劉寶同，梁晶晶，李培根，王永慶，秦 朋，梁 奕

（青島根源生物技術(shù)集團(tuán)有限公司，山東青島 266111）

凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）又稱南美白對(duì)蝦，是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖水產(chǎn)動(dòng)物之一，憑借生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)要求低、出肉率高、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，成為我國(guó)養(yǎng)殖面積最廣、養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的對(duì)蝦種類[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2019 年我國(guó)水產(chǎn)品總產(chǎn)量為5 079 萬(wàn)t，其中凡納濱對(duì)蝦產(chǎn)量高達(dá)181.5 萬(wàn)t[2]。然而，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大和集約化程度的不斷提高，水質(zhì)污染、疾病爆發(fā)、養(yǎng)殖成活率低等一系列問題日漸突出。在影響凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖成功率的諸多因素中，飼料是不可忽視的重要因素，而所投喂的飼料中又有部分飼料蛋白通過糞便以氨氮形式排出體外，既污染水質(zhì)又造成浪費(fèi)。微生態(tài)制劑和酶制劑在有效劑量下持續(xù)使用會(huì)改善腸道及生長(zhǎng)環(huán)境，降低不良環(huán)境下動(dòng)物的應(yīng)激和疾病發(fā)生率[3-5]。但實(shí)際飼料生產(chǎn)過程中，為了保證水中穩(wěn)定性和飼料原料熟化程度，一般會(huì)高溫（≥90℃）熟化30 min 以上，造成益生菌、酶制劑有效成分損失[6-7]。目前市場(chǎng)上菌酶制劑大多都是在養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)以拌料的形式直接投喂，不僅工作量大，而且容易出現(xiàn)拌料不均勻等現(xiàn)象，同時(shí)黏附到飼料表面的菌酶入水后易散失到水體中，利用效率低下。本研究將魚粉、豆粕等基礎(chǔ)日糧原料與以丁酸梭菌、枯草芽孢桿菌、蛋白酶、木聚糖酶為主的菌酶制劑按比例通過冷制粒工藝單獨(dú)制粒（本研究稱其為生物飼料伴侶），然后與飼料混合均勻投喂，探究其對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能、非特異性免疫能力和腸道菌群的影響，為其在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 本研究中制備生物飼料伴侶所需原料由青島根源生物技術(shù)集團(tuán)有限公司提供，基礎(chǔ)日糧為常規(guī)飼料工藝制備。生物飼料伴侶及基礎(chǔ)日糧原料組成及營(yíng)養(yǎng)成分見表1。

表1 生物飼料伴侶及基礎(chǔ)日糧原料組成及營(yíng)養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 凡納濱對(duì)蝦購(gòu)于山東省萊陽(yáng)市羊郡，規(guī)格為3～5 cm。試驗(yàn)開始前經(jīng)7 d 馴化，從中選取192尾規(guī)格一致、體質(zhì)健康、初始重為（0.48±0.04）g 的凡納濱對(duì)蝦，隨機(jī)分為4 組，每組4 缸，每缸12 尾，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組分別以生物飼料伴侶按5%、10%、20%比例替代基礎(chǔ)日糧進(jìn)行飼喂，試驗(yàn)期30 d。試驗(yàn)期間維持水溫26～28 ℃，pH 8.0～8.4，亞硝酸鹽≤0.05 mg/L，弧菌含量＜2 000 CFU/mL。采用電磁式空氣泵連續(xù)充氣，中科直流變頻循環(huán)水泵流量為12 000 L/h，全系統(tǒng)循環(huán)8 次/d，每3 d 換水0.1 m3。

1.3 飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)在根源生物集團(tuán)技術(shù)支持中心水生態(tài)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，每日8:30、12:30 和16:30 各投喂1 次。按體重比例調(diào)整投喂量，保證吃料時(shí)間在60～90 min，每天核對(duì)對(duì)蝦數(shù)量，觀察攝食情況并記錄。

