李曉芹，丁洪流 ，何新葉，王偉

1.蘇州市食品檢驗(yàn)檢測中心（蘇州 215104）；2.蘇州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院（蘇州 215104）

中國對(duì)畜禽產(chǎn)品、蛋奶制品等的需求日益增長，但違法用藥造成動(dòng)物源性食品獸藥殘留量超標(biāo)，動(dòng)物性食品安全狀況不容樂觀[1-2]。食以安為先，國家不斷加大對(duì)食品安全的監(jiān)管力度。但現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)[3-6]多按照類別進(jìn)行獸藥殘留檢測，只能滿足一類或少數(shù)幾類獸藥的檢測，單一標(biāo)準(zhǔn)無法做到多種類藥物覆蓋[7]，導(dǎo)致檢測步驟繁瑣、檢驗(yàn)周期過長、檢測成本偏高，從而降低監(jiān)管效率。對(duì)動(dòng)物源性食品中未知風(fēng)險(xiǎn)實(shí)施有效監(jiān)控，需要建立盡可能全覆蓋的獸藥殘留篩查方法[8]。

動(dòng)物源性食品基質(zhì)復(fù)雜，同時(shí)獸藥殘留量含量甚微、極性差別大。因此，樣品前處理成為分析過程中耗時(shí)最長、產(chǎn)生誤差最多的一個(gè)環(huán)節(jié)，是實(shí)現(xiàn)獸藥殘留高通量快速分析必須要突破的難點(diǎn)[9]。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)不斷進(jìn)步，因其高靈敏度、高選擇性和抗干擾能力，推動(dòng)獸藥殘留的分析從單一類別發(fā)展為跨種類高通量分析，同時(shí)降低對(duì)樣品前處理的要求[10]。試驗(yàn)采用UPLC-MS/MS，通過一次提取凈化，同時(shí)測定動(dòng)物源性食品中磺胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、硝基咪唑類等11類114種獸藥殘留。該方法前處理技術(shù)簡單，方法可靠，檢測成本低，為實(shí)驗(yàn)室建立動(dòng)物源性食品中獸藥多殘留檢測技術(shù)提供經(jīng)驗(yàn)和參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液質(zhì)聯(lián)用儀（I-Class Xevo TQ-XS，配電噴霧離子（ESI）源，美國Waters）；高速冷凍離心機(jī)（Allegra X-30R，美國貝克曼）；氮吹儀（N-EVAP型，美國Organomation）；數(shù)顯型渦旋混合儀（德國IKA）；超純水儀（美國密理博）。

乙腈（質(zhì)譜級(jí)，德國Merck）；甲醇（質(zhì)譜級(jí)，德國Merck）；甲酸（質(zhì)譜級(jí)，日本TCI）；試驗(yàn)用水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水；固相萃取柱（Oasis PRiME HLB，6 mL/200 mg，美國Waters）；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度92.7%～100%，德國Dr.Ehrenstorfer或Witega）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取10 mg（精確至0.01 mg）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇溶解定容，配制成1000 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，棕色儲(chǔ)液瓶存儲(chǔ)，于-18 ℃保存，保存期1年。分別移取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-18 ℃保存，保存期6個(gè)月。

1.3 樣品處理方法

1.3.1 對(duì)于魚肉等易分散的樣品

準(zhǔn)確稱取2.5 g（精確至0.01 g）均質(zhì)后的試樣置50 mL帶蓋塑料離心管中，加入10 mL 0.2%甲酸-水乙腈（20∶80，V/V）混合溶液，渦旋混勻提取1 min，超聲提取2 min，按8000 r/min離心3 min后，取3 mL上清液上固相萃取柱，準(zhǔn)確移取2 mL濾液氮吹至近干，用初始流動(dòng)相定容至0.5 mL，超聲溶解2 min，按10000 r/min離心5 min后取清液直接供質(zhì)譜分析。需同時(shí)做空白試驗(yàn)。

