王凱，黃鈺，陳禹锜，伍雅勵，趙文梅，李楠

廣西大學生命科學與技術學院（南寧 530004）

麥芽為禾本科植物大麥果實發(fā)芽干燥后的加工制品[1]，含有豐富的酶類、多糖類生物物質(zhì)及大量營養(yǎng)物質(zhì)[2]，經(jīng)常食用可益氣開胃，具有保健功效[3]。麥芽由于大麥產(chǎn)地較多，產(chǎn)量較佳，被廣泛用于食品[4]及醫(yī)藥[5]等行業(yè)。小麥胚芽作為加工的副產(chǎn)品，通常被人為拋棄，不能得到充分利用，其本身營養(yǎng)豐富[6]，經(jīng)常食用可增強體質(zhì)。Aksoz等[7]使用高效液相色譜（HPLC）對小麥胚芽油進行分析，結(jié)果表明其α-生育酚濃度極高。小麥胚芽也被應用于抗氧化肽制備[8]、餅干制作[9]、胚芽糊加工[10]、納豆制作[11]及飲料制作[12-14]等方面。國內(nèi)外對麥芽-麥胚芽酒的研究尚未報道，故以麥芽-麥胚芽酒為主要研究對象，從3種酶澄清劑中篩選酸性蛋白酶作為最佳澄清劑，對其澄清工藝進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥芽、麥胚芽（山東淄博瑞源生物科技有限公司）；麥芽-麥胚芽酒（實驗室自釀）；酒曲（南寧一明生物科技有限公司）；果膠酶、酸性蛋白酶、木瓜酶（南寧龐博生物工程有限公司）。

1.2 儀器與設備

SN510C全自動高壓滅菌鍋（重慶雅瑪拓科技有限公司）；SHP-250生化培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設備有限公司）；JJ-2組織搗碎機（常州迅生儀器有限公司）；YP201N電子天平（上海菁華科技儀器有限公司）；PL-303分析天平（METTLER TOLEDO有限公司）；恒溫水浴鍋（重慶雅馬拓科技有限公司）；UVmini-1240紫外-可見分光光度計[島津儀器（蘇州）有限公司]。

1.3 試驗方法

1.3.1 麥芽-麥胚芽酒的釀造工藝

精選麥芽→組織搗碎機粉碎→加入麥胚芽（麥芽與麥胚芽質(zhì)量比3.5∶1）→加水混勻（料液體積比1∶3）→65 ℃糖化→取上清→高溫滅菌→接種酒曲→28℃發(fā)酵7 d→酒渣分離→澄清過濾→原酒→殺菌灌裝→成品

1.3.2 最佳酶澄清劑篩選[15]

選用木瓜酶、酸性蛋白酶、果膠酶3種酶澄清劑，分別將3種酶按照0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 g/L質(zhì)量濃度加入到麥芽-麥胚芽酒中，在50 ℃水浴條件下澄清6 h后取出，室溫靜置2 d后于波長750 nm測定透光率。

1.3.3 單因素澄清試驗

酸性蛋白酶添加量對澄清效果的影響：將酸性蛋白酶按照0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 g/L質(zhì)量濃度加入到麥芽-麥胚芽發(fā)酵酒中，充分搖勻，在50 ℃水浴條件下澄清6 h后取出，室溫靜置2 d后按上述方法測定透光率。

澄清時間對澄清效果的影響：將酸性蛋白酶按照0.8 g/L質(zhì)量濃度加入到麥芽-麥胚芽酒中，充分搖勻，在50 ℃水浴條件下分別澄清0，3，6，9，12和15 h后取出，室溫靜置2 d后按上述方法測定透光率。

澄清溫度對澄清效果的影響：將酸性蛋白酶按照0.8 g/L質(zhì)量濃度加入到麥芽-麥胚芽發(fā)酵酒中，充分搖勻，分別設置水浴溫度35，40，45，50，55和60℃，澄清6 h后取出，室溫靜置2 d后按上述方法測定透光率。

1.3.4 響應面試驗設計優(yōu)化澄清工藝

在單因素試驗基礎上，采用響應面方法優(yōu)化澄清工藝，以酸性蛋白酶添加量（A）、澄清時間（B）、澄清溫度（C）3個因素為自變量，以透光率（Y）為響應值，根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，設計三因素三水平試驗進行優(yōu)化，進行響應面分析，并驗證結(jié)果的可靠程度。響應面因素與水平見表1。