1.4 樣品采集與指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 生長(zhǎng)性能 分別在試驗(yàn)開始前和結(jié)束后將凡納濱對(duì)蝦禁食16 h，逐缸核對(duì)數(shù)量后撈出，用濾紙輕輕吸干蝦體表面水分后進(jìn)行稱重，計(jì)算增重率、飼料系數(shù)、特定生長(zhǎng)率及成活率。計(jì)算公式如下：

增重率（%）=100×[（Wt-W0）/W0]

特定生長(zhǎng)率（%/d）=100×[（lnWt-lnW0）/t]

飼料系數(shù)=F/（Wt-W0）

成活率（%）=T活/T總×100其中，W0為初始平均體重（g），Wt為終末平均體重（g），t 為試驗(yàn)天數(shù)（d），F(xiàn) 為采食量（g），T活為成活尾數(shù)，T總為總尾數(shù)。

1.4.2 血清非特異性免疫酶活性的測(cè)定 用l mL 無菌注射器從對(duì)蝦頭胸甲后插入心臟抽取血液，裝至2 mL 無菌EP 管中，于4℃冰箱靜置過夜。血清中堿性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）和超氧化物歧化酶（SOD）活性均采用試劑盒進(jìn)行分析測(cè)定，試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，按照說明書提示方法進(jìn)行測(cè)定。

1.4.3 凡納濱對(duì)蝦腸道樣品采集 在放有冰袋的解剖盤上用無菌解剖剪解剖取出對(duì)蝦腸道全腸，分裝至2 mL無菌EP 管中并標(biāo)記編號(hào)，迅速放入液氮中速凍，之后放于-20℃保存，送至青島百邁克生物技術(shù)有限公司進(jìn)行微生物多樣性分析。采用Illumina 高通量測(cè)序樣本原始數(shù)據(jù)，用Trimmomatic 軟件進(jìn)行序列質(zhì)控，使用Flash 軟件進(jìn)行序列拼接、優(yōu)化及統(tǒng)計(jì)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用Excel 處理數(shù)據(jù)，并用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA）及Duncan's 多重比較檢驗(yàn)，以P＜0.05 作為差異顯著判斷水平。

2 結(jié)果

2.1 生物飼料伴侶對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響 由表2 可知，5%、10%和20%替代組在不影響凡納濱對(duì)蝦存活率的同時(shí)可以提高其增重率、特定生長(zhǎng)率并降低餌料系數(shù)，與對(duì)照組相比，10% 替代組增重率提高19.6%、特定生長(zhǎng)率提高7.9%（P＜0.05）。

表2 生物飼料伴侶對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響

2.2 生物飼料伴侶對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清非特異性免疫酶活性的影響 由表3 可知，5%、10%和20%替代組均可顯著提高凡納濱對(duì)蝦血清中ACP 和AKP 的活力，且隨替代量增加，各試驗(yàn)組酶活力呈升高趨勢(shì)（P＞0.05）。5%替代組可提高凡納濱對(duì)蝦血清中SOD 活力（P＞0.05），當(dāng)替代量為10% 和20% 時(shí)，其SOD 活力顯著高于對(duì)照組。

表3 生物飼料伴侶對(duì)凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫的影響

2.3 腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 凡納濱對(duì)蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)的α多樣性分析 Chao1指數(shù)數(shù)值越大代表腸道樣品中物種總數(shù)越多，Shannon指數(shù)越高代表腸道樣品中菌群多樣性越高。由表4 可知，3 個(gè)試驗(yàn)組腸道樣品中物種總數(shù)相比對(duì)照組均有不同程度升高，腸道菌群多樣性均高于對(duì)照組，但差異不顯著。

表4 不同處理組凡納濱對(duì)蝦的腸道菌群多樣性指數(shù)

2.3.2 凡納濱對(duì)蝦腸道細(xì)菌群落主坐標(biāo)分析（PCoA 分析） PCoA 分析是一種降維排序方法，可以對(duì)樣本進(jìn)行分類，進(jìn)一步展示樣品間物種多樣性差異。圖1 結(jié)果顯示，各試驗(yàn)組對(duì)蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)較對(duì)照組有明顯的結(jié)構(gòu)差異。

