賀瑩，武宇詩

呂梁學(xué)院生命科學(xué)系（呂梁 033000）

木棗，屬于大棗的一種，主要集中分布在中國的北方地區(qū)，是山西、陜西的主要栽培品種。其中，呂梁大棗頗為出名，年產(chǎn)量大，棗果大而色彩斑斕，厚實(shí)柔軟，性溫，富含營養(yǎng)成分和生物活性成分，屬于天然保健產(chǎn)品中的一種保健食品，可食用也可藥用，具有極高的利用價(jià)值，深受廣大群眾的喜愛[1]。酵素，也可以叫作是“酶”，酵素是用各種同種或者不同的動(dòng)植物材料作為原料，應(yīng)用不同的微生物，在特定的條件下進(jìn)行發(fā)酵工藝，所產(chǎn)生的具有一定生物活性的物質(zhì)。它的這些活性都是通過選取的原材料，微生物營養(yǎng)物質(zhì)，還有一些經(jīng)過發(fā)酵的過程中所產(chǎn)生的。植物酵素具有潤腸通便[2]、解酒保肝[3]等功效。我國關(guān)于酵素產(chǎn)品的研究尚處于初級(jí)階段，市場(chǎng)發(fā)展也才剛剛起步。

以木棗為原料，選用酵母菌和植物乳桿菌作為菌種，制備木棗酵素。選取不同的發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量、菌種比例等因素設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，以超氧化物歧化（SOD）酶活力的大小為指標(biāo)，進(jìn)行分析研究，以期提高木棗的加工利用率和酵素產(chǎn)品的多樣性，同時(shí)對(duì)果蔬酵素產(chǎn)品的研究提供可行的技術(shù)指導(dǎo)和理論依據(jù)[4-5]。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料及藥品

木棗：太原萬果山電子商務(wù)有限公司；安琪牌活性干酵母，購于河南萬邦實(shí)業(yè)公司；植物乳桿菌，購于河南萬邦實(shí)業(yè)公司；果膠酶，購于浙江仁和生物科技有限公司；酵母膏粉，購于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.1.2 儀器與設(shè)備

DFT-100手提式高速中藥粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；RE-5298旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；GZX-9146MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；CPA225D電子天平：溫賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；SPX-250生化培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 木棗酵素工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

1) 預(yù)處理：將木棗清洗干凈去核，置于干燥箱中調(diào)整溫度為80 ℃，干燥3 h后用粉碎機(jī)粉碎并過篩。按1∶5（g/mL）的比例加入蒸餾水得到木棗汁。

2) 酶解：在處理后的木棗汁中加入果膠酶，果膠酶的用量2 mL/kg，然后放在電熱恒溫水浴鍋中45 ℃酶解2 h。

3) 調(diào)配：取出手持糖度儀在室溫條件下，先用蒸餾水調(diào)整刻度，在木棗果汁中少量多次地添加蔗糖，將糖度調(diào)整為20%。

4) 菌種活化：在錐形瓶中加入適量的活性干酵母，加入一些蒸餾水，放在提前預(yù)熱好的水浴鍋中水浴加熱；配制MRS肉湯培養(yǎng)基，加入植物乳桿菌并在37 ℃條件下進(jìn)行活化48 h。

5) 殺菌：將木棗果汁在70 ℃條件下保持30 min進(jìn)行巴氏殺菌，最后冷卻至室溫。

6) 接種：將活化好的酵母菌、植物乳桿菌按試驗(yàn)的比例接入殺菌后的木棗果汁中，備用。

7) 發(fā)酵：調(diào)整接種的木棗果汁的溫度和時(shí)間，靜置發(fā)酵，得到木棗酵素，測(cè)定SOD酶活力的大小[6]。

1.2.2 SOD酶活力的測(cè)定

SOD酶活力的測(cè)定[7]：在25 ℃條件下在試管中加入0.2 mL稀釋的樣液，然后依次將2.5 mL濃度為0.1 mol/L的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖溶液（pH為8.2，內(nèi)含1 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉）、2 mL蒸餾水、0.15 mL 4.5 mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻后立即倒入石英比色皿中，在波長325 nm條件下分別測(cè)定初始時(shí)和1 min后的吸光度值，二者之差則為A1，空白比色皿用10 mmol/L鹽酸調(diào)零，同樣地用蒸餾水代替樣液測(cè)定吸光度A0，SOD酶活性按式（1）計(jì)算。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

