNA片段擴(kuò)增到pcDNA3.1載體。用Lipofectamine2000將Pre-miR433瞬時(shí)轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞。用RT-qPCR驗(yàn)證miR-433的轉(zhuǎn)染效率，U6作為內(nèi)參進(jìn)行評(píng)估。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖：采用細(xì)胞計(jì)數(shù)Kit-8評(píng)估腫瘤細(xì)胞增殖能力。miR-433轉(zhuǎn)染后的腫瘤細(xì)胞以5×103個(gè)/孔種植到96孔板。根據(jù)操作要求，48 h后細(xì)胞中加入CCK-8試劑孵育，于酶標(biāo)儀下測(cè)定A值。計(jì)算細(xì)胞活性，計(jì)算公式：細(xì)胞相對(duì)活性=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)分析細(xì)胞周期：將腫瘤細(xì)胞接種到預(yù)先經(jīng)4 ℃、18 h包被有10 μg/mL纖連蛋白的96孔板，經(jīng)37 ℃、90 min孵育使細(xì)胞結(jié)合。孵育結(jié)束后，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)Kit-8量化附著細(xì)胞。檢測(cè)miR-433轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期分布的變化，培養(yǎng)細(xì)胞并以miR-433 mimics 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后用PI染色，以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布。

1.2.5 Transwell小室法檢測(cè)遷移和侵襲：將8 μm孔徑的半透膜放入24孔的細(xì)胞培養(yǎng)板。將培養(yǎng)的結(jié)直腸癌細(xì)胞按2×105個(gè)/mL加入到無(wú)血清條件的上室，室底部充滿了含有20%胎牛血清的細(xì)胞增殖基質(zhì)，37 ℃孵育。24 h后非遷移的細(xì)胞仍然在隔膜的上表面層，可以被棉球檫掉，而遷移的細(xì)胞已移動(dòng)到膜的下層并被冰冷的甲醇固定，用5% Giemsa 染色，在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野200倍放大計(jì)數(shù)，每個(gè)樣本重復(fù)計(jì)數(shù)3次。腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)用預(yù)先包被了基底膜基質(zhì)的半透膜進(jìn)行，其他步驟同上述細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 腫瘤細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)細(xì)胞，用miR-433模擬物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h，進(jìn)行劃痕愈合試驗(yàn)。簡(jiǎn)言之，腫瘤細(xì)胞形成單層細(xì)胞后，使用10 μL微量移液管劃一個(gè)傷口，然后用冰冷的PBS簡(jiǎn)單的清洗細(xì)胞,進(jìn)一步培養(yǎng)48～72 h。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-433在臨床標(biāo)本中的相對(duì)表達(dá)

與癌旁組織相比，miR-433在結(jié)直腸癌組織CRC中表達(dá)顯著降低(P<0.05)(圖1A)。在結(jié)腸癌患者血清中miR-433水平也顯著低于健康人群(P<0.05)(圖1B)。從TNM Ⅰ期到Ⅳ期，結(jié)直腸癌組織內(nèi)miR-433表達(dá)逐漸降低(P<0.05)(圖1C)。

A.miR-433 expression in rectal cancer and adjacent tissues，*P<0.05 compared with control group;B.miR-433 expression in serum of colorectal cancer patients and normal people,*P<0.05 compared with control group;C.miR-433 expression in different stages;*P<0.05 compared with TNM Ⅰ group；#P<0.05 compared with TNM Ⅱ group；△P<0.05 compared with TNM Ⅲ group圖1 miR-433在直腸癌組織和癌旁組織以及健康人群血清中的表達(dá)Fig 1 Expression of miR-433 in rectal cancer and adjacent tissues of patients and serum of normal population

2.2 miR-433在直腸癌系和正常細(xì)胞系的表達(dá)

與健康人結(jié)腸上皮細(xì)胞系NCM460相比，在結(jié)直腸癌細(xì)胞系HT-29、HCT-116、SW480中，miR-433表達(dá)下調(diào)(P<0.05)(圖2)。

*P<0.05 compared with NCM460 group圖2 miR-433在直腸癌系和正常細(xì)胞系的表達(dá)Fig 2 Expression of miR-433 in rectal cancer cell lines and normal cell line

2.3 上調(diào)miR-433表達(dá)抑制SW480細(xì)胞系增殖

SW480轉(zhuǎn)染miR-433模擬物(圖3A)，與對(duì)照miRNA組相比，SW480細(xì)胞增殖水平明顯降低(P<0.05)(圖3B)。

A.miR-433 mimic transfection;B.the effect of miR-433 minic transfection on the proliferation of SW480；*P<0.05 compared with control group圖3 上調(diào)miR-433對(duì)SW480增殖的影響Fig 3 Effect of up-regulation of miR-433 on proliferation of SW480

2.4 上調(diào)miR-433表達(dá)誘導(dǎo)SW480細(xì)胞周期阻滯

SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-433 mimic后，G2期和M期細(xì)胞明顯增加(P<0.05)(圖4)。

