劉高坤，王思偉，劉少興，李魁英，郭偉婷，王雅晶，王 昆*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193；2.河北省農(nóng)林科學院糧油作物研究所，河北石家莊 050035；3.石家莊市畜牧技術(shù)推廣站，河北石家莊 050000）

玉米青貯是奶牛日糧的重要組成部分，其營養(yǎng)價值評價與相關(guān)青貯產(chǎn)品的開發(fā)是反芻動物營養(yǎng)中的重要研究內(nèi)容[1-2]。自然狀態(tài)下，植物上附著的天然乳酸菌多為異型發(fā)酵菌，乳酸菌數(shù)量不足且有害菌比例大，可能會引起玉米青貯發(fā)酵進程緩慢、穩(wěn)定性差等，進而對青貯品質(zhì)造成不利影響[3]，因此通過接種的方式增加玉米青貯中乳桿菌等多型發(fā)酵或兼性厭氧菌的數(shù)量，促使青貯發(fā)酵向快速、低溫、低營養(yǎng)損失的發(fā)酵過程轉(zhuǎn)變，是目前獲得優(yōu)質(zhì)青貯飼料的重要手段[4-5]。

微生物青貯添加劑是一類專門用于飼料青貯的活菌添加劑，根據(jù)其作用效果可以分為青貯發(fā)酵促進劑、營養(yǎng)型功能添加劑以及青貯開窖后使用的有氧穩(wěn)定劑三大類型[6]。而根據(jù)發(fā)酵類型，微生物發(fā)酵劑又分為同型發(fā)酵菌屬和異型發(fā)酵菌屬，其中同型發(fā)酵菌（如乳酸菌、植物乳桿菌、糞鏈球菌、片球菌等）能夠在青貯初始發(fā)酵階段促進乳酸菌快速繁殖，產(chǎn)生較多乳酸，從而降低青貯體系內(nèi)pH，抑制有害微生物活動，提高青貯發(fā)酵品質(zhì)[7]；異型發(fā)酵菌屬，如布氏乳桿菌可以同時產(chǎn)生乳酸和揮發(fā)性脂肪酸（主要乙酸），抑制好氧細菌生長，具有提高青貯有氧穩(wěn)定性的作用。同時接種外源活性菌劑還能夠調(diào)節(jié)青貯飼料發(fā)酵過程中的微生物區(qū)系，對青貯原料中不易消化的多糖與粗纖維等進行預消化，提高粗飼料的營養(yǎng)價值[8]。微生物發(fā)酵劑對玉米青貯中原著微生物的數(shù)量和活性有不同程度的影響，但單一添加劑作用效果有限[2,9]。將多種有益菌株按比例制成多菌株復合體，不同微生物間產(chǎn)生的互作效應會顯著提高菌株復合體的作用效果[10-11]。本試驗在前人研究基礎(chǔ)上，使用植物乳桿菌與其他微生物菌劑形成不同組合，旨在篩選出理想的微生物添加劑組合，為制作青貯飼料時的添加劑選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 全株玉米來自河北省農(nóng)林科學院糧油作物研究所藁城堤上試驗站，于蠟熟期收獲切斷為1～2 cm 小段。XL 添加劑主要成分：植物乳桿菌≥1×1011CFU/g，布氏乳桿菌≥1×109CFU/g，屎腸球菌≥1×109CFU/g（芯來旺生物科技（南京）有限公司）。BL 添加劑主要成分：植物乳桿菌≥3×108CFU/g，戊糖片球菌≥1×109CFU/g（山東碧藍生物科技有限公司）。HY 添加劑主要分：嗜酸乳桿菌≥1×109CFU/g，枯草芽孢桿菌≥6×109CFU/g，產(chǎn)脘假絲酵母≥3×109CFU/g（北京好友巡天生物技術(shù)有限責任公司）。

1.2 試驗設計 試驗采用單因素設計，設置4 個處理組，每個處理3 個重復。XL 組、BL 組、HY 組、對照組（CK）分別按青貯質(zhì)量的0.1% 添加XL、BL、HY 添加劑和蒸餾水，混勻后裝入發(fā)酵桶內(nèi)，填裝、壓實、密封。常溫條件下貯存 60 d 開封，用四分法進行取樣，用于發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)價值的測定。

