郭紅梅，梁雎，劉志剛，李海峰，胡西旦·買買提，任紅松

新疆農(nóng)業(yè)科學院吐魯番農(nóng)業(yè)科學研究所（吐魯番 838000）

藥桑（medicine mulberry）屬薔薇目（Rosales）?？疲∕oraceae）桑屬（MorusL.）黑桑種（M.nigraL.）[1]，是新疆珍稀的藥食兼用桑樹品種資源，體細胞染色體倍數(shù)為22倍體[2]。與其他桑葉品種相比，藥桑含有更高的營養(yǎng)成分和次生物質(zhì)藥理活性[1]。桑葉綠茶是我國桑葉食品加工的主要形式，可有效保存桑葉的風味和營養(yǎng)成分[3]。其中，γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是桑葉中重要的活性成分[4]，是動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有降血壓、提高肝腎功能、抗衰老、抗疲勞、促進睡眠、治療糖尿病等作用[5-9]。同時γ-氨基丁酸是一種與逆境脅迫有關(guān)的非蛋白氨基酸，在吐魯番極端高溫干燥的脅迫下，可導致其大量生成[10]。20世紀80年代，日本開發(fā)出了高質(zhì)量分數(shù)GABA的綠茶，并將茶葉中GABA在1.5 mg/g以上稱為GABAron茶，同時具有茶葉和GABA的保健功效[11]，在日本形成了穩(wěn)定的消費群體[12]。在我國GABA茶發(fā)展迅速，具有廣泛的市場前景[12]。邊偉等[13]研究了對不同殺青方式制備高質(zhì)量分數(shù)GABA桑葉茶的影響。黃亞輝等[14]制備了達GABAron茶標準的茗豐茶，并開展臨床降壓試驗，取得了非常顯著的降壓效果。Chen等[15]利用采自臺灣的青心烏龍茶制備了高質(zhì)量分數(shù)GABA（3 mg/g）茶葉，提出此GABA茶可降低高血壓引起的心臟異常。王子瑞等[16]以大葉種茶鮮葉為主要原料，加工成γ-氨基丁酸普洱茶，GABA質(zhì)量分數(shù)達到2.5 mg/g以上。

桑葉茶加工工藝主要繼承茶葉加工工藝，難以體現(xiàn)桑葉綠茶的品質(zhì)特征，有針對性的工藝研究仍有很大空間[17-18]。孫慶磊等[19]指出鮮葉品質(zhì)（老嫩、含水量）、溫度、時間、投葉量是綠茶殺青工藝的主要影響因素。其中殺青前的鮮葉含水量由攤放階段決定。倪德江等[20]認為鮮葉攤晾的時間為5～8 h，邊偉等[13]試驗認為攤放3 h以上，內(nèi)含物質(zhì)充分水解，攤放葉的水浸出物濃度有明顯的升高。葉玉龍[21]認為生產(chǎn)中以鮮葉含水量至70%左右為攤放適度。

滾筒殺青是國內(nèi)應用最為廣泛的方式，能大規(guī)模連續(xù)機械運作，生產(chǎn)應用較多。但滾筒殺青對人工操作技術(shù)的要求很高[22]，制茶工序關(guān)鍵參數(shù)待挖掘[23]。王彬等[24]在以殺青時間為單因素的試驗中，一次大量投葉。張啟利等[25]指出6CS-40型滾筒殺青機從進葉到出葉的時間為60 s，在制茶實踐中是保證鮮葉殺青勻透的最少時間。楊秀榮[26]結(jié)合茶葉內(nèi)含物質(zhì)檢測分析與感官評審結(jié)果，認為最佳殺青條件為140 ℃，55 s。范作卿等[27]試驗總結(jié)出滾筒殺青255 ℃，30 s得到的桑葉茶DNJ濃度最高。倪德江等[20]認為滾筒殺青應在固定殺青溫度的條件下，勻速小撮投葉，使鮮葉在滾筒的翻滾、拋灑、推進中均勻地吸收熱量、蒸發(fā)水分，達到鮮葉迅速萎軟殺熟的目的。

經(jīng)厭氧處理的GABA茶因為有明顯的異味限制其推廣[12]，現(xiàn)行茶葉質(zhì)量標準常綜合桑葉活性物質(zhì)指標和感官評定的結(jié)果來評價[13,26]。為挖掘吐魯番市桑樹資源，選取吐魯番地產(chǎn)和引種栽培的主要桑樹品種為試驗材料，結(jié)合吐魯番藥桑葉品質(zhì)特點，以殺青溫度、殺青時間、鮮葉含水量和投葉量為因素，研究藥桑葉綠茶GABA的形成及茶葉感觀品質(zhì)的最優(yōu)滾筒殺青參數(shù)，旨在制備兼顧高質(zhì)量分數(shù)GABA和感觀品質(zhì)的藥桑綠茶，促進桑葉茶產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣本