圖1 對(duì)蝦腸道細(xì)菌群落PCoA 分析

2.3.3 凡納濱對(duì)蝦腸道細(xì)菌群落操作分類單元（OTU）聚類的Venn 圖 通過分析表明，各組對(duì)蝦腸道菌群的共有OTUs 為131 種，其中對(duì)照組特有的OTUs 為1 種，5%、10%和20%替代組特有的OTUs 分別為0、1、7 種。各組中OTUs 分別為136、139、151、157 種（圖2），分別占總體的84.47%、86.33%、93.78%、97.51%，與α多樣性分析結(jié)果一致。

圖2 腸道細(xì)菌群落OTU 的Venn 圖

2.3.4 凡納濱對(duì)蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)分析 由表5 和圖3 可以發(fā)現(xiàn)，凡納濱對(duì)蝦腸道優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroides），二者豐富度之和大于88%。以5%～20% 的生物飼料伴侶替代部分基礎(chǔ)日糧飼喂凡納濱對(duì)蝦，其腸道菌群中變形菌門和厚壁菌門（Firmicutes）的占比降低，其中10%替代組變形菌門占比、5%替代組和20%替代組厚壁菌門占比均顯著低于對(duì)照組；試驗(yàn)組擬桿菌門和疣微菌門（Verrucomicrobia）占比增加，但組間差異不顯著。

圖3 不同飼喂組凡納濱對(duì)蝦腸道菌群門水平物種組成

表5 不同飼喂組凡納濱對(duì)蝦腸道主要菌門相對(duì)豐度 %

進(jìn)一步分析屬水平菌群結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，以5%～20% 的生物飼料伴侶替代部分基礎(chǔ)日糧，凡納濱對(duì)蝦腸道菌群中Formosa屬占比均顯著高于對(duì)照組，且弧菌屬（Vibrio）占比顯著低于對(duì)照組。對(duì)蝦腸道菌群中其他3 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬——Spongiimonas屬、Ruegeria屬、Thalassobius屬中，除20%替代組Thalassobius屬占比顯著高于對(duì)照組，其他組與對(duì)照組相比均無顯著性差異（表6，圖4）。

圖4 不同飼喂組凡納濱對(duì)蝦腸道菌群屬水平物種組成

表6 不同飼喂組凡納濱對(duì)蝦腸道主要菌群變化 %

3 討 論

3.1 生物飼料伴侶對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)指標(biāo)的影響 生物飼料伴侶含有益生菌和酶，能夠通過促進(jìn)食物消化、提高飼料利用率、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收等多種途徑來提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能[8]。本研究結(jié)果顯示，使用生物飼料伴侶替代部分基礎(chǔ)日糧對(duì)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能有積極影響，試驗(yàn)組均能在不影響成活率的前提下提高凡納濱對(duì)蝦的增重率、特定增長(zhǎng)率并降低餌料系數(shù)，其中替代量為10% 最為明顯，與對(duì)照組具有顯著性差異。本研究中的生物飼料伴侶是以丁酸梭菌、枯草芽孢桿菌、蛋白酶、木聚糖酶為主的菌酶制劑經(jīng)冷制粒而成，其中丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌通過改善腸道形態(tài)等來提高機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力進(jìn)而實(shí)現(xiàn)促生長(zhǎng)功能；丁酸梭菌能夠發(fā)酵腸道內(nèi)的飼料并產(chǎn)生腸道上皮細(xì)胞生長(zhǎng)所需的能量物質(zhì)——短鏈脂肪酸（SCFA），顯著提高凡納濱對(duì)蝦的絨毛長(zhǎng)度、杯狀細(xì)胞高度、寬度和皺襞高度，增加腸壁厚度，使對(duì)蝦腸道絨毛和邊緣更加清晰、細(xì)胞組織排列更加緊密，進(jìn)而促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦腸道健康[9-11]。芽孢桿菌能夠與病原菌競(jìng)爭(zhēng)生存位點(diǎn)來抑制病原菌的生長(zhǎng)，并且能夠產(chǎn)生蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、消化酶進(jìn)而提高凡納濱對(duì)蝦的腸道穩(wěn)定性和消化系統(tǒng)[12-13]。

