楊沛，劉碧林，楊洋，趙文婷，黃渝

1.重慶化工職業(yè)學院（重慶 401120）；2.太極集團西南藥業(yè)股份有限公司（重慶 400000）

頭花蓼，又名石莽草、四季紅，屬蓼科植物。主要分布在我國的云南、貴州、四川等地，是貴州省民間著名的常用草藥之一[1-2]，具有解毒止痛、消熱利尿、活血化瘀的功效。在貴州常用頭花蓼的地上部位治療泌尿系統(tǒng)感染、濕疹、風濕、跌打損傷、腹瀉痢疾等癥狀，可謂是苗族日常生活中的必備藥[3-4]。頭花蓼的化學成分主要由揮發(fā)油、酚酸類、黃酮類化合物組成，其中，黃酮類物質(zhì)含量占比最大[5]。黃酮類化合物是一種天然的抑菌性物質(zhì)，且與動植物的親和性較高。有不少專家和學者研究黃酮類物質(zhì)的抑菌活性，陳鳳清等[6]利用超聲波輔助法從丑橘皮中提取總黃酮，并研究其對細菌和真菌的抑菌效果；王宇希[7]采用響應曲面法優(yōu)化提取丁香葉中黃酮類物質(zhì)的同時，通過體外抑菌試驗，研究黃酮類化合物對豬源性大腸桿菌的抑菌性。試驗以苗藥頭花蓼為原料，提取其中黃酮類物質(zhì)并研究其對雞脯肉的抑菌效果。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

頭花蓼（貴州威門藥業(yè)股份有限公司）；纖維素酶（河北吉捷生物科技有限公司）；無水乙醇（分析純，合肥新都化工有限公司）；石油醚（分析純，濟南廣宇化工有限公司）；蘆?。üI(yè)純，珠海祥瑞化工有限公司）；HPD-826型大孔樹脂（西安瑞利奧萊化工有限公司）；NaNO2（分析純，西安藍翔化工有限公司）；試驗菌種（北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司）。

真空干燥箱（上海舍巖儀器有限公司）；HS-100恒溫箱（青島聚創(chuàng)環(huán)保設(shè)備有限公司）；SY-BS搖床（上海錦玟儀器設(shè)備有限公司）；ZFJ-20粉碎機（江陰市正尚機械有限公司）；CSB-10B超聲波清洗器（杭州艾普儀器設(shè)備有限公司）；L3-S紫外-可見分光光度儀（浙江賽德儀器設(shè)備有限公司）；DW-ADDR10高效液相色譜儀（上海軒儀儀器設(shè)備有限公司）；IG-50紅外光譜儀（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；BM-200生物顯微鏡（北京瑞宏誠科技發(fā)展有限公司）。

1.2 頭花蓼中總黃酮的提取

將頭花蓼的莖、葉采摘下來浸泡于蒸餾水中并洗凈，通風自然曬干后于真空干燥箱中充分干燥，利用粉碎機碎成粉末。對粉末進行篩選，留取可通過0.250 mm孔徑篩子的粉末備用。

采用纖維素酶對粉末進行預處理，放入100 mL具塞錐形瓶中，加入適量乙醇作為溶劑放入搖床中充分混合2 h，放入超聲波清洗器中進行超聲提取3 h。過濾出濾渣，濾液放置于250 mL容量瓶中，用80%乙醇稀釋并定容。精確吸取10 mL容量瓶中溶液并蒸干，與水復溶后采用石油醚作為萃取劑萃取至溶液上層顯示無色時方可停止。分離除去石油醚層，取水相層即得試樣溶液。

1.3 總黃酮的測定

以蘆丁為標準品參照物，采用分光光度法測定總黃酮。將蘆丁加入乙醇中稀釋，用NaHCO3溶液調(diào)節(jié)溶液pH約9.0，加入NaNO2并經(jīng)Al(NO3)3顯色后，在510 nm波長下測定吸光度A。以蘆丁質(zhì)量濃度c為橫坐標，吸光度A為縱坐標進行線性擬合，得到回歸方程A=0.0114c-0.0235，相關(guān)系數(shù)r2=0.9994，在10～100 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)體現(xiàn)良好線性關(guān)系。吸光度與蘆丁質(zhì)量濃度的標準曲線如圖1所示。

