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        密生波羅花中營養(yǎng)成分及抗氧化活性

        2021-08-15 13:54:46李偉博韓佳欣何洋周靜紀麗蓮胡衛(wèi)成
        食品工業(yè) 2021年7期
        關鍵詞:黃酮提取物自由基

        李偉博,韓佳欣,何洋,周靜,紀麗蓮,胡衛(wèi)成

        1.新疆農業(yè)大學食品科學與藥學學院(烏魯木齊 830052);2.淮陰師范學院生命科學學院,江蘇省環(huán)洪澤湖生態(tài)農業(yè)生物技術重點實驗室(淮安 223300)

        藏藥密生波羅花(Incarvillra compacta)為紫葳科角蒿屬植物,是中國特有的草本植物[1]。其主要生長于海拔在2600~4100 m的甘肅南部、青海、西藏等地,與兩頭毛和西藏羅花共同作為傳統(tǒng)藥材“歐曲”,其花、根、種子均可入藥,主要治療高血壓、月經不調、胃痛、黃疸、消化不良,具有陣痛功效[2-3]。密生波羅花主要生長于空曠石礫山坡及草灌叢中,具有很強的滋補作用,常被當地人作為一種養(yǎng)身的保健藥材來食用。

        目前為止,有關密生波羅花的研究主要集中在其化學成分及藥理活性方面。密生波羅花主要的化學成分包括單萜生物堿、環(huán)己乙醇、神經酰胺、香豆素和苯乙醇苷類等[4-5]。但目前還未見有關密生波羅花營養(yǎng)成分的報道。

        此次試驗對密生波羅花的營養(yǎng)成分和體外抗氧化活性進行基礎研究,為保護和合理開發(fā)利用我國這一民族藥用植物資源提供科學依據。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        密生波羅花,青海省西寧市藥材市場經干燥的整株花;福林酚,索萊寶公司;?唑藍(MTT),賽國生物科技;二苯基苦味酰基苯肼(DPPH)、沒食子酸、生育酚、1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+),均為分析純,SIGMA公司;槲皮素、石油醚、無水乙醇、丙酮、硫酸、氫氧化鈉、鹽酸、乙醚、氫氧化鉀、無水硫酸銅、亞硝酸鈉、硝酸鋁、無水碳酸鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵,均為分析純,國藥集團。

        1.2 儀器與設備

        BS224分析天平,北京多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;5810R臺式高速離心機,德國Eppendorf公司;DI-220/KD-310全自動凱氏定氮儀,瑞典Opsis公司;RE-3000旋轉蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠;DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱,上海精宏實驗設備有限公司;Infinite M200 Pro酶標儀,瑞士Tecan;DK-8BD電熱恒溫水槽,上海精宏試驗設備有限公司;日立L8900氨基酸分析儀,日本日立公司。

        1.3 試驗方法

        1.3.1 樣品處理

        將密生波羅花在60 ℃干燥箱中干燥4 h,經粉碎機粉碎后過1 mm篩,放至干燥處保存,備用。

        1.3.2 營養(yǎng)成分的測定方法

        總糖的測定方法參照SN/T 4260—2015[6],使用苯酚硫酸法測定;粗脂肪的測定參照GB/T 5009.6—2016[7],使用索氏提取法;粗纖維的測定參照GB 5009.10—2003[8],使用植物類粗纖維含量的測定方法;粗蛋白的測定參照GB/T 6432—2018[9],使用凱氏定氮法測定;水分的測定參照GB/T 5009.3—2016[10],使用直接干燥法測定;灰分的測定參照GB 2019.4—2016[11],使用高溫灼燒法測定;氨基酸的測定參照GB 5009.124—2016[12],使用日立L8900氨基酸分析儀測定。

        1.3.3 乙醇提取物和水提取物的制備

        精確稱取5 g密生波羅花粉末,以料液比1∶20(g/mL)的比例分別加入水和70%乙醇,在90 ℃水浴鍋中加熱3 h,過濾,旋蒸,冷凍干燥,分別獲得70%乙醇提取物和水提取物,放置干燥器中備用。

        1.3.4 黃酮的測定

        將0.3 mL 3%的NaNO2加入0.5 mL 80%乙醇,配制不同質量濃度的槲皮素標準溶液(0,25,50,100,200,300,400和500 μg/mL),混勻,避光靜置5 min,然后加入0.3 mL 10% Al(NO3)2和2 mL 4% NaOH,混勻,室溫靜置15 min后在510 nm處測其吸光度,重復3次。建立標準曲線,根據槲皮素的標準曲線,測得密生波羅花中黃酮的含量。