1.3.2 對(duì)于豬肉、蝦肉等不易分散的樣品

準(zhǔn)確稱取2.5 g（精確至0.01 g）均質(zhì)后的試樣置50 mL帶蓋塑料離心管中，先加入2 mL 0.2%甲酸水溶液，渦旋分散后加入8 mL 0.2%甲酸乙腈溶液。按照1.3.1“渦旋混勻提取1 min……”的步驟繼續(xù)提取凈化。

1.3.3 對(duì)于牛奶、雞蛋等含水量較大的樣品

準(zhǔn)確稱取2 g（精確至0.01 g）搖勻后的試樣置50 mL帶蓋塑料離心管中，直接加入8 mL 0.2%甲酸乙腈溶液，按照1.3.1“渦旋混勻提取1 min……”的步驟繼續(xù)提取凈化。

1.4 基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

稱取與試樣基質(zhì)相應(yīng)的陰性樣品（精確至0.01 g），加入適量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3的步驟和試樣一同進(jìn)行提取和凈化。

1.5 色譜和質(zhì)譜條件

1.5.1 液相條件

色譜柱，Waters Acquity UPLC BEH C182.1 mm×100 mm，1.7 μm；柱溫45 ℃；進(jìn)樣體積2 μL；流速0.30 mL/min；流動(dòng)相A為0.2%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為0.2%甲酸甲醇溶液。梯度洗脫條件：0 min 98% A，0.5 min 98% A，13 min 1% A，15 min 1% A，15.1 min 98% A，17 min 98% A。

1.5.2 質(zhì)譜條件

ESI+模式掃描，MRM采集模式；毛細(xì)管電壓1.0 kV；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度600 ℃；脫溶劑氣流速1000 L/h；錐孔氣150 L/h；碰撞氣流速0.15 mL/min。各化合物的離子對(duì)、錐孔電壓及碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 114種化合物的MRM質(zhì)譜采集參數(shù)及回歸方程

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化

通過泵直接將標(biāo)液注射入離子源，根據(jù)分子質(zhì)量和帶電方式，進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析，得到分子離子峰，確定各目標(biāo)物的母離子，同時(shí)優(yōu)化錐孔電壓。對(duì)母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，得到碎片離子信息，選取2～3個(gè)響應(yīng)較高、穩(wěn)定的特征性子離子，同時(shí)優(yōu)化碰撞能量。

在進(jìn)樣模式下，連接色譜柱，通過優(yōu)化毛細(xì)管電壓、離子源溫度、脫溶劑氣溫度、脫溶劑氣流速、錐孔氣流速等條件，選取合適的質(zhì)譜條件。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，毛細(xì)管電壓對(duì)離子對(duì)豐度影響明顯。比較毛細(xì)管電壓在0.2～2.5 kV范圍內(nèi)目標(biāo)物的響應(yīng)強(qiáng)度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)毛細(xì)管電壓1.0 kV時(shí)，喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、β-受體激動(dòng)劑和硝基咪唑類的標(biāo)物響應(yīng)強(qiáng)度整體較高，噪音低，磺胺類等其他化合物的響應(yīng)強(qiáng)度可接受。

通過實(shí)際陰性樣品基質(zhì)配標(biāo)和溶劑配標(biāo)得到的圖譜進(jìn)行比較，選取干擾較小、信噪比最高的離子對(duì)進(jìn)行監(jiān)測，確定為定量和定性離子對(duì)。

多種化合物同時(shí)檢測，采集通道增多，導(dǎo)致峰的采集點(diǎn)數(shù)變少，從而降低定量結(jié)果的準(zhǔn)確度和重復(fù)性。根據(jù)待測物的保留時(shí)間（tR），進(jìn)行分段采集（tR±0.5 min），以保證每個(gè)峰有足夠的采集點(diǎn)數(shù)。