1.2.3.1 發(fā)酵時(shí)間的選擇

固定糖度20%，加入植物乳桿菌4%，在38 ℃條件下，在不同發(fā)酵時(shí)間（1，2，3，4和5 d）發(fā)酵后，測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活力的大小[8]。

1.2.3.2 發(fā)酵溫度的選擇

固定糖度20%，加入植物乳桿菌4%，發(fā)酵2 d，在不同發(fā)酵溫度（34，36，38，40和42 ℃）發(fā)酵后，測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活力的大小[9]。

1.2.3.3 菌種比例的選擇

固定糖度20%，在38 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵2 d，在不同菌種比例（1∶3，2∶3，1∶1，3∶2和3∶1）發(fā)酵后，測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活力的大小[10]。

1.2.3.4 接種量的選擇

固定糖度20%，在38 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵2 d，在不同接種量（2%，4%，6%，8%和10%）發(fā)酵后，測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活力的大小[11]。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，將發(fā)酵時(shí)間（A）、發(fā)酵溫度（B）、接種量（C）三個(gè)因素作為響應(yīng)面試驗(yàn)的考察對(duì)象，以超氧化物歧化酶（SOD）活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)[12]，設(shè)計(jì)三因素三水平的Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)，探索木棗果蔬酵素發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)。試驗(yàn)因素、水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)SOD酶活力的影響

由圖1可知，SOD酶活力隨著發(fā)酵時(shí)間的變化而變化，剛開始酶活力明顯上升，持續(xù)發(fā)酵到第2天時(shí)酶活力為277.89 U/mL，到達(dá)第3天的時(shí)候，酶活力明顯下降，第4天比第3天稍有下降，其原因是發(fā)酵后期總酸不斷上升，菌體處于衰亡期，消耗大量的營養(yǎng)物質(zhì)，抑制了SOD酶的積累，導(dǎo)致酶活力呈下降的趨勢(shì)，所以選擇發(fā)酵時(shí)間是2 d較佳。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)超氧化物歧化酶活力的影響

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)SOD酶活力的影響

由圖2可知，SOD酶活力隨著溫度的變化而變化，34～38 ℃ SOD酶活力明顯上升，當(dāng)溫度達(dá)到38 ℃時(shí)，顯示出SOD酶活力為277.47 U/mL，溫度高于38 ℃或低于38 ℃時(shí)，不利于植物乳桿菌的生長，從而影響SOD酶活力的大小，所以選擇發(fā)酵溫度為38 ℃較佳。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)超氧化物歧化酶活力的影響

2.1.3 菌種比例對(duì)SOD酶活力的影響

由圖3可知，當(dāng)菌種比例為1∶3和2∶3時(shí)，SOD酶活力隨著酵母菌比例的增大呈逐漸上升趨勢(shì)，當(dāng)菌種比例為2∶3時(shí)，SOD酶活力的最大值為275.81 U/mL。當(dāng)菌種比例為3∶2和3∶1時(shí)，SOD酶活力隨著植物乳桿菌比例的下降呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)，總體看來酶活力的大小變化比較平穩(wěn)，所以不選菌種比例為響應(yīng)面法試驗(yàn)的因素。

圖3 菌種比例對(duì)超氧化物歧化酶活力的影響

2.1.4 接種量對(duì)SOD酶活力的影響

由圖4可知，酶活力隨著接種量的增大先逐漸升高，達(dá)到SOD酶活力最大值276.85 U/mL。繼續(xù)增加接種量時(shí)，因?yàn)榻臃N量太大，導(dǎo)致SOD酶活力稍有下降趨勢(shì)，所以選擇接種量為4%較佳。

圖4 接種量對(duì)超氧化物歧化酶活力的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

從單因素試驗(yàn)結(jié)果的分析中，選取發(fā)酵時(shí)間（A）、發(fā)酵溫度（B）、植物乳桿菌接種量（C）為考察因素，根據(jù)響應(yīng)面分析法中心組合設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，木棗果素酵素發(fā)酵工藝優(yōu)化的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.2 回歸模型的建立

對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用Design Expert 7.0軟件進(jìn)行多元回歸分析，得到SOD酶活力大小與發(fā)酵時(shí)間（A）、發(fā)酵溫度（B）、植物乳桿菌接種量（C）的二次回歸模型為：

