武 超，呂觀新，武 瑞

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

女貞子在中醫(yī)藥中應(yīng)用已有千余年的歷史，在中醫(yī)理論中，女貞子是一味可補中養(yǎng)神、滋陰壯骨、益肝益腎的中草藥，還可用于改善視力、促進黑發(fā)生長。女貞子主要活性成分包括萜類化合物、黃酮類化合物、揮發(fā)油類化合物、磷脂類化合物和氨基酸類化合物等[1-2]，具有保肝[3]、抗腫瘤[4]、抗氧化[5-6]、抗骨質(zhì)疏松[7-8]、降血糖血脂[9-10]和免疫調(diào)節(jié)[11]的作用。女貞子作為純天然物質(zhì)能夠大幅度減少毒副作用、改善抗藥性及藥物殘留問題，近年來更是廣泛應(yīng)用于畜禽臨床疾病防治及生產(chǎn)性能調(diào)節(jié)領(lǐng)域[12]。

隨著全球?qū)εＤ绦枨罅康奶嵘绾翁岣吲Ｄ坦?yīng)量和奶牛單產(chǎn)水平是當(dāng)前奶牛養(yǎng)殖業(yè)的重要課題；而中草藥作為純天然物質(zhì)在促進奶牛泌乳方面具有獨特的優(yōu)勢。有研究表明，女貞子作為飼料添加劑飼喂奶?？商岣吣膛Ｃ谌榱扛纳迫槠焚|(zhì)[13]。然而，女貞子中化學(xué)成分較多，具體由哪些關(guān)鍵成分發(fā)揮哪些具體作用從而達(dá)到促進泌乳目的的機制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于藥物-靶點-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)進行系統(tǒng)分析的先進技術(shù)[14-16]，通過建造多靶點預(yù)測模型從分子角度闡明活性化合物與相關(guān)靶點之間的相互作用關(guān)系從而明確其作用機理[17]。本試驗旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)知識探究女貞子促進奶牛泌乳有效成分-目標(biāo)靶點-作用通路的潛在作用關(guān)系，為下一步進行試驗來驗證所建立的網(wǎng)絡(luò)預(yù)測模型奠定理論基礎(chǔ)，為女貞子促進奶牛泌乳廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 女貞子化合物篩選及化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過生物信息學(xué)分析工具BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/），檢索女貞子的所有化學(xué)成分，設(shè)置“Score cutoff”為20，“Adjusted P-value”調(diào)至為0.05，篩選符合條件的活性成分，獲取相對應(yīng)的靶點基因。將篩選出的化學(xué)成分及其相對應(yīng)的靶點基因上傳至Cytoscape 3.7.2 軟件，繪制出化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 女貞子作用于牛的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用NCBI 數(shù)據(jù)庫Gene（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）高級檢索“Bos taurus”和“l(fā)actation”，得到物種為牛且與泌乳相關(guān)的基因蛋白。登錄在線網(wǎng)站STRING 11.0（https://string-db.org/cgi/input.pl）上傳女貞子中各化合物對應(yīng)靶點與牛泌乳基因，創(chuàng)建女貞子與牛泌乳間蛋白質(zhì)相互作用PPI 網(wǎng)絡(luò)。

1.3 女貞子-牛泌乳GO 富集和KEGG 通路富集分析將PPI 網(wǎng)絡(luò)中蛋白基因上傳至DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）的基因列表中，設(shè)置偽發(fā)現(xiàn)率＜0.01，得到GO 條目和KEGG 通路富集數(shù)據(jù)，上傳至Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 化合物篩選及化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過BATMAN 數(shù)據(jù)庫檢索，從女貞子18 個化合物中篩選出7 個符合條件的活性化合物，利用Cytoscape 3.7.2軟件繪制的女貞子化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖（圖1），共包括181 個靶點和228 條邊（邊即點與點之間的連線，邊的條數(shù)稱之為度值degree）。網(wǎng)絡(luò)中平均每個化合物可與32.6 個目標(biāo)靶點相連，同時平均每個目標(biāo)靶點都可與其中1.3 個化合物產(chǎn)生相互作用，這反映出女貞子多種中藥成分與多種目標(biāo)靶點共同作用的治療機制。從化合物角度來講，D-甘露醇（D-Mannitol）、熊果酸（Ursolic Acid）連接靶點個數(shù)≥ 80，齊墩果酸（Oleanolic Acid）、D-甘露庚酮糖（D-Mannoheptulose）連接靶點個數(shù)≥ 20，分別可與84、80、27、26 個目標(biāo)靶點相互作用；從靶點角度來看，雄激素受體（AR）、糖皮質(zhì)激素受體基因（NR3C1）、阿片受體基因（OPRK1）連接化合物個數(shù)≥ 3，均可同時與4 個化合物相互作用。

