武笑天，溫 曌，李銳瑞，白 彥，王 瑞，楊 玉

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801）

葉酸被認(rèn)為是畜禽生長(zhǎng)必須從飼料中獲取的一種B 族維生素，NRC（1994）建議參考蛋雞中葉酸添加水平為0.55 mg/kg，我國(guó)《蛋雞復(fù)合預(yù)混合飼料》（GB/T 22544-2008）建議整個(gè)產(chǎn)蛋期蛋雞葉酸添加量≥0.25 mg/kg。腸道不僅是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要場(chǎng)所，也是保護(hù)機(jī)體不受致病菌影響的重要防線，其健康發(fā)育對(duì)家禽至關(guān)重要。腸道機(jī)械屏障是由腸黏膜上皮細(xì)胞及其緊密連接等組成的完整的腸上皮細(xì)胞[1]。腸道化學(xué)屏障主要是指覆蓋在腸上皮細(xì)胞的黏液層。黏蛋白2（MUC2）是由杯狀細(xì)胞分泌的形成小腸黏液層的主要黏蛋白，可作為評(píng)價(jià)腸道健康狀態(tài)的重要指標(biāo)之一[2]。腸道免疫屏障通過(guò)分泌型免疫球蛋白A（SIgA）等阻止細(xì)菌和毒素侵入[3]。研究表明，葉酸能夠提高畜禽的生產(chǎn)性能[4-6]，對(duì)蛋品質(zhì)無(wú)影響[7-8]。雛雞的生產(chǎn)性能和免疫力隨飼糧葉酸含量的提高而增強(qiáng)，以1.0 mg/kg 時(shí)最高[9]。研究表明添加15 mg/kg 葉酸有提高仔豬血清免疫球蛋白G（IgG）含量的趨勢(shì)[10]。添加150 μg 葉酸能夠提高肉仔雞血清IgG 和免疫球蛋白M（lgM）抗體水平[11]。王寶維等[12]研究表明，4 周齡鵝的飼糧中葉酸水平為1.60 mg/kg 時(shí)，IgG 比對(duì)照組提高了67.33 μg/mL。目前，本課題組研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加葉酸，對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能無(wú)顯著影響，但可以緩解產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋高峰期產(chǎn)蛋率自然下降幅度，顯著提高其抗氧化能力；回歸分析表明，飼料中葉酸的適宜添加量為3.75～6.40 mg/kg（未發(fā)表）。但有關(guān)葉酸對(duì)蛋雞腸道屏障功能的研究還處于空白。本試驗(yàn)旨在研究飼糧中添加不同水平的葉酸對(duì)產(chǎn)蛋高峰期京紅蛋雞血液免疫指標(biāo)及腸道屏障功能的影響，為生產(chǎn)富葉酸雞蛋提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與日糧 試驗(yàn)選擇 648 只30 周齡健康狀況良好、體重相近處于產(chǎn)蛋高峰期的京紅蛋雞，隨機(jī)分成6 處理，每處理6個(gè)重復(fù)，每重復(fù)18只雞。采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別在基礎(chǔ)飼糧中添加1、3、6、12、24 mg/kg 葉酸，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧（葉酸含量為0.35 mg/kg），基礎(chǔ)飼糧參考京紅蛋雞營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際配制，其組成及營(yíng)養(yǎng)成分見表1。葉酸由河北科泰生物科技有限公司提供，其有效成分95.5%～102.0%。試驗(yàn)預(yù)試期2 周，正試期6 周。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.2 飼養(yǎng)管理 采用3 層階梯式籠養(yǎng)，每籠3 只雞，連續(xù)的6 籠為1 個(gè)重復(fù)，各重復(fù)均勻分布于雞舍同行中間2 層。全程粉料飼養(yǎng)，每天光照時(shí)間為16 h，雞舍溫度控制在25℃左右，自由飲水，每天喂食2 次（09:00、15:00），自然通風(fēng)和縱向負(fù)壓通風(fēng)相結(jié)合。其他均按養(yǎng)殖場(chǎng)常規(guī)方法進(jìn)行。