藥桑鮮葉由吐魯番市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范園區(qū)提供，2019年5月采摘，選取從頂芽向下2～6片新鮮桑葉。

1.1.2 儀器與設(shè)備

6CS-40型滾筒殺青機、6CR-40型揉捻機（浙江綠峰機械有限公司）；6CCGQ-50雙鍋曲毫炒干機（浙江上洋機械有限公司）；EL-PH7.0 pH計（廈門恩萊自動化科技有限公司）；離心機Sigma3K15（德國）；TLG-01樣品粉碎機（北京天利恒誠科技有限公司）；JA1203B電子天平（上海菁海儀器有限公司）；DZKW-S-4電熱恒溫水?。ū本┦杏拦饷麽t(yī)療儀器有限公司）；UV754N紫外可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；DHG-9070電熱恒溫干燥箱（上海鴻都電子科技有限公司）；水分測定儀（上海禾工科學儀器有限公司）；比色皿、移液管、臺秤（精度g）、秒表、茶樣罐等。

1.1.3 主要試劑

硼酸、重蒸酚、三氯化鋁、GABA標準樣品，上海麥克林生化科技有限公司；丙酮，天津市致遠化學試劑有限公司；氫氧化鉀，天津永晟精細化工有限公司；甲醇，北京化工廠；乙醇，天津市北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司；所有試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 攤放工藝處理

試驗在吐魯番市高昌區(qū)室溫25～30 ℃條件下攤放，相對濕度32%～35%。鮮葉攤放厚度3～5 cm，每0.5 h翻勻一次，抖去葉片水分，于不同時段（0，1，2，3，4，5，6和7 h）取樣測定鮮葉含水量及GABA質(zhì)量分數(shù)。用隸屬函數(shù)法[28]對測定的數(shù)據(jù)進行標準化，消除不同指標間量綱差異。

式中：Xij為第i個樣品第j個指標的檢測值；Xmax和Xmin分別為第j項指標的最大值和最小值；Yij為經(jīng)轉(zhuǎn)化后的隸屬函數(shù)值；將各指標的隸屬函數(shù)值作為原始值進行綜合評價。綜合GABA質(zhì)量分數(shù)和鮮葉含水量的隸屬函數(shù)值計算綜合評分。權(quán)重分配GABA質(zhì)量分數(shù)占0.5，含水量占0.5。

1.2.2 殺青工藝處理

1.2.2.1 殺青標準的及各因素水平的確定

以殺青葉葉色暗綠、青草氣消失而具有香氣、葉脈折而不斷、葉質(zhì)柔軟、緊握成團及松手散開為感官品質(zhì)依據(jù)，考察不同殺青條件下的各因素水平。在殺青時間單因素試驗中，將1.2.1小節(jié)優(yōu)化處理之后的材料稱取5 kg一次性投葉，考察在固定溫度下不同處理時間的殺青質(zhì)量。采用二次殺青的方法延長殺青時間，在達到考察的殺青時間時改變滾筒傾角提前出葉。在殺青溫度和投葉量單因素試驗中，采用均速小撮的方式投葉，達到殺青勻透的目的。

1.2.2.2 殺青工藝對藥桑葉綠茶GABA質(zhì)量分數(shù)影響的單因素試驗

將1.2.1小節(jié)優(yōu)化處理之后的材料混勻進行滾筒殺青處理。得到殺青工藝處理參數(shù)：殺青溫度（固定條件：投葉量36 kg/h，殺青時間160 s）230，240，250，260和270 ℃；殺青時間（固定條件：殺青溫度240 ℃，投葉量36 kg/h）100，130，160，190和220 s；投葉量（固定條件：殺青時間160 s，殺青溫度240℃）24，30，36，42和48 kg/h。殺青結(jié)束后按綠茶標準工藝加工成茶，對試驗樣品進行感觀評審和GABA質(zhì)量分數(shù)測定。用1.2.1 小節(jié)中的隸屬函數(shù)法對測定的數(shù)據(jù)進行標準化，綜合GABA質(zhì)量分數(shù)和感官評分的隸屬函數(shù)值計算綜合評分。權(quán)重分配GABA質(zhì)量分數(shù)占0.5，感官評分占0.5。