3.2 生物飼料伴侶對(duì)凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫指標(biāo)的影響 凡納濱對(duì)蝦缺乏特異性免疫，因此其免疫系統(tǒng)由一系列體液免疫因子組成[14]。SOD 具有清除生物體內(nèi)活性氧自由基、保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的功能，而ACP和AKP 則是動(dòng)物體內(nèi)參與免疫防御的重要水解酶[15-16]。李軍亮[17]在低魚粉飼料中添加適量的枯草芽孢桿菌能夠顯著提升凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)ACP 酶含量；胡毅[18]在飼料中添加復(fù)合益生菌能夠顯著提升SOD 酶活且其提升能力優(yōu)于單一添加菌。He[19]發(fā)現(xiàn)在飼料中添加蠟樣芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌和丁酸梭菌能夠顯著提高石斑魚的免疫酶活及生長(zhǎng)性能。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組ACP 與AKP 酶活較對(duì)照組顯著升高；除5%替代組SOD 活力與對(duì)照組無顯著性差異外，其他試驗(yàn)組均顯著高于對(duì)照組，且酶活都隨替代量的增加而升高，說明生物飼料伴侶替代部分基礎(chǔ)日糧可提高對(duì)蝦非特異性免疫能力，與上述文獻(xiàn)結(jié)果相似。

3.3 生物飼料伴侶對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的影響 腸道微生物及其菌群結(jié)構(gòu)的變化對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)具有重要影響，與腸道營(yíng)養(yǎng)吸收、胃腸發(fā)育及腸道免疫有著密切聯(lián)系。本試驗(yàn)中試驗(yàn)組對(duì)蝦的Shannon 指數(shù)的升高及Simpson 指數(shù)的降低，說明腸道細(xì)菌區(qū)系的多樣性和穩(wěn)定性提高，與孫振麗[20]報(bào)道的健康對(duì)蝦較發(fā)病對(duì)蝦腸道菌群多樣性高的結(jié)果相比，說明本研究中試驗(yàn)組對(duì)蝦抗病能力增強(qiáng)。生物飼料伴侶中含有的枯草芽孢桿菌和丁酸梭菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道健康起正向調(diào)控。據(jù)報(bào)道，枯草芽孢桿菌能夠提升對(duì)蝦腸道菌群多樣性，且對(duì)弧菌屬等潛在致病菌存在抑制作用[21]；丁酸梭菌能夠通過產(chǎn)生丁酸降低腸道內(nèi)pH、修復(fù)腸黏膜、抑制腸道炎癥的發(fā)生，同時(shí)丁酸梭菌作為腸道土著菌能夠促進(jìn)有益菌的增殖，進(jìn)而提高機(jī)體免疫能力[22-23]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在腸道菌群方面以生物飼料伴侶替代部分基礎(chǔ)日糧，凡納濱對(duì)蝦腸道γ 變形菌綱占比相比對(duì)照組明顯下降，其中10%替代組相比降低14.19%，同時(shí)顯示出對(duì)弧菌屬占比有明顯的抑制效果，10% 替代組相比降低13.91%；擬桿菌門在試驗(yàn)組腸道微生物占比上升，10%替代組中擬桿菌門占比上升16.12%，同屬于擬桿菌門的Formosa屬菌株占比上升。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)條件下，以生物飼料伴侶替代部分基礎(chǔ)日糧可顯著提高凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能，增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫力，提高凡納濱對(duì)蝦腸道細(xì)菌群落區(qū)系多樣性和穩(wěn)定性，對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道有害菌群有一定的抑制作用。綜合考慮成本和效果，推薦采用10% 生物飼料伴侶替代基礎(chǔ)日糧。