王芙蓉，嚴(yán) 謹(jǐn)，賀豐杰*

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 產(chǎn)科,陜西 咸陽(yáng) 712000；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046)

子癇前期(pre-eclampsia,PE)是孕產(chǎn)婦和新生兒發(fā)病和死亡的主要原因。其確切病因尚不清楚，但一般認(rèn)為與血管生成失衡、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激和內(nèi)皮功能障礙有關(guān)[1]。PE與成人心血管疾病(adult cardiovascular disease,CVD)具有多種相同的病理生理途徑，如炎性反應(yīng)、內(nèi)皮功能障礙以及糖尿病、高血壓等[2]?？扇苄詅ms樣酪氨酸激酶1(soluble fms-like tyrosine kinase-1,sFlt-1)在小鼠中過(guò)度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致高血壓，血管反應(yīng)性異常以及PE表型其他特征的發(fā)生[3-5]，可用于誘導(dǎo)小鼠PE模型。他汀類藥物具有降脂、抗氧化、抗感染等多種作用，在臨床中應(yīng)用廣泛。由于CVD和PE之間的相似性、他汀類藥物在PE預(yù)防中的生物可行性以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，使用他汀類藥物預(yù)防PE漸漸成為一些研究人員關(guān)注的焦點(diǎn)[6]。在進(jìn)行哺乳的PE母鼠中使用普伐他汀則可以恢復(fù)其血管生成平衡和血管輪廓，抑制高血壓、腎臟損傷以及與PE有關(guān)的生長(zhǎng)受限[5-7]。此外，細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的異常侵襲和過(guò)度凋亡與PE的發(fā)展有關(guān)[7]。本研究的目的在于探究普伐他汀對(duì)PE小鼠胎盤組織中抗凋亡路徑的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑、動(dòng)物及細(xì)胞

編碼sFlt-1的復(fù)制缺陷型重組腺病毒(北京本元正陽(yáng)公司進(jìn)行制備并進(jìn)行滴度測(cè)定)；ICR小鼠[西安交通大學(xué)(SCXK(陜)2014-003)]；sFlt-1 ELISA檢測(cè)試劑盒(R&D Systems公司)；293細(xì)胞(ATCC)；p-ATF-2、p-p38、p-ERK、p-HSP27、p-STAT3、p-p53及β-actin抗體(Santa Cruz Biotechnology公司)。

1.2 方法

1.2.1 腺病毒載體的擴(kuò)增及純化：采用HEK293細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染。待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞于正常條件下培養(yǎng)2～3 d，至70%～80%匯合時(shí)可以進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將含有1%青霉素/鏈霉素、2%胎牛血清以及病毒的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基加入到每個(gè)平板中，培養(yǎng)20 h后收集細(xì)胞，離心去掉上清液，得到的細(xì)胞儲(chǔ)存在-80 ℃中或直接用于純化。水浴融化凍存的細(xì)胞，然后將2 mL Tris緩沖液(10 mmol/L，pH 8.0)加入其中，反復(fù)凍融6次。1 000 r/min離心10 min，得到包含病毒的上清液。將包含病毒的上清液加入CsCl中直到1.43 g/mL，離心后用18號(hào)針頭和5 mL注射器收集腺病毒條帶，再注入到CsCl 為1.34 g/mL的離心管中，4 ℃、35 000 r/min離心16 h。收集富集有腺病毒顆粒的條帶，裝入平衡好的截留分子質(zhì)量為3.5 ku的透析袋中進(jìn)行透析，經(jīng)溶液(10 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA,0.1% SDS)稀釋后用分光光度計(jì)測(cè)算其濃度。

1.2.2 動(dòng)物的分組及處理：將正常妊娠第9天的ICR小鼠隨機(jī)分為：對(duì)照組(Con)，不經(jīng)任何干預(yù)；PE模型組(PE)，尾靜脈注射攜帶sFlt-1的病毒以誘導(dǎo)小鼠子癇前期(109PFUs/100 μL)；治療組(PE+Pravastatin)，按體質(zhì)量喂灌普伐他汀[Pravastatin,5 mg/(kg·d)]，直至母鼠停止哺乳。第19天收集母鼠心臟血、胎盤，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)：室溫凝固收集的血樣，于4 ℃放置過(guò)夜，3 000×g離心10 min，取上清。按照ELISA試劑盒說(shuō)明檢測(cè)各組小鼠血清sFlt-1，450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度值(A)并計(jì)算sFlt-1水平。

1.2.4 免疫印跡分析(Western blot)檢測(cè)：在冰冷環(huán)境下粉碎凍干的胎盤，然后在裂解緩沖液中勻漿；4 ℃下12 000 r/min離心10 min，收集上清液；采用Bradford法(Bio-Rad)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后進(jìn)行SDS-PAGE，分離蛋白質(zhì)。將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后用3% (w/v)的脫脂奶粉在含0.1%吐溫20的PBS (10 mmol/L Tris,140 mmol/L NaCl,0.1% Tween 20,pH=7.4)中室溫封閉1 h。之后加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；再用二抗室溫孵育1 h。檢測(cè)激活轉(zhuǎn)錄因子-2(activating transcription factor-2,ATF-2)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extra-cellular regulated protein kinases,ERK)1/2、熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)27、p38 MAPK、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(signal transducer and activator of transcription,STAT)3和p53。以β-actin作為內(nèi)參，用化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 母鼠基本情況

妊娠18 d后，對(duì)照組、PE模型組以及治療組的母鼠體質(zhì)量、產(chǎn)仔數(shù)及胎盤質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 母鼠基本情況Table 1 Basic information of