1.2.2.3 響應面試驗

通過單因素試驗，確定響應面試驗設(shè)計的因素和水平。采用中心組合試驗Box-Behnken試驗設(shè)計，選取3個主要影響因子的水平為自變量，以其藥桑葉綠茶綜合評分為響應值，采用三因素三水平的響應面法設(shè)計試驗，得出藥桑葉綠茶的最優(yōu)殺青工藝，并驗證模型預測的有效性。響應面試驗因素及水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平及編碼

1.2.3 檢測方法

1.2.3.1 GABA質(zhì)量分數(shù)

γ-氨基丁酸質(zhì)量分數(shù)采用夏玉玲等[29]的方法。

1.2.3.2 感官評分

感官品質(zhì)評定按照GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》[30]的要求進行，評價藥桑葉茶的感官品質(zhì)。由10位鑒評專業(yè)人員組成鑒評小組，分別稱取3 g藥桑葉茶，加入150 mL沸水沖泡4 min，倒出茶湯，依次評審藥桑葉茶的干茶外形、湯色、香氣、滋味、葉底。各項目以100分計，總分參照茶葉審評加權(quán)法計算，按照外形25%、香氣25%、湯色10%、滋味30%、葉底10%、計算總分，取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理和圖表繪制使用Microsoft Excel 2010與Design-Expert.V 8.0.6.1，方差分析使用SPSS 19.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 攤晾時間對藥桑葉綠茶綜合評分的影響

由圖1可以看出，攤晾時間小于3 h，綜合評分隨著攤晾時間的增加而逐漸升高；大于3 h時，綜合評分隨著攤晾時間的增加而逐漸降低。主要是由于當攤晾時間較短時，葉片內(nèi)含物質(zhì)水解不充分。葉片含水量高，殺青葉具有水悶氣，從而影響殺青葉質(zhì)量。當攤晾時間超過3 h時，葉片大量失水，以致殺青葉葉緣干枯卷曲，造成后期揉捻中葉片斷碎，成型困難。因此，選擇攤晾時間3 h為適宜的條件。

圖1 攤晾時間對藥桑綠茶綜合評分的影響

2.1.2 殺青溫度對藥桑葉綠茶綜合評分的影響

由圖2可知，當殺青投葉量和殺青時間為定值（36 kg/h，160 s）時，綜合評分隨著殺青溫度的增加而增大。當殺青溫度為240 ℃時，綜合評分出現(xiàn)最大值，隨后繼續(xù)提高殺青溫度，綜合評分逐漸降低。這是因為殺青溫度在230～270 ℃范圍內(nèi)，隨著殺青溫度的升高，葉片感觀品質(zhì)得到提高，茶湯更加鮮醇濃郁，香氣顯露。當殺青溫度超過260 ℃時，殺青葉略顯硬脆，感觀綜合評分開始下降。隨著殺青溫度的升高，內(nèi)含物質(zhì)GABA逐漸降低。因此，選取殺青溫度230，240和250 ℃ 3個水平進行響應面試驗。

圖2 殺青溫度對藥桑綠茶綜合評分的影響

2.1.3 殺青時間對藥桑葉綠茶綜合評分的影響

由圖3可知，當殺青溫度和投葉量為定值（240℃，36 kg/h）時，綜合評分隨著殺青時間的延長而增大。當殺青時間為160 s時，綜合評分出現(xiàn)最大值，隨后繼續(xù)延長殺青時間，綜合評分呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。這是因為隨著殺青時間的延長，殺青更加充分，殺青葉萎軟暗綠，感觀潤澤，香氣高強。感官評分也隨之提高，當殺青時間超過為190 s時，殺青葉含水量過低，感觀評分逐漸降低。隨著殺青時間的延長，內(nèi)含物質(zhì)GABA的質(zhì)量分數(shù)先升高后逐漸降低。當殺青時間為160 s時，GABA質(zhì)量分數(shù)達到峰值。因此，選取殺青時間130，160和190 s 3個水平進行響應面試驗。

圖3 殺青時間對藥桑綠茶綜合評分的影響

2.1.4 投葉量對藥桑葉綠茶綜合評分的影響

由圖4可知，當殺青溫度和殺青時間為定值（240℃，160 s）時，綜合評分隨著投葉量的增大而提高。當投葉量為36 kg/h時，綜合評分出現(xiàn)最大值，隨后繼續(xù)增大投葉量，綜合評分呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。這是因為隨著投葉量的增加，殺青葉青綠色消失，葉片柔軟有清香。當投葉量超過42 kg/h后，葉片出現(xiàn)花雜，熟葉中夾雜青綠葉，殺青不均不透，感觀評分也隨之降低。隨著投葉量的升高，內(nèi)含物質(zhì)GABA的質(zhì)量分數(shù)先升高后逐漸降低，當投葉量為36 kg/h時，GABA質(zhì)量分數(shù)達到峰值。因此，選取投葉量30，36和42 kg/h 3個水平進行響應面試驗。