1.3 檢測指標

1.3.1 感官評價 評定青貯料等級按照《德國DLG 青貯飼料感官評分標準》[12]，從氣味、質(zhì)地和色澤3 方面進行感官評價。其中，氣味占14 分，質(zhì)地占4 分，色澤占2 分，綜合得分16～20 為優(yōu)良，10～15 為尚可，5～9為中等，0～4 為腐敗。

1.3.2 青貯品質(zhì)檢測 青貯開罐后，混合均勻，取20 g 青貯飼料，加入180 mL 蒸餾水，用強力破壁機將青貯組織搗碎，然后用4 層紗布過濾，獲得青貯浸提液。采用雷磁PHB-4 pH 計測定青貯飼料的pH，采用苯酚-次氯酸比色法（TU-1901 型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司）測定氨態(tài)氮（Ammonia Nitrogen，AN）含量；有機酸（乳酸、乙酸、丙酸及丁酸）采用COMOSIL5C18-PAD 液相色譜儀測定（流速1 mL/min，柱溫30℃，檢測波長215 nm，進樣體積20 μL）[13]。

1.3.3 營養(yǎng)品質(zhì)檢測 將青貯鮮樣置于65℃烘箱內(nèi)烘干至恒重，室溫回潮一晝夜進行干物質(zhì)（DM）含量測定。粗蛋白質(zhì)（CP）采用凱氏定氮儀法測定[14]（KJELTEC AUTO 1030 Analyzer 凱式定氮儀，Tecator）；粗脂肪（EE）采用索氏提取法測定（SZF-06G 型脂肪測定儀，上海新家儀器有限公司）；粗灰分（Ash）采用550℃灼燒法測定，中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）采用范氏纖維測定法測定（CXC-06 型纖維測定儀，上海新家儀器有限公司）、可溶性糖（Water Soluble Carbohydrate，WSC）、淀粉（Starch）采用蒽酮-硫酸比色法[15]測定，具體操作參照張麗英《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》[16]。

1.3.4 有氧穩(wěn)定性檢測 青貯60 d 后，打開青貯罐，取2 kg 青貯玉米放到容積為5 L 的聚乙烯青貯罐中，罐口用2 層紗布覆蓋，防止青貯水分揮發(fā)過快和異物落入，放置在室溫條件下。用USB 數(shù)據(jù)溫濕度記錄儀實時記錄青貯飼料中心出溫度（購自江蘇見智科技公司），在室內(nèi)另設2 處溫度觀測點，記錄室內(nèi)溫度，每30 min自動記錄1 次，6 d 后取出溫度計，將溫度數(shù)據(jù)從數(shù)據(jù)庫導出分析，當青貯溫度比外界溫度高2℃時，即認為為青貯開始變質(zhì)發(fā)酵。青貯飼料暴露在空氣中，飼料溫度比外界溫度高2℃所用的時長即為有氧穩(wěn)定性。

1.4 飼料相對值（RFV）計算 RFV 的計算公式[17]：

RFV=DMI×DDM/1.29

粗飼料干物質(zhì)采食量（Dry Matter Intake，DMI）與可消化的干物質(zhì)（Digestible Dry Matter，DDM）的預測模型：

DMI=120/NDF

DDM=88.9－0.779ADF

式中，DMI 為占體重的百分比即%BW。

粗飼料分級標準：＞151 分為特級，125～150 分為1 級，103～124 分為2 級，87～102 分為3 級，75～86 分為4 級，＜75 分為5 級。

1.5 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010 進行整理后，用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和Duncan's 多重比較，結(jié)果以平均值± 標準差表示。P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同添加劑處理對全株玉米青貯感官品質(zhì)的影響表1 結(jié)果顯示，各青貯處理感官良好，均散發(fā)較強酸味，其中XL 與HY 組芳香味明顯，除XL 組葉片結(jié)構(gòu)較差外，其他各組莖葉結(jié)構(gòu)均保持清晰，無黏連結(jié)塊現(xiàn)象，呈現(xiàn)黃綠或淡綠色。綜合各感官指標，CK 組和BL 組青貯玉米感官尚好，XL 組、HY 組感官優(yōu)良。