1.3 樣品采集處理與指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 血清生化指標(biāo)測(cè)定 試驗(yàn)期末空腹稱重后，各重復(fù)隨機(jī)選擇1 只雞，每組6 只雞，使用不加抗凝劑的真空采血管翅靜脈采血10 mL，靜置分層，待血清大量析出后，吸取血清于離心管中，3 000 r/min 離心10 min，上清液分裝到多個(gè)0.5 mL 離心管中，-20℃保存待用。送往上海酶聯(lián)生物科技有限公司用ELISA 試劑盒測(cè)定血清中內(nèi)毒素（ET）、二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸（D-LA）、IgA、IgG、IgM 等相關(guān)血清指標(biāo)。

1.3.2 腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)測(cè)定 雞采血后，屠宰分離十二指腸、空腸、回腸，在各腸道中段剪下約1 cm 的腸段，用0.9%的生理鹽水洗凈后放入4%甲醛固定液中固定，固定好的腸組織經(jīng)脫水-石蠟包埋-連續(xù)切片-蘇木精-伊紅染色，采用光學(xué)顯微鏡觀察腸道，并以圖像軟件Image-Pro Plus 軟件測(cè)量絨毛高度（Villus Height，VH）、隱窩深度（Crypt Depth，CD），計(jì)算絨隱比（絨毛高度/隱窩深度，VH/CD），每個(gè)樣本觀察2 個(gè)非連續(xù)切片，每張切片選取3 個(gè)視野，每個(gè)視野分別測(cè)定10 組數(shù)據(jù)，取平均值作為1 個(gè)測(cè)定數(shù)據(jù)。

1.3.3 腸道屏障功能相關(guān)基因表達(dá)量測(cè)定 采用Trizol法分別提取十二指腸、空腸和回腸組織總RNA。用核酸蛋白儀測(cè)定RNA 完整性、濃度和純度。按照TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明合成cDNA，保存于-20℃。以cDNA 為模板，按照SYBR Premix Ex TaqTMII 試劑盒說(shuō)明，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。目標(biāo)基因閉合蛋白-1（Claudin-1）、閉鎖蛋白（Occludin）、閉合小環(huán)蛋白-1（ZO-1）、MUC2、SIgA、TOLL 樣受體4（TLR4）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、白細(xì)胞介素-13（IL-13）基因和內(nèi)參基因β-actin的引物序列見表2，由上海生物工程公司合成引物。采用相對(duì)定量分析法，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

表2 目的基因引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 利用Excel 2010 軟件初步整理數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），用Duncan's 法比較組間差異顯著性，并對(duì)相應(yīng)的數(shù)據(jù)進(jìn)行線性和二次曲線回歸分析。結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）表示。P＜0.05 表示差異顯著，0.05≤P＜0.10 表示有趨勢(shì)，使用Graph Pad Prism 8 軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 葉酸對(duì)產(chǎn)蛋高峰期京紅蛋雞血清免疫球蛋白含量的影響 由表3 可知，飼糧中添加葉酸對(duì)IgG 含量無(wú)顯著影響；6 mg/kg 組IgA 和IgM 含量均高于對(duì)照組（P＜0.05）、1 mg/kg 組（P＜0.05），與12、24 mg/kg組無(wú)顯著差異。IgA 和IgM 含量隨葉酸水平的升高均呈二次曲線反應(yīng)（P＜0.05），其中6 mg/kg 組IgA 和IgM含量最大，分別為212.67、545.21 μg/mL。

表3 飼糧中添加葉酸對(duì)產(chǎn)蛋高峰期京紅蛋雞血清免疫球蛋白含量的影響 μg/mL

2.2 葉酸對(duì)產(chǎn)蛋高峰期京紅蛋雞腸道屏障功能的影響

2.2.1 葉酸對(duì)產(chǎn)蛋高峰期京紅蛋雞腸道組織形態(tài)的影響由表4 可知，6 mg/kg 組十二指腸VH 高于其余各組（P＜0.05）；1、6、24 mg/kg 組空腸VH 高于對(duì)照組、12 mg/kg 組（P＜0.05），6 mg/kg 組空腸VH/CD 高于對(duì)照組、12 mg/kg 組（P＜0.05），而對(duì)其他各組無(wú)影響。飼糧中添加葉酸有增加十二指腸VH/CD 的趨勢(shì)，對(duì)回腸VH、CD 及VH/CD 均無(wú)顯著影響。隨著葉酸水平的升高，十二指腸VH 呈二次曲線反應(yīng)（P=0.066），6 mg/kg 組最大，為1 805.26 μm。