圖4 投葉量對藥桑葉綠茶綜合評分的影響

2.2 藥桑葉綜合評分響應面法試驗

2.2.1 藥桑葉綜合評分擬回歸模型的建立

按照中心組合設(shè)計試驗方案進行三因素三水平試驗，試驗結(jié)果見表2。將所得的試驗數(shù)據(jù)采用Design-Expert軟件進行多元回歸擬合，得到以GABA為目標函數(shù)的二次回歸方程：Y=0.87-0.054A+5×10-3B+6.25×10-3C+0.015AB-2.5×10-3AC+0.09BC-0.08A2-0.053B2-0.13C2。

表2 響應面法試驗設(shè)計與結(jié)果

2.2.2 試驗結(jié)果的方差顯著性分析

由表3可以看出，回歸模型方差分析表明回歸模型顯著（p＜0.01），回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗結(jié)果R2為0.9977，說明此模型與數(shù)據(jù)擬合度很高。方差分析表中失擬p值為0.6507，大于0.05，說明此模型可以充分解釋響應中的變異，模型擬合度很高，試驗誤差小。可以用此模型對滾筒殺青制取藥桑葉綠茶的綜合評分進行分析和預測。

表3 回歸模型方差分析

在該模型中，模型項F值為339.48，說明該模型是有意義的。由表3數(shù)據(jù)可知，在一次項中A（殺青溫度）為顯著，在交互項中AB和BC存在顯著交互作用，在二次項中A（殺青溫度）、B（殺青時間）和C（投葉量）的二次項表現(xiàn)為極顯著，表明殺青溫度、殺青時間和投葉量之間的相互作用對綜合評分有一定影響，交互作用顯著。由F檢驗結(jié)果的顯著性分析可知，各因素對反應的貢獻率，影響顯著性由大到小依次為A＞C＞B，即殺青溫度＞投葉量＞殺青時間。

2.2.3 響應曲面分析

殺青溫度、殺青時間、投葉量及其交互作用對響應值的影響如圖5～圖7所示。

圖5 殺青溫度和殺青時間對綜合評分影響的等高線與響應面圖

圖6 殺青溫度和投葉量對綜合評分影響的等高線與響應面圖

圖7 殺青時間和投葉量對綜合評分影響的等高線與響應面圖

由圖5可以看出，當投葉量一定時，藥桑葉綠茶的感官評分隨殺青溫度的升高和殺青時間的增加先升高后降低。由圖6可以看出，當殺青時間一定時，隨著另外兩個因素的變化，藥桑葉綠茶感官評分呈現(xiàn)先不斷增加后下降的趨勢。由圖7可以看出，當殺青溫度一定時，藥桑葉綠茶的感官評分隨殺青時間和投葉量的增加呈現(xiàn)升高后降低的趨勢。

運用Design-Expert 8.0.5軟件對試驗結(jié)果進行優(yōu)化分析，滾筒殺青制取高質(zhì)量分數(shù)GABA藥桑葉綠茶的最佳條件為殺青溫度236.65 ℃、殺青時間145.49 s、投葉量33.11 kg/h。在此條件下預測的感官評分為0.88。為檢驗響應面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件進行重復試驗，根據(jù)實際生產(chǎn)條件，將工藝條件修正為殺青溫度240 ℃、殺青時間145 s、投葉量33 kg/h。在最佳工藝下制備的藥桑葉綠茶湯色黃亮，滋味鮮醇，清新宜人。綜合評分實際值為0.89分GABA質(zhì)量分數(shù)達4.2 mg/g，比加工前的3.3 mg/g增加了27.27%，達到了高質(zhì)量分數(shù)GABA綠茶的標準，具有一定的保健作用。

3 結(jié)論

通過單因素試驗和應用Box-Behnken試驗設(shè)計和響應面分析法建立的二次回歸模型，對數(shù)據(jù)進行分析，得出高質(zhì)量分數(shù)藥桑葉綠茶殺青的最佳工藝條件：殺青溫度240 ℃、殺青時間145 s、投葉量33 kg/h。試驗結(jié)合茶葉GABA質(zhì)量分數(shù)檢測分析與感官評審結(jié)果，研究了影響桑葉綠茶GABA的質(zhì)量分數(shù)茶葉感觀品質(zhì)的加工參數(shù)，制備了兼顧高GABA質(zhì)量分數(shù)和感觀品質(zhì)的桑葉綠茶，為藥桑葉綠茶的實際生產(chǎn)提供了一定的依據(jù)。