式中，各項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值的大小表示各影響因素對(duì)超氧化物歧化酶（SOD）活力的影響大小，系數(shù)的正負(fù)表示該因素影響的方向，各因素對(duì)超氧化物歧化酶（SOD）活力的影響由大到小依次為A＞C＞B。

根據(jù)表3可以看出，模型p=0.0001＜0.01，由此可以得出該模型具有極顯著性，說明選取因素不同，超氧化物歧化酶（SOD）活力有顯著差異；失擬項(xiàng)p=0.4086＞0.05，說明在試驗(yàn)選取的因素水平范圍內(nèi)，擬合程度較好，說明這個(gè)模型是可靠的，可用來分析和預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。從表3可以看出，在試驗(yàn)選取的這三個(gè)因素水平范圍內(nèi)，A、C影響極顯著（p＜0.01），B影響顯著（p＜0.05），二次項(xiàng)A2、B2對(duì)模型影響極顯著，C2對(duì)模型影響顯著。

表3 回歸模型方差分析

2.2.3 響應(yīng)曲面分析

根據(jù)響應(yīng)曲面坡度的彎曲程度來體現(xiàn)SOD酶活力影響程度的大小。如果響應(yīng)曲面相對(duì)平緩，說明其可容忍處理?xiàng)l件的影響[10]。等高線圖的形狀可以表示各變量之間的交互作用是否顯著，橢圓狀表明變量間的交互作用顯著，圓形狀表明交互作用不顯著[11]。圖5～圖7反映出發(fā)酵時(shí)間、溫度、接種量對(duì)超氧化物歧化酶（SOD）活力大小的影響。

圖5 發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度交互作用的響應(yīng)面與等高線

圖6 發(fā)酵時(shí)間和接種量交互作用的響應(yīng)面與等高線

圖7 發(fā)酵溫度和接種量交互作用的響應(yīng)面與等高線

由圖5可知，發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度對(duì)SOD酶活力的影響，呈現(xiàn)先上升后下降走勢(shì)。從圖6可以看出，在不斷發(fā)酵的同時(shí)加入越來越多的菌，SOD酶活力先上升后下降呈現(xiàn)弧狀。通過對(duì)圖7研究可以看出，在發(fā)酵溫度和接種量的不斷增大的情況下，SOD酶活力同樣出現(xiàn)先上升后下降的走向。由此可知，各因素之間交互作用的影響與單因素影響不一致，各因素間交互作用對(duì)響應(yīng)值影響顯著。

2.2.4 最佳提取條件驗(yàn)證

對(duì)制備工藝進(jìn)行優(yōu)化時(shí)運(yùn)用Design-Expert 7.0軟件，分析可得出發(fā)酵時(shí)間2 d、發(fā)酵溫度38 ℃、接種量4%是木棗酵素發(fā)酵工藝的最佳條件，在這種情況下SOD酶活力大小為278.64 U/mL。并經(jīng)過3次平行試驗(yàn)，得到的SOD酶活力為278.41 U/mL。因此，可以得出通過響應(yīng)面優(yōu)化得到的回歸方程模型及最佳制備工藝是可靠的。

3 結(jié)論

試驗(yàn)通過采用木棗為原料，發(fā)酵菌種選用酵母菌和植物乳桿菌來制備木棗酵素。通過設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，選取不同的發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量，測(cè)定酶活力得到各因素對(duì)超氧化物歧化酶（SOD）活力的影響趨勢(shì)圖，在此基礎(chǔ)上通過三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，全面且直觀地分析了各因素對(duì)SOD酶活力的影響，以及各因素之間的交互作用，建立回歸模型，經(jīng)過驗(yàn)證試驗(yàn)之后說明木棗果蔬酵素的模型非?？孔V，可得出影響SOD酶活力的主要因素是發(fā)酵時(shí)間和植物乳桿菌的接種量。木棗酵素發(fā)酵工藝優(yōu)化的最佳條件為發(fā)酵時(shí)間2 d、發(fā)酵溫度38 ℃、植物乳桿菌接種量4%。在此優(yōu)化條件下，經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，超氧化物歧化酶（SOD）活力為278.64 U/mL。此次試驗(yàn)得到的最佳工藝條件為木棗果蔬酵素發(fā)酵工藝的生產(chǎn)提供理論研究和科學(xué)依據(jù)，為酵素產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用提供有效利用和參考價(jià)值。