表4 飼糧中添加葉酸對(duì)產(chǎn)蛋高峰期京紅蛋雞腸道組織形態(tài)的影響

2.2.2 葉酸對(duì)產(chǎn)蛋高峰期京紅蛋雞腸道緊密連接蛋白和MUC2mRNA 表達(dá)量的影響 由表5 可知，飼糧中添加6 mg/kg 的葉酸，十二指腸OccludinmRNA表達(dá)量高于對(duì)照組、1、3 mg/kg 組（P＜0.05），ZO-1 mRNA 表達(dá)量高于其余各組（P＜0.05）；飼糧中添加葉酸對(duì)十二指腸Claudin-1 mRNA 表達(dá)量無(wú)顯著影響；3、6mg/kg 組MUC2mRNA 表達(dá)量高于除12 mg/kg 組外的其余各組（P＜0.05）。飼糧中添加葉酸增加了空腸Occludin、Claudin-1、ZO-1、MUC2和回腸Occludin、ZO-1mRNA 表達(dá)量（P＜0.05），其中6 mg/kg 組最高。飼糧中添加葉酸增加了MUC2mRNA 表達(dá)量（P＜0.05），其中12 mg/kg 組最高，添加葉酸有增加回腸Claudin-1mRNA 表達(dá)量的趨勢(shì)（P=0.057）。十二指腸Occludin、Claudin-1、MUC2和空腸Occludin及回腸Occludin、ZO-1、MUC2mRNA 表達(dá)量呈二次曲線反應(yīng)（P＜0.05），其中3 mg/kg 組和12 mg/kg 組十二指腸和回腸MUC2mRNA 表達(dá)量最大，分別為1.54、1.60；其余均以6 mg/kg組最大，分別為1.85、1.49、1.71、1.40、1.91。

表5 飼糧中添加葉酸對(duì)產(chǎn)蛋高峰期京紅蛋雞腸道緊密連接蛋白、MUC2 mRNA 表達(dá)量的影響

2.2.3 葉酸對(duì)產(chǎn)蛋高峰期京紅蛋雞血清DAO 活性、D-LA和ET 含量的影響 由表6 可知，3、6 mg/kg 組的D-LA 濃度低于對(duì)照組、1、24 mg/kg 組（P＜0.05）；6、12 mg/kg 組DAO 濃度低于對(duì)照組、3、24 mg/kg 組（P＜0.05）；12 mg/kg 組ET 濃度低于除6 mg/kg 組的其余各組（P＜0.05）。隨著葉酸水平的升高，D-LA、DAO、ET 濃度均呈二次曲線反應(yīng)（P＜0.05）。其中D-LA、DAO 濃度以 6 mg/kg 組最小，分別為43.63 μmol/mL、14.34 U/mL；ET 濃度以12 mg/kg 組最小，為45.81 ng/mL。

表6 飼糧中添加葉酸對(duì)產(chǎn)蛋高峰期京紅蛋雞血清DAO 活性、D-LA 和ET 含量的影響

2.2.4 葉酸對(duì)產(chǎn)蛋高峰期京紅蛋雞腸道免疫細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)量的影響 由圖1、圖2、圖3 可知，6、12 mg/kg 葉酸組十二指腸和空腸SIgAmRNA 表達(dá)量高于對(duì)照組、1 mg/kg 組（P＜0.05）。6、12、24 mg/kg組十二指腸NF-κBmRNA 表達(dá)量低于對(duì)照組（P＜0.05）；6 mg/kg 組TNF-αmRNA 表達(dá)量低于對(duì)照組、12、24 mg/kg 組（P＜0.05）；飼糧中添加葉酸降低了十二指腸TLR4mRNA 表達(dá)量（P＜0.05）、增加了IL-10 和IL-13 mRNA 表達(dá)量（P＜0.05）。飼糧中添加葉酸降低了空腸TLR4、NF-κBmRNA 表達(dá)量（P＜0.05），增加了IL-10 mRNA 表達(dá)量（P＜0.05）；3 mg/kg 和6 mg/kg組IL-1βmRNA 表達(dá)量低于其余各組（P＜0.05）。飼糧中添加葉酸降低了回腸TNF-αmRNA 表達(dá)量（P＜0.05），降低了除24 mg/kg組外的TLR4mRNA表達(dá)量（P＜0.05）；3、6、12 mg/kg 組IL-13 mRNA 表達(dá)量高于對(duì)照組（P＜0.05）。