圖1 蘆丁濃度-吸光度標準曲線

1.4 大孔樹脂純化總黃酮提取液

將HPD-826型大孔樹脂用90%乙醇浸泡1 d，充分溶脹后加入總黃酮提取液中，靜置吸附12 h。倒掉剩余的溶液，用去離子水洗凈大孔樹脂表面殘漬后浸入50%乙醇溶液中，設(shè)置搖床頻率80 r/min進行解吸6 h，測定解吸液的總黃酮。

1.5 黃酮提取物對雞脯肉的抑菌保鮮

1.5.1 菌懸浮液的制備[8-9]

將低溫下菌種接入液體培養(yǎng)基中，在搖床培養(yǎng)（40 ℃，180 r/min）下活化菌種。用接種環(huán)取少量活化菌種于無菌水中，稀釋一定倍數(shù)后用顯微鏡計數(shù)法計數(shù)，制成濃度為107CFU/mL的菌懸浮液進行備用。

1.5.2 黃酮提取物對微生物生長的抑制試驗

將雞脯肉絞碎搗爛呈糊狀后，菌懸浮液涂布于糊狀雞脯肉培養(yǎng)基表面。用浸泡在NaNO2溶液（0.005 g/mL）中直徑5 cm的濾紙片分別沾取不同濃度的黃酮提取物溶液，置于恒溫培養(yǎng)箱（40 ℃）48 h后，測定抑菌圈直徑、最小抑菌濃度、最低殺菌濃度來判定黃酮提取物對微生物的抑制生長作用。

抑菌圈大小的測定：參照文獻[10]，將圓形濾紙片放入滅菌箱中滅菌處理，分別放入不同濃度總黃酮提取液中浸泡15 min。將備用的菌懸浮液加入到規(guī)定菌種的培養(yǎng)皿表面，夾取浸泡總黃酮提取液的濾紙片于培養(yǎng)皿中。相同恒溫環(huán)境中培養(yǎng)菌種，每組試驗做3組平行試驗，培養(yǎng)48 h測量抑菌圈大小，最終結(jié)果以平均值計。

最小抑菌濃度（MIC）的測定[11]：將總黃酮提取液用無水乙醇稀釋成不同濃度的溶液，分別取不同濃度提取液于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，混合倒入相應菌種培養(yǎng)基。完全凝固后分別加入1 mL菌懸浮液，于40 ℃培養(yǎng)48 h，依據(jù)菌種生長情況判斷各試驗組最小抑菌濃度。

最低殺菌濃度（MBC）的測定[12]：無菌條件下，向培養(yǎng)皿中加入PDA培養(yǎng)基，分別吸取不同濃度的總黃酮提取液加入培養(yǎng)基中。將待測菌種均勻涂布于培養(yǎng)基表面進行培養(yǎng)，若培養(yǎng)2 d仍不長菌，試驗組中出現(xiàn)這種情況的總黃酮提取液最低濃度即為最低殺菌濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜分析

圖2為總黃酮提取液的紅外光譜分析圖。3285 cm-1為酚羥基O—H的伸縮振動吸收峰，2921 cm-1處為—CH2—的反對稱伸縮振動吸收峰，2851 cm-1處為—CH2—的對稱伸縮振動吸收峰，1614 cm-1處為C＝C結(jié)構(gòu)的伸縮振動峰，1517～1742 cm-1處為羧基和芳環(huán)骨架的伸縮振動吸收峰，1140～1300 cm-1處推測為苯酰基結(jié)構(gòu)上C—O和C—C的振動吸收峰，此結(jié)構(gòu)為黃酮所帶有的特征結(jié)構(gòu)，說明提取液中含有黃酮類物質(zhì)。

2.2 HPLC色譜分析

將經(jīng)大孔樹脂純化后的總黃酮提取液置于高效液相色譜儀中分析，結(jié)果如圖3所示。在保留時間2.2，3.8，30.7和47.1 min處分別出現(xiàn)一個吸收峰。與參考文獻[13-14]比對后，按照保留時間先后順序確定黃酮類物質(zhì)：陸地棉苷、槲皮素-3-O-2’’-沒食子?；?鼠李糖苷、槲皮素和山奈酚。總黃酮提取量超過90%，純度較高。