2.2 血清sFlt-1水平

PE模型組小鼠血清sFlt-1水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；而經(jīng)普伐他汀治療后，顯著下調(diào)(P<0.05)(圖1)。

2.3 胎盤組織ATF-2、p38、ERK蛋白磷酸化水平

PE模型組小鼠胎盤組織ATF-2、p38以及ERK蛋白的磷酸化水平均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。而經(jīng)普伐他汀治療后，顯著上調(diào)(P<0.05)(圖2，表2)。

表2 小鼠胎盤組織p-ATF-2,p-p38和p-ERK相對(duì)表達(dá)量Table 2 Relative expression of p-ATF-2,p-p38 and p-ERK in placenta of different mice groups

圖2 小鼠胎盤組織ATF-2、p38、ERK蛋白磷酸化水平Fig 2 phosphorylation of ATF-2,p38 and ERK proteins in placenta of different mice groups

2.4 胎盤組織HSP27、STAT3蛋白磷酸化水平

PE模型組小鼠胎盤組織HSP27和STAT3蛋白的磷酸化水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。而經(jīng)普伐他汀治療后，顯著上調(diào)(P<0.05)(圖3，表3)。

表3 小鼠胎盤組織p-HSP27和p-STAT3的相對(duì)表達(dá)量Table 3 Relative expression of p-HSP27 and p-STAT3 in placenta of different mice

圖3 小鼠胎盤組織HSP27、STAT3蛋白磷酸化水平Fig 3 Phosphorylation of HSP27 and STAT3 proteins in placenta of mice

*P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with PE圖1 各組小鼠血清sFlt-1濃度Fig 1 serum concentration of sFlt-1 of different

2.5 胎盤組織p53蛋白磷酸化水平

對(duì)照組、PE模型組和治療組小鼠胎盤組織p-p53蛋白的磷酸化水平無(wú)差異(圖4)。

圖4 各組小鼠胎盤組織p53蛋白磷酸化水平Fig 4 phosphorylation of p53 in placenta of different

3 討論

PE是最常見(jiàn)的高血壓并發(fā)癥，同時(shí)也是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和胎兒并發(fā)癥和死亡的主要原因之一。sFlt-1升高是導(dǎo)致母體出現(xiàn)PE癥狀的最主要原因之一。血清sflt-1水平越高，利用的VEGF水平越低，內(nèi)皮功能障礙越嚴(yán)重[8]。子癇前期孕婦血漿sFlt-1濃度高于正常孕婦，嚴(yán)重子癇前期孕婦高于輕度子癇前期孕婦[9]。過(guò)度表達(dá)sFlt-1蛋白的大鼠具有高BP，蛋白尿和內(nèi)皮損傷，表現(xiàn)出明顯的PE癥狀[5]?；诖?，本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染攜帶sFlt-1片段的腺病毒成功構(gòu)建了PE小鼠模型。

p38MAPK信號(hào)通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)能夠促進(jìn)細(xì)胞存活。然而，關(guān)于該通路在PE發(fā)病機(jī)制中的作用尚未明確。普伐他汀因親水性強(qiáng)、抑制HMG-Co A活性的能力最低，難以通過(guò)胎盤屏障，易于清除等特點(diǎn)成為最受關(guān)注的他汀類藥物。普伐他汀通過(guò)激活內(nèi)皮細(xì)胞中的ERK1/2、Akt和MAPK途徑誘導(dǎo)血管生成，調(diào)節(jié)sFlt-1和sEng水平來(lái)調(diào)節(jié)血管生成平衡[10-11]。ERK/MAPK信號(hào)通路對(duì)胎盤的正常生長(zhǎng)、發(fā)育和形態(tài)發(fā)生至關(guān)重要。當(dāng)ERK1信號(hào)傳導(dǎo)受到抑制時(shí)，滋養(yǎng)層細(xì)胞的氧化損傷加重，暗示了ERK1/2通路在細(xì)胞抵抗氧化損傷促進(jìn)存活中的作用[12]。

在本研究中，sFlt-1過(guò)表達(dá)導(dǎo)致小鼠表現(xiàn)出PE表型，各胎盤組織中的抗凋亡因子(ATF-2、p38、ERK、HSP27和STAT3)磷酸化水平均顯著降低。ATF-2、p38和ERK是典型的促生長(zhǎng)/抗凋亡因子，在促進(jìn)細(xì)胞增殖中起到關(guān)鍵作用。HSP27和STAT3蛋白已被證明與胚胎發(fā)育過(guò)程中的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡有關(guān)，是重要的促生存標(biāo)志物和轉(zhuǎn)錄因子[13-14]。這些因子磷酸化水平的降低，提示了sFlt-1引發(fā) PE可能與抑制MAPK信號(hào)通路的激活，進(jìn)而抑制內(nèi)皮細(xì)胞生存，促進(jìn)細(xì)胞過(guò)度凋亡有關(guān)。經(jīng)過(guò)普伐他汀治療后，ATF-2、p38、ERK、HSP27和STAT3的磷酸化水平均得到顯著上調(diào)，提示普伐他汀可能通過(guò)促進(jìn)MAPK信號(hào)通路的激活，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生存，抑制凋亡來(lái)發(fā)揮對(duì)胎盤的保護(hù)作用。此外，p53蛋白是細(xì)胞增殖周期的負(fù)調(diào)節(jié)因子，能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在本研究中未觀察到p53磷酸化水平的變化，提示p53可能并未直接參與MAPK信號(hào)促生存的過(guò)程。

本研究的結(jié)果顯示普伐他汀能夠上調(diào)PE小鼠MAPK信號(hào)通路中抗凋亡因子的磷酸化水平，提示了普伐他汀對(duì)PE的治療作用與激活MAPK通路的抗凋亡路徑有關(guān)。