圖1 飼糧中添加葉酸對(duì)產(chǎn)蛋高峰期京紅蛋雞十二指腸免疫細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)量的影響

圖2 飼糧中添加葉酸對(duì)產(chǎn)蛋高峰期京紅蛋雞空腸免疫細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)量的影響

圖3 飼糧中添加葉酸對(duì)產(chǎn)蛋高峰期京紅蛋雞回腸免疫細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)量的影響

3 討 論

3.1 葉酸對(duì)產(chǎn)蛋高峰期京紅蛋雞血清免疫球蛋白含量的影響 IgA、IgG 和IgM 主要由B 淋巴細(xì)胞分泌，在體液免疫中起著重要作用。因此，免疫球蛋白水平的高低是動(dòng)物機(jī)體免疫功能的重要標(biāo)志[13]。添加葉酸能增加嘌呤和嘧啶含量，加快DNA 和RNA 合成，與維生素B12、維生素C 共同參與紅細(xì)胞和血紅蛋白的生成，促進(jìn)了免疫球蛋白的生成。Erickson 等[14]研究表明，葉酸可以參與細(xì)胞先天性免疫，增加免疫器官重量，調(diào)控機(jī)體的內(nèi)分泌水平，從而影響其免疫性能。葛文霞等[15-16]研究證實(shí)，葉酸水平為3.0 mg/kg 時(shí)21 日齡肉仔雞血清中IgG含量顯著提高，IgA 和IgM 沒有顯著變化。本試驗(yàn)結(jié)果

表明，6 mg/kg 葉酸可顯著增加蛋雞血清中IgA 和IgM含量，卻對(duì)IgG 無(wú)顯著影響，與葛文霞等[15-16]的研究結(jié)果不一致，推測(cè)其原因可能與雞種、雞體所處生理狀態(tài)不同有關(guān)。由于母源IgG 可通過(guò)卵黃直接補(bǔ)充，所以雛禽在出殼后3～5 d 內(nèi)始終保持較高的IgG 水平，直到7 日齡左右開始下降，20～22 日齡后基本檢測(cè)不到，這使雛禽在自身免疫系統(tǒng)健全以前也可以得到有效保護(hù)，且禽類各種免疫球蛋白在種系進(jìn)化和個(gè)體發(fā)育中出現(xiàn)的時(shí)間不同。

3.2 葉酸對(duì)產(chǎn)蛋高峰期京紅蛋雞腸道屏障功能的影響

3.2.1 葉酸對(duì)產(chǎn)蛋高峰期京紅蛋雞腸道組織形態(tài)的影響小腸是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的主要器官，也是機(jī)體防御體系的第一道屏障，在維持腸道正常營(yíng)養(yǎng)代謝和腸道屏障功能等方面發(fā)揮著重要作用[17-18]。腸道黏膜作為家禽機(jī)體最重要的黏膜系統(tǒng)，其形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的完整性是維護(hù)腸道健康的有效屏障[19]。當(dāng)VH/CD 增加，腸道吸收功能和消化功能增強(qiáng)，腸道黏膜屏障功能得到明顯改善。本試驗(yàn)中，6 mg/kg 葉酸可顯著增加十二指腸VH、空腸VH 和VH/CD，說(shuō)明飼糧中適宜添加水平的葉酸有利于促進(jìn)蛋雞腸道發(fā)育。其主要原因?yàn)椋喝~酸參與嘌呤環(huán)和脫氧核苷酸的生物合成，具有促進(jìn)核酸生物合成的作用；葉酸作為一碳單位的載體，促進(jìn)碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝；葉酸能夠提供甲基給甲基受體，使甲基受體成為甲基衍生物。