表1 澄清工藝優(yōu)化Box-Benhnken試驗設計因素與水平

1.3.5 數(shù)據(jù)處理與分析

所得數(shù)據(jù)通過Origin 2017版繪圖軟件進行展示；響應面法采用Design-Expert V 8.0.6軟件進行設計，并進行數(shù)據(jù)分析；采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行方差分析和顯著性檢驗（p＜0.05）。

1.3.6 理化指標測定

酒精度，采用酒精計法測定[16]；還原糖含量，采用DNS法測定[17]；蛋白質(zhì)含量：采用考馬斯亮藍法測定[18]；總酚含量，采用福林-肖卡法測定[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳酶澄清劑篩選

由圖1可知，在相同添加量、相同澄清溫度、相同澄清時間情況下，木瓜酶與果膠酶對麥芽-麥胚芽酒澄清效果不佳，最大透光率僅50%～60%，酸性蛋白酶對麥芽-麥胚芽酒的澄清效果要優(yōu)于木瓜酶和果膠酶，可達80%以上，故選用酸性蛋白酶作為最佳酶澄清劑。

圖1 不同酶澄清劑澄清效果對照

2.2 單因素澄清試驗

2.2.1 酸性蛋白酶添加量對澄清效果的影響

由圖2可知，隨著酸性蛋白酶逐漸增加，透光率呈現(xiàn)出逐漸增長趨勢，透光率在0～0.6 g/L添加量范圍內(nèi)急速增長，這是由于酶的添加可加速分解酒中大分子物質(zhì)；透光率在0.6～1.0 g/L添加量范圍內(nèi)增長速度變緩，這是因大分子物質(zhì)逐漸減少而酶逐漸過量所引起的。透光率在酶添加量1.0 g/L時達到最大，為80.9%。

圖2 酸性蛋白酶添加量與澄清效果的關系

2.2.2 澄清時間對澄清效果的影響

由圖3可知，隨著澄清時間增加，透光率呈現(xiàn)出先上升后下降趨勢。澄清時間在0～3 h范圍內(nèi)透光率呈現(xiàn)急速上升趨勢，這是由酶的添加所引起的；澄清時間在3～12 h范圍內(nèi)透光率曲折增長，并在澄清時間12 h時達到最大透光率85.2%。隨后透光率略微降低，這與沉淀的結(jié)實緊密度有關，沉淀緊密度差隨靜置時間延長而產(chǎn)生重新分散現(xiàn)象，從而導致透光率下降。這就要求在生產(chǎn)過程中應盡快將產(chǎn)生沉淀的上清液分離。

圖3 澄清時間與澄清效果的關系

2.2.3 澄清溫度對澄清效果的影響

由圖4可知，隨著澄清溫度升高，透光率呈現(xiàn)先增大后減小趨勢。澄清溫度在35～55 ℃范圍內(nèi)透光率逐漸增加，并澄清溫度55 ℃時透光率達到最大，可達87.9%。隨后透光率略微降低，這是因為酸性蛋白酶的最適溫度55 ℃，高于最適溫度時，高溫會導致蛋白酶的變性失活，影響催化能力，從而影響透光率。

圖4 澄清溫度與澄清效果的關系

2.3 發(fā)酵酒澄清工藝響應面優(yōu)化

2.3.1 響應面模型的建立及分析

在單因素試驗所得數(shù)據(jù)基礎上，進行Box-Behnken試驗設計，以酸性蛋白酶添加量（A）、澄清時間（B）、澄清溫度（C）3個因素為自變量，以透光率（Y）為響應值，應用Design-Expert V 8.0.6軟件對試驗所得數(shù)據(jù)進行回歸擬合及分析。利用軟件對試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，所得自變量與透光率的二次多項回歸方程為Y=84.28+3.69A-0.14B+0.100C-0.83AB-0.20AC-0.80BC-0.48A2+1.37B2+0.70C2。

