王彥虎，張柳明，褚長江，馬金亮，馮云奎，郭裕嬌，龔常亮，李擁軍

（揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇省動物遺傳繁育與分子設(shè)計重點實驗室，江蘇揚州 225009）

受精液保存技術(shù)限制，目前綿羊精液仍以液態(tài)（4℃）保存的方式為主。綿羊精液冷凍-解凍過程會造成精子生化和超微結(jié)構(gòu)損傷，導(dǎo)致受精能力下降。綿羊精子頂體膜和原生質(zhì)相比運動器（中段）對超低溫更加敏感，頂體的外膜比內(nèi)膜更易受到損傷[1]。因此，研究綿羊精液的液態(tài)保存對于綿羊的人工授精具有重要意義。

精液稀釋液組成決定著精液保存的效果[2]。在精液保存過程中，精子質(zhì)膜中含有較多不飽和脂肪酸，精子代謝產(chǎn)生的活性氧（ROS）會對精子造成氧化損傷[3]。在精液保存稀釋液中添加抗氧化劑是減少氧化損傷的主要途徑之一[4]。已有研究發(fā)現(xiàn)，BSA 在精液保存過程中可以有效地提高精子活力，維持精子質(zhì)膜完整性，能明顯改善羊精液低溫保存效果[5]。BSA 對精子保護的可能機理：①有效去除精子膜中的部分膽固醇和鋅，改變精子膜的脂肪含量，增強精子膜的穩(wěn)定性[6]；②有效中和精子及細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，起緩沖和抗氧化作用[7]；③作為多種哺乳動物精子的獲能物質(zhì)，可能防止精子質(zhì)膜黏連[8]。然而，目前尚未有BSA 對湖羊精液4℃保存效果的研究。因此，本實驗旨在評價在精液稀釋液中添加不同濃度的BSA 對湖羊精液低溫保存效果的影響，并為湖羊精液低溫保存和人工授精技術(shù)的廣泛應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑 Tris、無水檸檬酸和D-果糖購自生工生物工程（上海）股份有限公司；牛血清白蛋白購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 精液稀釋液的配制 準(zhǔn)確稱取Tris 3.07 g、果糖2 g、檸檬酸1.64 g、青霉素鈉5 萬 IU、鏈霉素硫酸鹽5 萬 IU、蒸餾水90 mL，加入不同濃度（0、1、2、3、4、5、6 g/L）的BSA，充分震蕩、搖勻，使其完全溶解，最后用0.22 μm的濾器過濾備用，卵黃添加濃度為10%。

1.3 精液采集及檢測 試驗精液來源于揚州大學(xué)實驗羊場的3 只1～2 歲、體況良好無生殖道疾病的健康湖羊。假陰道法采集精液，置于37℃保溫杯中0.5 h 內(nèi)帶回實驗室進行檢測，精液為乳白色，氣味略帶腥味，精子活力保證在0.8 以上，密度適中。將3 份合格精液混合均勻與稀釋液按照1:10 的比例進行稀釋，包裹8 層棉布后放入4℃冰箱，之后每隔24 h 對精子的活率、活力、質(zhì)膜完整率和頂體完整率進行檢測。

1.4 精子質(zhì)量檢測 采用邁朗全自動精子分析系統(tǒng)（CASA）（南寧松景天倫生物科技有限公司）進行精子活率、活力的檢測；低滲試驗進行質(zhì)膜完整性檢測；考馬斯亮藍染法對精子進行染色鏡檢。

1.5 統(tǒng)計分析 采用Excel 2019 對實驗數(shù)據(jù)進行整理，采用IBM SPSS Statistics 24 進行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05 為差異顯著，P＞0.05 為差異不顯著，結(jié)果以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 在低溫保存下不同濃度BSA 對湖羊精子活率的影響由表1 可知，隨著BSA 濃度的增加，湖羊精子活率呈先上升后下降的趨勢。保存24～96 h 時，2～3 g/L BSA組的精子活率顯著高于對照組；120 h 時，3 g/L BSA組的精子活率顯著高于其他組；隨著精液保存時間的延長，3 g/L BSA 組的精子活率最高，6 g/L BSA 組的精子活率低于對照組。

表1 低溫保存下不同濃度BSA 對湖羊精子活率的影響 %

2.2 在低溫保存下不同濃度BSA 對湖羊精子活力的影響由表2 可知，隨著BSA 濃度的增加，湖羊精子活力也呈先上升后下降的趨勢，適宜濃度的BSA 可以有效提高精子活力。在保存72～96 h 時，2～3 g/L BSA 組的精子活力較對照組有顯著提高，6 g/L BSA 組精子活力低于對照組；24～120 h，3 g/L BSA 可以顯著提高湖羊精子活力；隨著精液保存時間的延長，3 g/L BSA 效果最佳。