表1 不同添加劑處理對全株玉米青貯感官品質(zhì)的影響

2.2 不同添加劑處理對全株玉米青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響由表2 可見，不同添加劑對全株玉米青貯pH、AN 和WSC 含量均無顯著影響，而HY 組中AN/TN 高于其他3 組（P＜0.05）。全株玉米在有無微生物添加劑條件下pH 均在4.2 以下，符合一級青貯標準中酸堿度的要求。

表2 不同添加劑處理對全株玉米青貯pH、AN、WSC 含量的影響

由表3 可知，與CK 組相比，HY 組玉米青貯乳酸和總酸的含量提高（P＜0.05），而乙酸、丙酸、乳酸/總酸無顯著變化，其他添加劑對全株玉米青貯中有機酸的生成及乳酸比例無顯著影響。

表3 不同添加劑處理對全株玉米青貯揮發(fā)性脂肪酸的影響

2.3 不同添加劑處理對全株玉米青貯營養(yǎng)物質(zhì)含量的影響 由表4 可知，微生物添加劑能提高全株玉米青貯的RFV（P＜0.05），其中HY 組RFV 最高；與CK 組相比，HY 組的青貯玉米CP、EE、NDF、ADF 含量降低（P＜0.05），而Starch 含量升高（P＜0.05）。與HY、XL、BL 相比，HY 能提高青貯玉米DM 和Starch 含量（P＜0.05），而不同處理間CP、EE、NDF、ADF、Ash 含量無顯著差異。

表4 不同添加劑處理對全株玉米青貯營養(yǎng)物質(zhì)含量的影響

2.4 不同添加劑處理對玉米青貯有氧穩(wěn)定性的影響 由圖1 可知，與CK 組相比，添加劑XL 降低了玉米青貯有氧穩(wěn)定性（P＜0.05），而添加劑BL、HY 對玉米青貯有氧穩(wěn)定性無顯著影響。在不同處理下，全株玉米青貯有氧暴露時最長穩(wěn)定時間為113 h（HY 組），最短為80 h（XL 組）。

圖1 不同添加劑處理對玉米青貯有氧穩(wěn)定性的影響

3 討 論

3.1 不同微生物添加劑對玉米青貯品質(zhì)的影響 青貯飼料在發(fā)酵階段的厭氧程度及維持情況是決定青貯飼料保鮮狀況最直接的因素[18]，而青貯原料發(fā)酵的代謝產(chǎn)物會在青貯原料的氣味、質(zhì)地、色澤等有直觀體現(xiàn)，所以通過感官可快速對青貯品質(zhì)的優(yōu)劣做出判斷[19]。CK 組和BL 組在綜合感官評分和青貯發(fā)酵品質(zhì)上略差，而發(fā)酵體系內(nèi)有較多WSC 留存，說明青貯發(fā)酵過程進行不充分，這與青貯體系內(nèi)乳酸菌數(shù)量不足有直接關(guān)系[20]，雖然BL 組添加了植物乳桿菌，但與戊糖片球菌等乳酸菌菌種相比，其在發(fā)酵初始階段不是優(yōu)勢菌群，因此乳酸菌不足限制了該組青貯玉米的發(fā)酵進程及發(fā)酵程度[21]。另外，微生物的發(fā)酵類型及代謝過程也會對青貯發(fā)酵效果產(chǎn)生影響，CK 組和BL 組的菌劑類型均為同型發(fā)酵菌，不同微生物發(fā)酵過程中可能存在底物競爭和生成物抑制，造成發(fā)酵效率下降。而XL 組、HY 組中菌劑類型多樣化，微生物能夠在不同發(fā)酵階段和不同底物條件下進行多類型的生化反應，從而保證發(fā)酵過程的持續(xù)有效進行。

