廖朝美，吳 磊，游敏芳，譚光輝，李杰章，張依裕*

（1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州貴陽 550025；2.安順市立華牧業(yè)有限公司，貴州安順 561000）

蛋殼基質(zhì)蛋白卵白蛋白-116（Ovocleidin-116，OC-116）是一種硫酸軟骨素蛋白多糖，在蛋殼的柵欄層、乳頭層、角質(zhì)層都有分布，是禽蛋殼中特異性的基質(zhì)蛋白，主要參與蛋殼形成[1]。OC-116作為禽蛋殼中含量較多的有機基質(zhì)組分，能在子宮細胞中表達，但其表達具有時間特異性，只有在蛋殼鈣化時才能檢測到OC-116的mRNA[2]。蛋殼由95%的方解石碳酸鈣礦物和3.5%的有機基質(zhì)蛋白質(zhì)組成[3]。從無定形碳酸鈣顆粒到方解石晶體的轉(zhuǎn)變，稱之為蛋殼鈣化，是由子宮中的基質(zhì)蛋白促進的[4-5]。Chen 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)子宮中OC-116表達減少，蛋殼的形成過程會受到抑制，鈣的供應(yīng)和運輸、外膜的形成和方解石晶體的鈣化也會受到影響?？梢姡琌C-116能通過調(diào)控蛋殼的鈣化來調(diào)控雞子宮上皮細胞的Ca2+濃度。而Ca2+信號傳導(dǎo)和脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域之間有相互作用，Ca2+能改變脂質(zhì)代謝[7]。王麗等[8]研究發(fā)現(xiàn)，鈣有抗肥胖的作用，與添加1.4 %鈣濃度日糧相比，飼喂鈣濃度為2.8%的日糧后，小鼠體重和血脂會有顯著下降，因為補充鈣能提高小鼠血清和組織中的鈣含量，從而促使脂肪酶的活性降低。目前，鈣與脂之間的調(diào)控關(guān)系研究較為廣泛，但關(guān)于OC-116基因過表達量影響雞子宮中Ca2+含量與脂質(zhì)的研究鮮有報道。本研究通過構(gòu)建pcDNA3.1（+）+OC-116+Flag 表達載體，轉(zhuǎn)染雞子宮上皮細胞，測其基因表達量、Ca2+濃度和脂質(zhì)指標，然后進行三者的相關(guān)性分析，為深入闡釋雞子宮上皮細胞中鈣和脂質(zhì)的分泌路徑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 本實驗選用的45 周齡長順綠殼蛋雞來源于貴州大學(xué)家禽研究所科研雞場，取其子宮用來分離培養(yǎng)雞子宮上皮細胞。

1.2 主要試劑 抗支原體試劑、紅細胞裂解液和胎牛血清（FBS）購自Gibco 公司；膠回收試劑盒、pEGFP-N3 載體、pCDNA3.1（+）空載體、無類毒素質(zhì)粒提取試劑盒、平端連接酶（T4）、Kpn1和EcoRI快切酶購自大連TaKaRa 公司；FLUO-3/AM、TC、TCHO、LDL 和HDL 檢測試劑盒購自南京建成生物工程有限公司；Flag 標簽檢測試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司；Flag 標簽ELISA 檢測試劑盒購自貴州西寶生物有限公司；OPTI-MEM、胰酶、DMEM 高糖培養(yǎng)基以及其他常規(guī)試劑購自上海生工生物工程有限公司；膠原酶IV、氯仿由貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院試劑采購中心訂購。

1.3 實驗方法

1.3.1 雞子宮上皮細胞的分離培養(yǎng) 取產(chǎn)蛋高峰期的長順綠殼蛋雞3 只，屠宰放血后，在無菌條件下取出子宮部，參照李錳等[9]操作步驟，首先將子宮置于含有5×雙抗的HBSS 浸泡后，漂洗3～6 次，同時剔除子宮表面的薄膜和血管并剪碎子宮，然后加入0.2%膠原酶IV后置于37℃水浴鍋中消化1 h，加入等體積含血清的培養(yǎng)基進行終止消化，用400 目和200 目細胞過濾篩過濾，將濾液以1 200 r/min 離心10 min，去上清，加入完全培養(yǎng)基DMEM/F12 反復(fù)清洗吹打，均勻滴加在六孔板中，加入完全培養(yǎng)基后放入5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)基，并用倒置熒光顯微鏡觀察細胞，拍照記錄細胞生長狀態(tài)。