        1.3.5 Fe3+能力的測定

        參照景臨林等[13]方法,分別稱取10 mg密生波羅花的兩種提取物,用甲醇配制成0.25,0.5,1,1.5和2 mg/mL的溶液。分別取0.2 mL上述溶液,加入0.5 mL 0.2 mmol/L pH 6.6的磷酸鹽緩沖液和0.5 mL 1%的鐵氰化鉀,渦旋混勻,于50 ℃孵育30 min,在冰上冷卻,加入0.5 mL 10%的三氯乙酸,渦旋混勻。取0.5 mL,加入0.5 mL純水和0.1 mL 1%的三氯化鐵,渦旋混勻,各取0.2 mL加入96孔板,重復3次,以VE作為標準參照物,用酶標儀在700 nm處測定吸光度。吸光度越大表示鐵還原能力越強。

        1.3.6 DPPH自由基清除能力的測定

        參照張良等[14]方法,精確稱取7.88 mg DPPH溶于100 mL甲醇溶液中,得到0.2 mmol/L的DPPH溶液。分別取0.1 mL不同質量濃度的受試物(50,100,200,400和600 μg/mL)和0.1 mL DPPH加入96孔板中。按照上述方法,將DPPH與甲醇混合作為對照組,不同濃度的樣品液與甲醇混合作為空白組。以VE作為標準參照物,避光反應30 min,使用酶標儀在517 nm處測得吸光度。DPPH自由基清除率按式(1)計算。

        式中:A1為DPPH甲醇溶液與甲醇溶液混合后的吸光度;A2為待測液與甲醇溶液混合后的吸光度;A3為DPPH甲醇溶液與甲醇混合后的吸光度。

        1.3.7 MTT法檢測密生波羅花抗氧化應激能力

        將PC12細胞接種于DMEM培養(yǎng)基中,在37 ℃,5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取適量對數生長期的PC12細胞,以3×105接種進96孔板,待細胞長至70%~80%,分別用乙醇提取物和水提取物以不同的質量濃度(12.5,25,50和100 μg/mL)處理細胞30 min,然后加入MPP+誘導細胞24 h,加入0.05 mL 1 mg/mL的MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)2 h,吸去上清液,每孔加入0.1 mL異丙醇,振蕩10 min使紫色結晶充分溶解,在570 nm處測其吸光度。

        1.4 數據統(tǒng)計分析

        數據分析均使用Origin 8.0,SPSS 23軟件進行分析。

        2 結果與分析

        2.1 密生波羅花中的營養(yǎng)成分

        由表1可知,密生波羅花中粗脂肪為5.33±1.15 g/100 g;粗蛋白為14.36±0.28 g/100 g;粗纖維為66.01±1.8 g/100 g;粗灰分為2.3±0.14 g/100 g;粗水分為4.88±0.3 g/100 g;總糖為1.77±0.09 g/100 g。

        表1 密生波羅花中營養(yǎng)成分表

        2.2 密生波羅花中氨基酸成分和質量分數的分析

        由表2可知,密生波羅花中共含有17種氨基酸,總氨基酸質量分數為7.28%,其中必需氨基酸(EAA)共7種,質量分數為2.84 g/100 g,占總氨基酸(TAA)的39%;非必需氨基酸(NEAA)共10種,質量分數為4.442 g/100 g,占總氨基酸(TAA)的61%,EAA/NEAA為64%,均接近于FAO/WHO所推薦的EAA/TAA約為40%,EAA/NEAA約為60%的要求。

        表2 密生波羅花中氨基酸含量

        密生波羅花中藥用氨基酸共11種,質量分數為5.27 g/100 g,占總氨基酸(TAA)的72%。鮮味氨基酸共4種,質量分數為2.311 g/100 g,占總氨基酸的32%。其中谷氨酸最高,為1.044 g/10 g,占總氨基酸的14%,不僅為人類和動物提供了重要的營養(yǎng)物質,還可以和氨反應增加還原型谷胱甘肽的生成,促進抗氧化作用[16]。

        2.3 呈味氨基酸分析

        密生波羅花中呈味氨基酸分析見圖1。密生波羅花中谷氨酸和天冬氨酸總的質量分數為1.643 g/100 g,占總氨基酸的22.56%。谷氨酸呈酸性,天冬氨酸呈甜性,它們能很好地調和其他滋味,從而使藥物體現(xiàn)出微苦、微甘的口感。