3.2 不同微生物添加劑對玉米青貯營養(yǎng)價值的影響 營養(yǎng)品質(zhì)是評價玉米青貯最重要的指標之一，基于NDF和ADF 進行的RFV 計算，能夠反映出不同粗飼料的相對營養(yǎng)價值。研究證明，NDF 和ADF 含量越低，粗飼料的品質(zhì)越好，對應的RFV 值越高[15]。本試驗中不同微生物添加劑均降低了飼料中NDF 和ADF 含量，使青貯玉米的營養(yǎng)價值得到不同程度提升。HY 組青貯的DM、淀粉含量顯著增加，而CP、EE 含量顯著下降，對應青貯中乳酸和AN 含量也顯著升高，說明該組引起發(fā)酵的微生物中除了有高比例的乳酸菌存在，相應有蛋白分解作用的微生物比例也處在較高水平[22-23]，且復合微生物添加劑中產(chǎn)脘假絲酵母、枯草芽孢桿菌能夠加速粗纖維的分解，增加蛋白質(zhì)的生成，在玉米秸稈、啤酒糟渣生產(chǎn)蛋白飼料上已經(jīng)有廣泛應用[24]，這也是該組青貯具有較高相對飼養(yǎng)價值的主要原因。XL 組和BL組飼料DM 含量顯著下降，這與以往青貯添加劑能夠提高DM 的研究結(jié)果相反，這可能與布氏乳桿菌、戊糖片球菌等在玉米青貯發(fā)酵初期對青貯原料干物質(zhì)強度分解作用有關(guān)。試驗中NDF、ADF、CP 含量與國家二級青貯玉米（NDF≤45%，ADF≤23%，CP≥7%）要求存在較大差異，這可能與玉米品種及種植基地的土壤營養(yǎng)含量有很大關(guān)系。

3.3 不同微生物添加劑對玉米青貯有氧穩(wěn)定性的影響有效保存青貯飼料營養(yǎng)成分，并將青貯過程中營養(yǎng)成分的損耗降到最低，是青貯飼料制作及相關(guān)研究的重點[25]。青貯開窖后，由于表層壓實密度降低和有氧暴露程度增加，酵母、霉菌等好氧微生物開始迅速增殖，吸收并利用青貯料中的乳酸[9]，飼料產(chǎn)熱增加，因此檢測青貯飼料溫度的變化能夠直接反映出飼料的抗腐敗程度[15]。張濤等[26]研究發(fā)現(xiàn)，同型發(fā)酵和異型發(fā)酵菌株的組合能夠提高青貯的有氧穩(wěn)定性，在青貯發(fā)酵后期，pH 降低主要是由異型乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸引起，并且乙酸能夠在布氏乳桿菌厭氧條件下分解成具有超強阻氧作用的1,2-丙二醇，進而提高青貯的有氧穩(wěn)定性[27]；而本試驗中XL 組結(jié)果與此相反，布氏桿菌的添加并沒有增加青貯中乙酸含量，其有氧穩(wěn)定性比其他3 組低25～33 h，這可能與發(fā)酵底物類型和添加劑不同菌群間的互作效應有關(guān)[28]，雖然BL 組pH 在4 組中最低，但較低的乳酸、乙酸比例在有氧條件下無法有效抑制好氧細菌增殖，造成青貯飼料開窖后發(fā)生腐敗。Vendramini等[29]研究發(fā)現(xiàn)，青貯原料滲透壓會隨著DM 含量的增加而顯著上升，高滲透壓能夠降低水活性，從而抑制酵母菌霉菌生長。本試驗中HY 組較高的有氧穩(wěn)定性與青貯飼料的DM 含量有一定關(guān)系，這也是HY 組微生物添加劑在玉米青貯各個階段綜合作用效果的體現(xiàn)。

4 結(jié) 論

微生物青貯添加劑能夠不同程度地改善青貯發(fā)酵與營養(yǎng)品質(zhì)。綜合感官品質(zhì)、發(fā)酵品質(zhì)、營養(yǎng)價值與青貯開窖后有氧穩(wěn)定性，嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)脘假絲酵母組合成的復合微生物添加劑（HY）效果最佳。