所得響應面優(yōu)化試驗方案及結(jié)果如表2所示，模型分析如表3所示。

表2 響應面試驗設計與結(jié)果

由表3可知，模型p=0.0228＜0.05，達到顯著水平，表明響應面試驗所得模型可靠，擬合良好，可用于后續(xù)優(yōu)化。失擬項p=0.6912＞0.05，顯著水平為不顯著，表明方程擬合良好，未出現(xiàn)失擬現(xiàn)象，試驗方法可靠性高。因素A的p值=0.0004＜0.01，表明酸性蛋白酶添加量對于麥芽-麥胚芽酒的澄清效果極顯著；因素B、C的p值均大于0.05，表明澄清時間與澄清溫度對于麥芽-麥胚芽酒的澄清效果不顯著；交互項AB、AC、BC，以及A2、B2、C2的p值均大于0.05，表明上述因素對于麥芽-麥胚芽酒的澄清效果不顯著，且酸性蛋白酶添加量、澄清時間、澄清溫度之間的交互作用較弱。由F值可知因素A＞B＞C，表明所選取的3個因素對于酒體澄清效果的影響順序為酸性蛋白酶添加量＞澄清時間＞澄清溫度。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果

由表4可知，擬合度R2=0.8652，校正擬合度Radj2=0.6918，兩者數(shù)據(jù)較接近，表明所建立模型與實際試驗擬合較好，準確性較高；變異系數(shù)C.V.=1.97%＜5.0%，表明方程可重現(xiàn)性較好[20]；信噪比=7.265＞4，表明模型可信度較高，試驗精密度較高。綜上所述，可利用該模型進行分析各因素變化對響應值的影響，并預測其變化規(guī)律。

表4 方差相關系數(shù)

2.3.2 各因素交互作用分析

響應面圖等高線橢圓形越明顯，表明各因素間交互作用越強，反之則越弱。各因素交互作用如圖5所示。

圖5 各因素交互作用對麥芽-麥胚芽酒透光率影響的響應曲面及等高線

AB、AC、BC的響應曲面圖等高線均不是橢圓形，表明各因素交互作用不強，這與表3方差分析結(jié)果一致。

2.3.3 澄清效果驗證

通過Design-Expert V 8.0.6軟件所得到的回歸模型，預測的麥芽-麥胚芽酒澄清條件理論最佳值為酸性蛋白酶添加量1.2 g/L、澄清時間9 h、澄清溫度60 ℃。預測最佳透光率為91.2225%，其可行性達到0.557，結(jié)果如圖6所示。

圖6 預測條件可行性

按照試驗條件進行模擬，麥芽-麥胚芽酒的實際透光率為90.1%，與理論預測值91.2225%相差較小，可以采用。因此，響應面法優(yōu)化澄清工藝結(jié)果置信度較高，實際可行性較強。

2.3.4 理化性質(zhì)測定

澄清劑的添加雖然降低了酒中部分物質(zhì)含量，但是提高了酒體透光率。麥芽-麥胚芽酒澄清前后的部分理化指標如表5所示。

表5 澄清前后理化指標對比

酒精度由澄清前的7.2%vol降至6.5%vol，還原糖質(zhì)量濃度由10.6 g/L降至7.3 g/L，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度由120.45 mg/L降至94.52 mg/L，總酚質(zhì)量濃度由3.4 g/L降至2.7 g/L。澄清后的酒體清澈鮮亮，色澤極佳。

3 結(jié)論

試驗從3種酶澄清劑中篩選酸性蛋白酶作為最佳酶澄清劑，通過單因素試驗選取最佳條件，通過Design-Expert V 8.0.6軟件進行Box-Benhnken試驗設計，以酸性蛋白酶添加量、澄清時間、澄清溫度為自變量，麥芽-麥胚芽酒的透光率為響應值，對試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，所得自變量與透光率（Y）的二次多項回歸方程為Y=84.28+3.69A-0.14B+0.100C-0.83AB-0.20AC-0.80BC-0.48A2+1.37B2+0.70C2，最佳澄清條件為酸性蛋白酶添加量1.2 g/L，澄清時間9 h，澄清溫度60 ℃，自然靜置狀態(tài)下得到的最終酒體透光率為90.1%，所得麥芽-麥胚芽酒品質(zhì)極佳，為酸性蛋白酶用于酒類澄清提供參考。