2.2 液相條件優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相體系選擇

考察不同種類的流動(dòng)相體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入乙酸銨使峰形更加尖銳，但同時(shí)信號(hào)整體降低，喹諾酮類拖尾嚴(yán)重。加入0.2%甲酸使得喹諾酮類拖尾現(xiàn)象明顯改善，可能是由于該酸性條件下喹諾酮類化合物溶解性更好。乙腈體系下色譜系統(tǒng)壓力適中，但部分目標(biāo)物峰形略差，有略微前伸或拖尾現(xiàn)象存在。甲醇有更強(qiáng)的洗脫能力，得到的峰形尖銳，響應(yīng)強(qiáng)度略有提高，但系統(tǒng)壓力比較高。因此，在滿足信噪比的前提下，采用0.2%甲酸水-0.2%甲酸甲醇體系，降低流動(dòng)相流速，以0.3 mL/min流速梯度洗脫，柱壓適中，同時(shí)流動(dòng)相更易配制，利于實(shí)驗(yàn)室提高檢驗(yàn)效率。在此流動(dòng)相條件下，負(fù)模式響應(yīng)差，因此只選取正模式下響應(yīng)強(qiáng)度滿足要求的獸藥。

2.2.2 流動(dòng)相梯度優(yōu)化

因同系物較多，例如磺胺甲氧嗪/磺胺間甲氧嘧啶/磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺二甲異惡唑/磺胺二甲惡唑、磺胺醋酰/磺胺脒、氟甲喹/惡喹酸、磺胺間二甲氧嘧啶/磺胺多辛、阿苯達(dá)唑砜/羥基甲苯咪唑、金剛乙胺/美金剛等，通過離子對(duì)不能完全區(qū)分，需優(yōu)化流動(dòng)相梯度，使其達(dá)到基線分離，利用保留時(shí)間進(jìn)行定性。

MRM離子流圖如圖1所示，所有的目標(biāo)物均在11 min之前出峰，1針進(jìn)樣的儀器分析時(shí)間17 min，縮短了檢測時(shí)間。

圖1 114種藥物MRM離子疊加圖

2.3 樣品前處理方法優(yōu)化

樣品前處理是獸藥殘留分析檢測過程中耗時(shí)最長、產(chǎn)生誤差最多的環(huán)節(jié)，直接決定整個(gè)分析檢測方法的可行性和周期[11]。

涉及跨種類多殘留檢測時(shí)，液液萃取方法簡單有效[12]，缺點(diǎn)是基質(zhì)干擾比較大，難以準(zhǔn)確定量，且對(duì)色譜柱和儀器污染也較嚴(yán)重。分散固相萃取也經(jīng)常被應(yīng)用到獸藥檢測中[13-14]，但步驟較多，需要多次離心和轉(zhuǎn)移，試劑消耗量較大。試驗(yàn)通過比較，選取Oasis PRiME HLB固相萃取柱進(jìn)行樣品前處理，一步式凈化操作簡便，能夠得到較好的回收率，滿足日常分析要求。

乙腈是獸藥殘留檢測中最常用的提取溶劑，能夠提取出大多數(shù)的藥物，同時(shí)引入更少的雜質(zhì)[15]。試驗(yàn)比較純乙腈、乙腈水（80∶20和60∶40，V/V）溶液和不同的甲酸含量（0.1%，0.2%和1.0%）時(shí)的提取效果[16]。結(jié)果顯示：純乙腈不利于含水量少的樣品分散，樣品易成團(tuán)；1%甲酸沉淀效果最好，但磺胺類藥物回收率偏低，0.2%甲酸溶液作為提取溶劑時(shí)，5類藥物整體回收率較高且比較穩(wěn)定，該結(jié)果和相關(guān)研究基本一致[17]。對(duì)于不易分散的樣品，如豬肉，建議先加入水溶液，因?yàn)樗哂辛己玫臐B透性，可以較好地使樣品分散。而水相占比提高使提取液混入更多的雜質(zhì)，不利于凈化。因此選用0.2%甲酸-乙腈水（80∶20，V/V）混合溶液進(jìn)行提取。超聲有助于樣品分散和目標(biāo)物的提取。牛奶等液體樣品含水量大，直接加入0.2%甲酸乙腈溶液即可。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

