杜云鋒,杜向紅△,張 偉,劉 偉,陳 寧
1 河南省人民醫(yī)院,河南 鄭州450008;2 河南中醫(yī)藥大學(xué)分析測(cè)試中心
中藥抗毒合劑是河南省人民醫(yī)院院內(nèi)制劑(豫藥制字Z04010258),由金銀花、連翹、葛根、大青葉、板藍(lán)根和柴胡6 味中藥組成。該方為本院著名兒科專家羅致桓主任的臨床經(jīng)驗(yàn)方,具有清熱解毒和涼血消腫的功效,主治上呼吸道感染及感冒發(fā)熱、扁桃體炎、腮腺炎等[1]。其中葛根具有解肌退熱、透發(fā)麻疹、生津止渴、升陽止瀉的作用,葛根素是葛根的主要活性成分之一[2-6],為更好地控制藥品質(zhì)量,本研究參照相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[7-10],采用高效液相色譜法測(cè)定其含量,以期為全面有效控制產(chǎn)品質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)[11-13]。
1.1 儀器Agilent 1260 高效液相色譜儀(四元梯度泵、DAD 檢測(cè)器,美國安捷倫科技有限公司);METTLER AE240 十萬分之一天平、FA2004A 萬分之一天平(上海精科天美科學(xué)儀器有限公司);KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);HH-S 型水浴鍋(鞏義市英峪予華儀器廠);1810-B 型石英自動(dòng)雙重純水蒸餾器(江蘇大地儀器廠);ZF-7 型三用紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司);DHG-9053A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠);HP8200 型飛利浦電吹風(fēng)(珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)飛利浦家適電器有限公司)。
1.2 藥品與試劑葛根素對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院,批號(hào):111224);甲醇為色譜純;娃哈哈純凈水;其他試劑為分析純??苟竞蟿ㄅ?hào):20130110、20130125、20130212)由河南省人民醫(yī)院提供。所用飲片均購于禹州藥材市場(chǎng),并經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)董誠明教授鑒定。本實(shí)驗(yàn)所有樣品執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)均為《中華人民共和國藥典》2015年版一部。
2.1 色譜條件色譜柱:Agilent C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)柱;流動(dòng)相:甲醇-水溶液(23∶77);檢測(cè)波長:250 nm;柱溫:30℃;流速:1 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL。理論板數(shù)按葛根素峰計(jì)算不低于4000,且分離度大于1.5。
2.2 溶液的制備
2.2.1 對(duì)照品溶液制備 取葛根素對(duì)照品適量,精密稱定,置于10 mL 容量瓶中,加30%乙醇制成每1 mL含20μg的溶液,即得。
2.2.2 供試品溶液制備 精密量取抗毒合劑1 mL,置于10 mL 容量瓶中,用30%乙醇定容至刻度,搖勻備用。
2.2.3 陰性溶液制備 按處方配比,取除去葛根的其他藥材,按抗毒合劑制法制成合劑,再按供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。
2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液各10μL,注入液相色譜儀中,陰性對(duì)照樣品在葛根素相應(yīng)保留時(shí)間無色譜峰干擾。見圖1—3。
圖1 葛根素對(duì)照品溶液色譜圖
圖2 抗毒合劑供試品溶液色譜圖
圖3 抗毒合劑陰性對(duì)照品色譜圖
2.4 方法學(xué)考察
2.4.1 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下葛根素對(duì)照品溶液,分別以4、8、10、15、25 μL 按“2.1”色譜條件進(jìn)樣,以峰面積(Y)為縱坐標(biāo),對(duì)照品的量(X)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程Y=138.63X-58.954(r=0.9998),表明葛根素在10~62.5μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見圖4。
圖4 葛根素的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液10 μL,連續(xù)進(jìn)樣6 次,以葛根素峰面積計(jì)算,RSD為0.19%,表明儀器精密度良好,見表1。
表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)