圖1 女貞子活性化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)

2.2 女貞子作用靶點與牛泌乳間的PPI 網(wǎng)絡(luò) 利用STRING 在線網(wǎng)站建立女貞子與牛泌乳的PPI 互作網(wǎng)絡(luò)，將打分值設(shè)置＞0.7，結(jié)果顯示蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中共包括201 個蛋白節(jié)點，566 條互作關(guān)系，篩選出核心網(wǎng)絡(luò)（圖2）。為更加直觀了解女貞子與牛泌乳蛋白互作關(guān)系，將PPI 網(wǎng)絡(luò)圖中蛋白基因?qū)隒ytoscape 3.7.2 軟件-cytoHubba，篩選出直接作用于牛泌乳的化合物靶點（圖3），其中白蛋白（ALB）、前列腺素E2 受體（PTGER）、前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2（PTGS2）、雌激素受體1（ESR1）和雄激素受體（AR）是直接作用于牛泌乳基因上的靶點且度值較高。繪制前20 個關(guān)鍵蛋白節(jié)點條形圖（圖4），這些蛋白節(jié)點均與女貞子促進奶牛泌乳密切相關(guān)，其中胰島素樣生長因子1（IGF1）、白蛋白（ALB）、催乳素受體（PRLR）等濃度值較高，在該過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

圖2 女貞子與牛泌乳的PPI 核心網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 女貞子直接作用于牛泌乳的靶點網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 PPI 核心網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵靶點的度

2.3 GO 功能富集和KEGG 通路富集分析 從DAVID數(shù)據(jù)庫GO 富集分析結(jié)果中篩選得到35 條有效GO 條目（偽發(fā)現(xiàn)率＜0.01），其中包括生物過程條目12 個、細(xì)胞組成條目9 個、分子功能條目14 個（圖5）；在KEGG 通路分析中，篩選與牛泌乳相關(guān)得到13 條有效信號通路（偽發(fā)現(xiàn)率＜0.01），其中具有代表性的有PI3K-Akt 信號通路、催產(chǎn)素信號通路、MAPK 信號通路、雌激素信號通路、催乳素信號通路等，具體信息見表1。將KEGG 通路信息上傳至Cytoscape 3.7.2 軟件繪制靶點-KEGG 信號通路網(wǎng)絡(luò)圖（圖6）。

表1 PPI 網(wǎng)絡(luò)中通路富集結(jié)果

圖5 PPI 網(wǎng)絡(luò)中基因GO 富集結(jié)果

圖6 靶點-KEGG 信號通路網(wǎng)絡(luò)

3 討 論

3.1 女貞子作用于牛泌乳基因的關(guān)鍵靶點 女貞子作用于牛泌乳的關(guān)鍵靶點包括IGF1、ALB、PRLR 等。奶牛早期泌乳的需要是通過協(xié)調(diào)的生理反應(yīng)來滿足，其中涉及到大量激素調(diào)控。生長激素（GH）是一種垂體激素，直接或間接影響動物泌乳、生長和繁殖等許多方面[18]。對哺乳期奶牛施用GH 可持續(xù)提高產(chǎn)奶量，增加牛奶合成所需營養(yǎng)素的吸收，并增加IGF1 的循環(huán)水平[19-20]。IGF1 在乳汁發(fā)生過程中對乳腺組織的穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化具有重要作用[21-22]。反芻動物乳汁中的白蛋白（ALB）可以與10 個或更多的長鏈脂肪酸分子結(jié)合，在脂質(zhì)代謝方面至關(guān)重要，血液中的ALB 是反映奶牛蛋白質(zhì)與能量代謝的重要參數(shù)。ALB 也是血液循環(huán)中的主要循環(huán)蛋白，轉(zhuǎn)運多種內(nèi)源性和外源性化合物；是一種多功能的蛋白質(zhì)載體，多用于藥物靶向[23-24]。PRLR基因是影響產(chǎn)奶量的代表性基因，在調(diào)節(jié)垂體催乳素（PRL）和乳蛋白基因的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用。催乳素受體與催乳素的結(jié)合能夠激活JAK2/STAT5 信號通路，最終激活作用于乳蛋白基因啟動子區(qū)域的反式作用因子STAT5，啟動或增強乳蛋白基因的表達(dá)，從而對產(chǎn)奶性能產(chǎn)生顯著影響[25]。