圖4 上調(diào)miR-433表達(dá)對(duì)SW480細(xì)胞周期阻滯的影響Fig 4 Effect of up-regulation of miR-433 on cell cycle arrest in SW480 cells

2.5 上調(diào)miR-433抑制SW480細(xì)胞侵襲與遷移

SW480具有較強(qiáng)的遷移能力。上調(diào)細(xì)胞內(nèi)miR-433表達(dá)后，遷移能力顯著下降(P<0.05)(圖5A)；對(duì)照組以及對(duì)照miRNA組細(xì)胞均有明顯的侵襲穿透基質(zhì)膠現(xiàn)象，轉(zhuǎn)染miR-433 mimic后，與對(duì)照miRNA組相比，穿膜數(shù)目明顯減少(P<0.05)(圖5B)(表1)。

A.effect of miR-433 on invasion;B.effect of miR-433 on migration圖5 miR-433對(duì)SW480細(xì)胞侵襲和遷移的影響Fig 5 Effect of miR-433 on invasion and migration of SW480 cells

表1 上調(diào)miR-433抑制細(xì)胞遷移與侵襲Table 1 Up-regulation of miR-433 decreased cells migration and invasion(%)

3 討論

人類編碼miRNA數(shù)千個(gè)，可調(diào)節(jié)約30%以上的人類基因蛋白。且每個(gè)miRNA可產(chǎn)生多個(gè)靶點(diǎn)效應(yīng)，每個(gè)靶點(diǎn)又會(huì)接受多個(gè)miRNAs調(diào)控。腫瘤的進(jìn)展過(guò)程中，由于表觀遺傳學(xué)及大量遺傳學(xué)的變化，使得蛋白和基因表達(dá)異常，細(xì)胞凋亡、細(xì)胞黏附、細(xì)胞周期、DNA修復(fù)等亦受到影響[7]。故研究miRNA與腫瘤早期診斷、分期變化、侵襲、遷移、預(yù)后和復(fù)發(fā)等機(jī)制密切相關(guān)[8]，其既可作為抑癌基因促進(jìn)抑癌因子釋放，也可作為致癌基因誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生，其功能均取決于所調(diào)控之靶基因[9]。pri-miR-433含1 809個(gè)核苷酸、124個(gè)堿基對(duì)。同于12號(hào)染色體的miR-127基因與其有297個(gè)堿基對(duì)發(fā)生重疊。故存在miRNA之間的基因結(jié)構(gòu)相互重疊，從而可擴(kuò)大miRNA基因本身所攜帶的可應(yīng)用信息量，進(jìn)一步適應(yīng)于較多種類的復(fù)雜的生理相關(guān)功能的調(diào)節(jié)[10-11]。本研究著重探討miR-433對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。首先，檢測(cè)miR-433在臨床組織標(biāo)本中的表達(dá)水平，與非腫瘤組織相比，癌組織中miR-433的表達(dá)水平明顯降低，同時(shí)在血清中也得到了類似的結(jié)果。此外，本研究也證實(shí)，在TNMⅠ～Ⅳ 分期中，miR-433的表達(dá)水平也逐漸降低。這表明miR-433水平與結(jié)直腸癌疾病進(jìn)展呈一定的負(fù)相關(guān)。

為了證實(shí)miR-433與結(jié)直腸癌生物學(xué)中的作用，隨后檢測(cè)了結(jié)直腸癌細(xì)胞系HT-29、HCT-116、SW480和正常的NCM460細(xì)胞系中miR-433的表達(dá)水平，結(jié)果示：HT-29、HCT-116和SW480中miR-433表達(dá)水平顯著低于正常結(jié)直腸細(xì)胞系NCM460。隨后以SW480為研究對(duì)象，通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-433 mimic，檢測(cè)細(xì)胞的增殖水平、細(xì)胞周期以及侵襲與遷移的變化。CCK-8結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-433 mimic以上調(diào)其表達(dá)水平后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞的增殖活性明顯降低。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果也顯示，過(guò)表達(dá)miR-433 minic后，G2和M期細(xì)胞明顯增多，說(shuō)明miR-433參與細(xì)胞周期阻滯，與其他研究結(jié)果類似[12]。惡性腫瘤最顯著的特征是侵襲與遷移。隨后通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室法也證實(shí)，上調(diào)miR-433表達(dá)后，細(xì)胞的侵襲與遷移水平顯著降低，表明miR-433能負(fù)向調(diào)控SW480細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移。

總之，本研究證實(shí)miR-433高表達(dá)可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移、增殖，與腫瘤的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)。miR-433的異常調(diào)節(jié)可能是結(jié)直腸癌診斷和預(yù)后的一個(gè)潛在生物標(biāo)志物。結(jié)合生物標(biāo)志物組合的敏感性和特異性，通過(guò)調(diào)節(jié)血漿、組織中miR-433的方法可能發(fā)展成為結(jié)直腸癌防治的重要靶點(diǎn)。