2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)供試品6 份(批號(hào):20130110),按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,分別精密吸取各供試品溶液10μL,以葛根素峰面積計(jì)算,RSD 為1.10%,表明本試驗(yàn)方法重復(fù)性良好,見表2。
表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)
2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取相同供試品溶液,分別于配制后0、4、8、12、24 h,精密吸取10 μL,測(cè)定,結(jié)果葛根素峰面積RSD 為2.04%,表明制備溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定,見表3。
表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)
2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的同一樣品2.5 mL(批號(hào):20130110),用30%乙醇定容至50 mL,精密量取6份,分別加入一定量的葛根素對(duì)照品溶液,制備樣品溶液,精密吸取10μL,注入液相色譜儀,按“2.1”色譜條件測(cè)定。結(jié)果見表4。
表4 葛根素回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)
2.5 含量測(cè)定取3 個(gè)不同批次樣品,精密量取,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試樣品溶液,分別精密吸取樣品溶液各10μL,按“2.1”色譜條件測(cè)定,根據(jù)回歸方程計(jì)算含量。結(jié)果見表5。
表5 含量測(cè)定結(jié)果 mg/mL
抗毒合劑以金銀花、連翹為君藥,其中金銀花[14]宣散風(fēng)熱,清解血毒,具有廣譜抗菌、抗病毒、解熱抗炎、利膽保肝、降脂等作用;連翹[15]散結(jié)消腫,具有抗菌、抗病毒、抗氧化等作用,兩者共奏清熱解毒,涼血消腫功效。葛根、大青葉、板藍(lán)根、柴胡為臣藥,其中葛根[16]解肌退熱、發(fā)表透疹;大青葉[17]解毒、涼血、止血,具有抗病原微生物、抗內(nèi)毒素、抗炎、增強(qiáng)免疫功能等作用;板藍(lán)根[18]涼血消斑、利咽止痛,具有清熱解毒、涼血利咽等作用;柴胡解表退熱、疏肝解郁、升舉陽氣。諸藥聯(lián)用主治上呼吸道感染及感冒發(fā)熱、扁桃體炎、腮腺炎等。已應(yīng)用于臨床數(shù)十年,療效顯著。葛根素為葛根發(fā)揮功效的主要指標(biāo)性成分,具有解肌退熱、透發(fā)麻疹、生津止渴、升陽止瀉等作用[19]。
目前對(duì)該制劑的研究主要集中在提取工藝和藥理作用2 方面。王豫等[20]對(duì)金銀花、葛根藥材進(jìn)行了提取工藝研究;劉宜生[21]對(duì)抗毒合劑進(jìn)行了急性毒性實(shí)驗(yàn)研究。對(duì)其質(zhì)量控制方法按照醫(yī)院內(nèi)部制劑手冊(cè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行,僅局限于對(duì)其中單一成分綠原酸的薄層鑒別,而無明確的含量測(cè)定方法。高效液相色譜法能夠較好反映中藥整體質(zhì)量,具有分離效能高、檢測(cè)靈敏度高、分析速度快、選擇性高等特點(diǎn),而被廣泛應(yīng)用于中藥及其制劑的綜合宏觀分析[22]。
本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、乙醇不同濃度對(duì)樣品進(jìn)行溶解,結(jié)果發(fā)現(xiàn)30%乙醇作為葛根素溶媒時(shí)分離度好,峰形對(duì)稱,無雜峰干擾,因此葛根素含量測(cè)定時(shí)采用30%乙醇作為溶劑。中藥制劑成分復(fù)雜,各藥味之間成分相互干擾,葛根素最大吸收波長為250 nm,但在其檢測(cè)波長下含量測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)峰形拖尾且與相鄰峰有干擾,進(jìn)而對(duì)流動(dòng)相梯度進(jìn)行了探索,結(jié)果以被測(cè)成分峰對(duì)稱性好且分離效果較佳的梯度為最佳梯度。同時(shí)分別比較了乙腈-水、甲醇-水以及甲醇-水溶液(23∶77)作為流動(dòng)相,發(fā)現(xiàn)以甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)色譜峰分離度差,且相同成分出峰時(shí)間較長,基線較漂;以乙腈-水作為流動(dòng)相出峰時(shí)間縮短,但是基線較漂,且色譜峰有拖尾現(xiàn)象;以甲醇-水溶液(23∶77)作為洗脫溶劑時(shí)供試品峰基線較平穩(wěn),各色譜峰的分離效果較好,因此采用甲醇-水溶液(23∶77)為流動(dòng)相。
以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法便于操作、分離效果好,專屬性好,重現(xiàn)性好,可作為抗毒合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的含量測(cè)定方法。