表2 低溫保存下不同濃度BSA 對湖羊精子活力的影響 %

2.3 在低溫保存下不同濃度BSA 對湖羊精子質(zhì)膜完整率的影響 鏡檢時A、B 類為質(zhì)膜完整的精子，C 類為質(zhì)膜不完整的精子（圖1）。由表3 可知，不同濃度的BSA 對湖羊精子質(zhì)膜完整率呈先上升后下降的趨勢。24 h，3 g/L BSA 組的精子質(zhì)膜完整率顯著高于對照組；48～72 h 時，1～4 g/L BSA 組的精子質(zhì)膜完整率顯著高于對照組；96 h 時，2～3 g/L BSA 組的精子質(zhì)膜完整率顯著高于對照組，3 g/L BSA 組最高；96～120 h 時，6 g/L BSA 組的精子質(zhì)膜完整率低于對照組。

表3 低溫保存下不同濃度BSA 對湖羊精子質(zhì)膜完整率的影響 %

圖1 低滲試驗精子卷尾形態(tài)

2.4 在低溫保存下不同濃度BSA 對湖羊精子頂體完整率的影響 鏡檢時D 類為頂體損傷的精子，E 類為頂體完整的精子（圖2）。由表4 可知，0～24 h 時，各組的頂體完整率沒有顯著差異；48～72 h 時，4 g/L BSA 組頂體完整率顯著高于對照組；96～120 h 時，3 g/L BSA組精子頂體完整性顯著高于對照組；隨著湖羊精液低溫保存時間的延長，精子頂體完整率下降速度較緩慢且完整率較高。

表4 低溫保存下不同濃度BSA 對湖羊精子頂體完整率的影響 %

圖2 考馬斯亮藍染色精子頂體形態(tài)

2.5 在低溫保存下不同濃度BSA 對湖羊精子運動性能的影響 由表5 可知，24 h 時，添加BSA 組的直線速率、曲線速率和路徑速率均高于對照組，120 h 時，3 g/L BSA 組的直線速率、曲線速率和路徑速率最高。

表5 在低溫保存下不同濃度BSA 對湖羊精子運動性能的影響

3 討 論

精液保存對于綿羊的人工授精非常重要，精子活力是人工授精的重要指標(biāo)之一。本實驗結(jié)果表明，除0 h外，在精液保存24～120 h，3 g/L BSA 組的精子活率、活力顯著高于對照組。BSA 在不同物種的精液保存中作用效果不同。有研究發(fā)現(xiàn)，6% BSA 對山羊精液的冷凍保存具有一定保護作用[9]，4 g/L BSA 對豬精液常溫保存效果最佳[10]，20 g/L BSA 可顯著提高了冷凍后精子的活力和質(zhì)膜完整性[11]。劉文江等[12]研究發(fā)現(xiàn)，4 g/L BSA 對常溫保存的山羊精子有損傷作用。直線速率、曲線速率和路徑速率也是評價精子質(zhì)量的重要指標(biāo)，其與精子活率、活力呈正相關(guān)[13]。本研究中，1～5 g/L BSA 可以提高湖羊精液低溫保存的精子運動性能，6 g/L BSA 對湖羊精子有損傷作用。本研究結(jié)果的不同可能是由于畜種、保存溫度及精液稀釋液的不同所引起。

質(zhì)膜完整性與精子活力密切相關(guān)，維持精子質(zhì)膜完整性對精子的新陳代謝、受精和獲能具有重要意義[14]。BSA 是膜的穩(wěn)定劑。Sar??zkan 等[15]報道，BSA 在 兔精液低溫保存中能顯著提高精子質(zhì)膜完整性。精子質(zhì)膜中含有豐富的不飽和脂肪酸，其氧化會產(chǎn)生過量的自由基，維持自由基的平衡是精液保存的重要目標(biāo)，過多的ROS 會對精子造成氧化損傷。Van 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，BSA 能夠很好地消除自由基對精子的損傷作用，保護DNA 的完整性。BSA 能夠減少精液中丙二醛的產(chǎn)生，減弱因過氧化對精子質(zhì)膜的損傷[17-18]。本研究中，1～5 g/L BSA 可以提高精子質(zhì)膜完整性，6 g/L BSA 在24 h 對精子質(zhì)膜具有保護作用，但之后對精子有明顯的損傷作用。頂體也是精子重要的結(jié)構(gòu)，精子頂體中含有透明質(zhì)酸酶，其對于精子穿過透明帶具有重要作用。BSA 作為一種膜的穩(wěn)定劑主要維持精子膜的穩(wěn)定，其對精子頂體完整性沒有顯著作用。劉玉等[19]研究發(fā)現(xiàn)，3～5 g/L BSA 可以顯著提高豬精液常溫保存的精子活率、保存時間和質(zhì)膜完整性，但對精子頂體完整性無顯著性提高。昝林森等[20]等發(fā)現(xiàn)BSA 對精子頂體完整性無顯著作用，本研究結(jié)果與其相一致。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，稀釋液中添加1～5 g/L BSA 能夠提高湖羊精液低溫保存的精子活率、活力和質(zhì)膜完整性，其中3 g/L BSA 的作用效果最佳。