        圖1 密生波羅花中呈味氨基酸分析

        2.4 密生波羅花中抗氧化活性的研究

        2.4.1 密生波羅花中總黃酮的測定

        密生波羅花總黃酮標準曲線方程為Y=0.0013X-0.0039(R2=0.9987),測得密生波羅花中總黃酮質量分數為6.78 g/100 g。

        2.4.2 乙醇提取物和水提取物的制備

        乙醇提取物和水提取物的得率如表3所示。結果表明,水提取物的得率明顯高于70%乙醇提取物的得率。

        表3 密生波羅花提取物的得率

        2.4.3 DPPH清除能力的測定[17]

        如圖2所示,在相同提取條件不同提取溶液中,當質量濃度達到600 μg/mL時,乙醇提取物和水提取物對DPPH的清除能力基本一致,略高于VE對DPPH自由基的清除能力并且隨著濃度的增加保持穩(wěn)定狀態(tài)。由此表明密生波羅花具有一定的DPPH自由基清除能力。

        圖2 密生波羅花對DPPH自由基清除率

        2.4.4 Fe3+還原能力的測定[18]

        如圖3所示,隨著密生波羅花中提取物濃度的增加,其吸光度也呈上升趨勢。當乙醇提取物為1.5 mg時,與0.4 mg的VE的還原能力相同;當水提取物為0.25 mg時,與0.05 mg的VE的還原能力相同,由此表明密生波羅花具備一定的還原能力。

        圖3 密生波羅花對Fe3+還原能力的測定

        2.4.5 密生波羅花對MPP+誘導PC12細胞氧自由基損傷修復能力測定[19]

        如圖4所示,與MPP+誘導組相比,低濃度的密生波羅花提取物處理組細胞存活率明顯升高。結果表明,密生波羅花能抑制MPP+誘導的PC12細胞損傷,具有一定的氧自由基修復能力。

        圖4 密生波羅花對MPP+誘導PC12細胞氧自由基損傷修復能力測定

        3 討論與結論

        密生波羅花中營養(yǎng)成分含量較為豐富,其中粗蛋白、粗纖維含量較高,蛋白質是一切生命的物質基礎,缺少蛋白質可導致人體免疫力下降,粗纖維可以改善腸道蠕動,有助于人體腸道的消化。氨基酸含量的測定,體現(xiàn)出藥材的質量[20],也是其營養(yǎng)價值的重要組成部分。密生波羅花中氨基酸成分比較全面,其中必須氨基酸占總氨基酸的39%,藥效氨基酸占總氨基酸的72%。呈味氨基酸所呈現(xiàn)的酸甜味,可以掩蓋其他的不良風味。

        密生波羅花中水提取物的得率大于乙醇提取物的得率,可能是因為不同的提取溶劑造成的差異。氧自由基是人體代謝的產物,可造成生物膜系統(tǒng)損傷以及細胞內氧化磷酸化障礙,與人體疾病、衰老、死亡密切相關[21]。密生波羅花具有較好的抗氧化活性,密生波羅花中乙醇提取物和水提取物對DPPH自由基的IC50分別為93.1和184.13 μg/mL,0.25 mg的水提取物還原力相當于0.05 mg VE的還原能力,1.5 mg的乙醇提取物還原能力相當于0.4 mg VE的還原能力。隨著濃度的升高,乙醇提取物的抗氧化能力高于水提取物的抗氧化能力,可能是因為乙醇提取物中黃酮的含量比較高。Chavan等[22]的研究表明,黃酮是大多數植物提取物抗氧化的物質基礎,密生波羅花中黃酮含量比較豐富,可能是其發(fā)揮抗氧化的物質基礎,具體的化合物成分需要進一步的研究。

        1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)是一種作為氧化應激的誘導劑,可引起PC12細胞氧自由基損傷[23]。密生波羅花乙醇提取物和水提取物在低濃度時表現(xiàn)出明顯的對MPP+引起的PC12細胞氧自由基損傷修復作用,但水提取物明顯高于乙醇提取物的氧自由基修復能力,可能是因為密生波羅花乙醇提取物的提取溫度過高造成的。薛長暉等[24]研究表明,提取液在提取過程中反應溫度過高會導致黃酮變質。結合抗氧化活性可以得出,密生波羅花提取物可通過兩種途徑對MPP+誘導PC12細胞造成的氧自由基損傷進行修復:一是直接清除氧自由基,減少自由基對蛋白、脂質、DNA的損傷;二是通過對細胞內抗氧化能力的改善和修復。

        此次試驗對密生波羅花中營養(yǎng)成分、氨基酸及體外抗氧化活性進行了測定,結果表明,密生波羅花中營養(yǎng)成分豐富且氨基酸種類齊全,具有很好的抗氧化活性,而抗氧化活性是保健品的重要組成部分[25]。此次試驗為密生波羅花作為天然抗氧化劑用于保健品的開發(fā)利用指明了道路。

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