3.2 女貞子化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵化合物 結(jié)合化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)和PPI 網(wǎng)絡(luò)篩選出關(guān)鍵靶點ALB、ESR1、AR、PTGER、PTGS2 直接作用于泌乳基因，發(fā)現(xiàn)這些靶點相對應(yīng)化合物來源均為齊墩果酸與熊果酸。ESR1基因在機體性發(fā)育以及生殖功能方面發(fā)揮顯著作用，當(dāng)其與雌激素結(jié)合后可通過乳腺細(xì)胞分泌生長因子途徑來影響乳腺發(fā)育情況；另外ESR1基因具有促進細(xì)胞分裂、繁殖和生長能力[26]。AR 是雄激素發(fā)揮作用的必需受體，可調(diào)節(jié)細(xì)胞基因的表達(dá)，還與大多生殖活動密切相關(guān)；AR 還具有調(diào)節(jié)機體激素水平相對平衡、促進蛋白質(zhì)合成代謝的功能。PTGER與PTGS2基因多與炎癥反應(yīng)及癌癥相關(guān)，齊墩果酸臨床常用于抗炎與抗腫瘤，可見女貞子可通過成分中的齊墩果酸調(diào)控PTGER、PTGS2 來影響炎癥與癌癥反應(yīng)的發(fā)生與發(fā)展，或許從這一角度對奶牛泌乳具有一定的影響效果；齊墩果酸還具有護肝、降低血糖血脂提高機體免疫力等功能[27-29]。熊果酸在降低血脂、改善胰島素抵抗方面效果顯著，其可通過抑制脂質(zhì)過氧化從而阻斷氧化應(yīng)激過程[30-31]。從本研究結(jié)果來看，女貞子可促進奶牛泌乳很可能與熊果酸和齊墩果酸的作用有關(guān)，通過作用于ALB、ESR1、AR、PTGER 和PTGS2 等靶點來調(diào)控奶牛泌乳基因從而在泌乳過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。

3.3 GO 功能富集和KEGG 通路富集分析 通過GO 功能富集可知女貞子主要活性成分靶點是通過胞漿鈣離子濃度的正調(diào)控、磷脂酶C 激活G 蛋白偶聯(lián)受體信號途徑、腺苷酸環(huán)化酶抑制G 蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體信號通路等方式實現(xiàn)對泌乳基因的調(diào)控，另外還涉及多種離子跨膜運轉(zhuǎn)、離子通道復(fù)合物及呼吸鏈復(fù)合物成分。KEGG 通路富集結(jié)果顯示，女貞子促進泌乳涉及多種激素調(diào)節(jié)、能量代謝以及細(xì)胞增殖等通路，具體包括PI3K-Akt 信號通路、cGMP-PKG 信號通路、MAPK 信號通路、催乳素信號通路、雌激素信號通路、脂肪細(xì)胞因子信號通路等?？偟膩碚f，女貞子通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、生物合成、激素調(diào)節(jié)及神經(jīng)調(diào)節(jié)途徑發(fā)揮促進泌乳的作用。

4 結(jié) 論

綜上所述，女貞子通過多種活性成分、多個靶點、多條通路來達(dá)到促進泌乳的作用，通過熊果酸、齊墩果酸等化學(xué)成分作用于ALB、ESR1、AR、PTGER 和PTGS2 等靶點，調(diào)控機體激素分泌、蛋白質(zhì)合成、能量代謝及細(xì)胞增殖，并涉及多種信號通路，包括PI3KAkt 信號通路、cGMP-PKG 信號通路、MAPK 信號通路、催乳素信號通路、雌激素信號通路、脂肪細(xì)胞因子信號通路等，以多種生物合成、激素調(diào)節(jié)以及神經(jīng)調(diào)節(jié)的方式來調(diào)控奶牛泌乳。另外，泌乳過程總體相對復(fù)雜且涉及范圍較廣，故女貞子是否可通過本研究所建立的網(wǎng)絡(luò)預(yù)測模型從而發(fā)揮促進泌乳作用還需要后續(xù)試驗進一步驗證。