圖3 總黃酮的HPLC圖譜

2.3 大孔樹脂的解吸條件分析

2.3.1 乙醇體積分數(shù)對解吸過程的影響

黃酮類物質(zhì)易溶于水、乙醇等極性溶劑，選用不同體積分數(shù)乙醇作為洗脫劑并測定其解吸率，結(jié)果如圖4所示。解吸率在乙醇體積分數(shù)30%～50%內(nèi)呈增大趨勢，而在50%～80%內(nèi)呈減小趨勢。乙醇體積分數(shù)50%時解吸率最大，為76%，故確定洗脫劑體積分數(shù)為50%。

圖4 洗脫劑濃度與大孔樹脂解吸率的關(guān)系曲線

2.3.2 搖床頻率對解吸過程的影響

搖床頻率的大小決定著黃酮類物質(zhì)擺脫大孔樹脂吸附束縛的能力，進而進入乙醇溶液的概率。通常情況下，搖床頻率越大，被大孔樹脂吸附的物質(zhì)越容易溢出進入到溶液體系中。搖床頻率過大容易導致大孔樹脂與容器發(fā)生碰撞而使得大孔樹脂或容器有所受損。因此，根據(jù)圖5綜合選擇搖床頻率為80 r/min最佳。

圖5 搖床頻率與大孔樹脂解吸率的關(guān)系曲線

2.4 黃酮提取物對雞脯肉的抑菌效果

2.4.1 總黃酮提取液對不同菌種的抑菌圈直徑

以金黃色葡萄球菌、黑曲霉、大腸桿菌、枯草桿菌4種微生物為施用對象，考察不同質(zhì)量濃度的總黃酮提取物對其抑菌圈直徑大小的測定結(jié)果，如表1所示。結(jié)果表明，總黃酮提取液對4種菌種均表現(xiàn)出一定抑制作用。其中，對金黃色葡萄球菌和黑曲霉的抑制作用明顯優(yōu)于大腸桿菌和枯草桿菌，并且其中對金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強。

表1 總黃酮提取液對不同菌種抑菌圈直徑測定結(jié)果

2.4.2 總黃酮提取液的最小抑菌濃度和最低殺菌濃度

試驗中的菌懸浮液主要組成為金黃色葡萄球菌、黑曲霉、大腸桿菌和枯草桿菌，總黃酮提取液作用于試驗菌株的效果如表2所示。頭花蓼黃酮類物質(zhì)對各種菌株的抑制作用較為明顯。其抑制效果順序為金黃色葡萄球菌＞黑曲霉＞枯草桿菌＞大腸桿菌，最小抑菌濃度分別為3.40，5.30，6.20和7.30 mg/mL。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌是雞脯肉日常冷藏過程中最常出現(xiàn)的腐敗菌種，總黃酮提取液對二者的最低殺菌濃度僅4.60和7.90 mg/mL，可以預見該黃酮提取液對雞脯肉在冷藏過程中具有良好的抑菌作用。

表2 頭花蓼黃酮的最小抑菌濃度和最低殺菌濃度測定結(jié)果

3 結(jié)論

以頭花蓼為試驗原料，采用纖維素酶——超聲波提取法提取頭花蓼中的黃酮類物質(zhì)，并用大孔樹脂進行純化。紅外光譜分析表明存在苯酰基結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)為黃酮所帶有的特征結(jié)構(gòu)，說明提取液中含有黃酮類物質(zhì)。經(jīng)HPLC色譜分析表明總黃酮提取液的化學組成主要為陸地棉苷、槲皮素-3-O-2’’-沒食子?；?鼠李糖苷、槲皮素和山奈酚，且純度超過90%。對影響大孔樹脂解吸率的乙醇體積分數(shù)和搖床頻率因素進行探討，確定洗脫劑乙醇的最佳體積分數(shù)50%，搖床頻率80 r/min。將黃酮提取物應用于雞脯肉的抑菌保鮮，對雞脯肉冷藏過程中由于腐敗變質(zhì)出現(xiàn)的金黃色葡萄球菌、黑曲霉、大腸桿菌、枯草桿菌進行抑菌試驗。結(jié)果表明，黃酮提取物對金黃色葡萄球菌和黑曲霉的抑制作用明顯優(yōu)于大腸桿菌和枯草桿菌，其中對金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強，4種菌種均隨著黃酮質(zhì)量濃度增大而呈現(xiàn)抑菌圈直徑明顯減小。最小抑菌濃度分別為3.40，5.30，7.30和6.20 mg/mL，最低殺菌濃度分別為4.60，7.70，7.90和6.70 mg/mL，說明頭花蓼黃酮提取液對雞脯肉具有良好的抑菌作用。