3.2.2 葉酸對(duì)產(chǎn)蛋高峰期京紅蛋雞腸道緊密連接蛋白、MUC2mRNA 表達(dá)量及腸道通透性的影響 腸道屏障的完整性能防止腸道微生物中的病原體和有害物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)，同時(shí)也能維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。大量研究表明，腸道機(jī)械屏障的損傷與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展息息相關(guān)[20-21]。緊密連接Claudin-1、Occludin、ZO-1 是腸道黏膜機(jī)械屏障的關(guān)鍵組成部分[22]，可以調(diào)節(jié)腸道屏障通透性，防止細(xì)菌和毒性大分子物質(zhì)進(jìn)入身體。MUC2 和Claudin-1是重要的腸上皮屏障組分，可防止有害物質(zhì)到達(dá)腸上皮表面，抵御病毒和病原菌入侵。當(dāng)家禽的腸黏膜緊密連接結(jié)構(gòu)被破壞時(shí)，腸道通透性增大[23]，血液中ET和D-LA 含量增加[24]，DAO 活性提高，因此，血液中DAO 水平可反映腸道損傷和修復(fù)情況[25]。葉酸能一定程度上降低腸道有害菌數(shù)量、優(yōu)化腸道菌群[26]，降低腸道內(nèi)毒素含量，使腸黏膜受損幾率降低，防止腸上皮釋放大量的DAO 進(jìn)入血液。目前仍未見葉酸影響家禽腸道通透性的研究。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼糧中添加6 mg/kg 和12 mg/kg 葉酸顯著增加了十二指腸、空腸和回腸Occludin、ZO-1、MUC2mRNA 表達(dá)量，顯著降低了血清ET 含量和DAO 活性，提示適量葉酸可以有效降低腸道通透性，改善家禽腸道黏膜損傷，抑制由于腸道通透性的增加而導(dǎo)致的內(nèi)毒素移位，具體機(jī)制有待研究。

3.2.3 葉酸對(duì)產(chǎn)蛋高峰期京紅蛋腸道免疫屏障細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)量的影響 腸道功能和通透性受免疫球蛋白和多種細(xì)胞因子的影響，這些炎性介質(zhì)可能進(jìn)入血液，然后作用于腸黏膜上皮細(xì)胞并影響腸道完整性和功能[27]。TLR4 能夠調(diào)節(jié)促炎因子IL-1β的分泌，還能通過(guò)誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的交互作用提高抗炎因子IL-10的表達(dá)[28]，IL-1β和TNF-α能夠通過(guò)影響腸上皮細(xì)胞完整性和腸道通透性增加[29]。IL-10 不僅能抑制TLR4、NF-κB 炎癥信號(hào)反應(yīng)，還能維持腸道屏障功能[30]。IL-13 能夠在體內(nèi)抑制活化的T 細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生。SIgA 和細(xì)胞因子等是構(gòu)成腸道免疫屏障的主要組成成分[31]。腸道炎癥反應(yīng)主要受細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)，TIR4/NF-κB 信號(hào)通路可調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，但在家禽體內(nèi)葉酸是否通過(guò)TIR4/NF-κB 信號(hào)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)未見報(bào)道。本研究表明，6 和12 mg/kg 組葉酸顯著降低了十二指腸TLR4、NF-κB、TNF-α及回腸TLR4、TNF-αmRNA表達(dá)量，顯著增加了十二指腸SIgA、IL-10、IL-13 和回腸IL-13 mRNA 表達(dá)量；添加3、6 mg/kg 葉酸顯著降低了空腸TLR4、NF-κB、IL-1βmRNA 表達(dá)量，顯著增加了IL-10 mRNA 表達(dá)量，表明添加適量葉酸能夠減少促炎性細(xì)胞因子的合成量，減緩腸道中的炎性反應(yīng)，保護(hù)腸道發(fā)育，且以6 mg/kg 較好。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，日糧中添加6 mg/kg 葉酸提高產(chǎn)蛋雞血清免疫球蛋白IgA 和IgM 含量，降低D-LA、ET 含量及DAO 活性；改善十二指腸和空腸的黏膜形態(tài)，增加小腸Occludin、ZO-1、MUC2以及十二指腸中SIgAmRNA 的表達(dá)；通過(guò)抑制TLR4/NF-κB炎癥信號(hào)通路，進(jìn)而抑制促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，提高抗炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)而改善了腸道的屏障功能。