動(dòng)物源性食品中大量的蛋白和脂肪等進(jìn)入提取液，凈化不完全，會(huì)影響化合物在離子源中的離子化，使化合物的響應(yīng)出現(xiàn)增強(qiáng)或抑制，出現(xiàn)基質(zhì)效應(yīng)[18]?；|(zhì)效應(yīng)影響數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，因此需要評(píng)價(jià)目標(biāo)物在不同基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)[19]。

通過基質(zhì)加標(biāo)和溶劑配標(biāo)進(jìn)行比較，結(jié)果表明，采用試驗(yàn)方法進(jìn)行處理后，依然存在基質(zhì)效應(yīng)，尤其對(duì)喹諾酮類和磺胺胍、磺胺醋酰等藥物低濃度點(diǎn)影響較大。因此，最終采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，即標(biāo)準(zhǔn)工作液加入空白基質(zhì)，和樣品一同前處理[20]。同時(shí)輔助同位素內(nèi)標(biāo)、降低上樣量等手段[15]降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量結(jié)果的影響。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 線性關(guān)系和定量限

分別在豬肉和魚肉的空白基質(zhì)中，添加一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，與空白試驗(yàn)比較，獲得10倍以上信噪比，確定此添加濃度為試驗(yàn)方法的最低定量限[21]。

將5個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白基質(zhì)，提取、凈化后，得到系列混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液，上機(jī)測定。以各目標(biāo)物的定量離子的響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程。線性系數(shù)r2均大于0.99，各化合物在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。114種獸藥的定量限、線性范圍見表2。

2.5.2 回收率與精密度

僅通過基質(zhì)配標(biāo)手段獲得的回收率，不同化合物回收率在40%～90%之間，可用作快速篩查，但定量會(huì)存在一定誤差。試驗(yàn)方法通過標(biāo)液加到陰性樣品中，和待測樣品一同進(jìn)行前處理后得到的基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線將回收率匹配到合理范圍內(nèi)[9]。

在豬肉、魚肉中分別添加定量限、2倍定量限（2 LOQ）和10倍定量限（10 LOQ）3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加水平進(jìn)行6次平行測定。114種獸藥的定量限（測定低限）為0.2～2 μg/kg，線性范圍為0.05～100 μg/kg，回收率為65.4%～114.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD，n=6）均為0.6%～12.9%，具有良好的重現(xiàn)性，具體見表2。

表2 11類藥物殘留的線性范圍、定量限、回收率范圍及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍

2.5.3 實(shí)際樣品的測定

實(shí)驗(yàn)室購買相應(yīng)萊克多巴胺質(zhì)控樣品，使用試驗(yàn)方法進(jìn)行處理和檢測，最終結(jié)果在允許范圍內(nèi)。魚肉糜中磺胺類藥物殘留能力驗(yàn)證獲得滿意結(jié)果。除豬肉、魚肉樣品，在雞蛋、牛奶、蜂蜜樣品中進(jìn)行加標(biāo)，均獲得較穩(wěn)定的回收率。對(duì)采用國標(biāo)方法檢測為陽性結(jié)果的樣品，采用試驗(yàn)方法進(jìn)行再次處理，結(jié)果基本一致。

3 結(jié)論

現(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)檢測獸藥殘留，只能進(jìn)行單一或一類獸藥的分析，缺乏通用性和時(shí)效性，不能滿足對(duì)獸藥殘留高通量分析的需求。試驗(yàn)建立同時(shí)測定動(dòng)物源性食品中磺胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類等11類114種常見獸藥殘留物的高通量篩查方法，減少繁瑣的預(yù)處理步驟，儀器分析時(shí)間縮短至17 min，節(jié)省分析時(shí)間，提高檢測效率，降低儀器成本。經(jīng)驗(yàn)證，該方法能夠用于實(shí)驗(yàn)室獸藥殘留的篩查工作，后續(xù)試驗(yàn)以期擴(kuò)充藥物種類，為實(shí)驗(yàn)室獸藥殘留檢測技術(shù)進(jìn)步提供參考。