1.3.2 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)雞OC-116基因mRNA序列（GenBank 登錄號：NM_204569.1），設(shè)計1 對特異性引物（表1），擴增OC-116基因的CDS 區(qū)，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 OC-116 基因真核表達載體引物設(shè)計

1.3.3 總RNA 提取及RT-PCR 擴增 將提取的雞子宮經(jīng)Trizol 法提取總RNA，根據(jù)cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-80℃保存。根據(jù)設(shè)計的特異性引物，以CDS 為模板對OC-116基因進行PCR 擴增，PCR 反應(yīng)體系為50 μL：Ex Taq 5 μL，上、下游引物（10 pmol/μL）各0.5 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O 補充至50 μL。擴增程序：95℃預(yù)變性6 min，95℃變性40 s，62℃退火30 s，72.0℃延伸60 s，共26 個循環(huán)，72℃終延伸2 min，4℃保存。

1.3.4 真核表達載體構(gòu)建 用膠回收試劑盒將PCR 產(chǎn)物進行膠回收，純化后連接pUCm-T 載體，KpnI/EcoRI處理pCDNA3.1（+）質(zhì)粒，選取相同黏性末端目的片段連接到pcDNA3.1（+）載體上，構(gòu)建得到pcDNA3.1（+）+OC-116+Flag 真核表達載體，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α進行培養(yǎng)，挑取陽性菌落進行菌落PCR，獲得質(zhì)粒DNA，最后進行測序驗證和雙酶切驗證。

1.3.5 轉(zhuǎn)染子宮上皮細胞 將培養(yǎng)的細胞濃度調(diào)整為1×106個/mL 后，參照Lipofectamine?3000 說明書進行轉(zhuǎn)染，實驗共設(shè)6 個實驗組和6 個空白對照組，每個實驗組設(shè)3 個重復(fù)，OC-116+pcDNA3.1（+）+Flag 和PEGFP-N3 共轉(zhuǎn)染為實驗組，轉(zhuǎn)染等體積蒸餾水為空白對照組，轉(zhuǎn)染達到48 h 后，在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。

1.3.6 子宮上皮細胞內(nèi)Ca2+濃度測定 轉(zhuǎn)染48 h 后，用胰蛋白酶消化細胞懸液，將細胞濃度調(diào)整為1×106個/mL，用Fluo-3/AM 探針法測定子宮上皮細胞Ca2+濃度，酶標儀檢測熒光強度，計算得出子宮上皮細胞內(nèi)Ca2+濃度，計算公式為：[Ca2+]i=Kd*F/F0，其中F 為表達載體的熒光值，F(xiàn)0 為對照組的熒光值，Kd 為熒光劑與Ca2+形成復(fù)合物的解離常數(shù)，Kd=400 nmol/L。

1.3.7 基因表達量和脂質(zhì)指標的檢測 用Flag 標簽檢測試劑盒檢測OC-116基因表達量，分別用TG、TCHO、HDL 和LDL 脂質(zhì)指標試劑盒檢測長順綠殼蛋雞子宮上皮細胞各脂質(zhì)指標含量。

1.4 統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2018 統(tǒng)計分析，通過SPSS 22.0 軟件中的一般線性模型（Genera Lized Linear Models,GLM）單因素方差分析方法和相關(guān)模型雙變量分析方法對實驗數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)值用“平均值± 標準誤”表示。P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 真核表達載體的構(gòu)建 將構(gòu)建的攜帶pcDNA3.1 的真核表達載體進行雙酶切和測序驗證，由圖1-2 可知，酶切條帶符合預(yù)期片段大小，約為2 232 bp，測序驗證圖顯示測序片段與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的OC-116基因CDS 序列完全匹配，沒有缺失、增添和移碼突變的情況出現(xiàn)。

圖1 OC-116 基因真核表達載體雙酶切結(jié)果圖

圖2 OC-116 基因真核表達載體測序驗證結(jié)果圖

2.2 子宮上皮細胞形態(tài)學(xué)觀察 長順綠殼蛋雞子宮上皮細胞在顯微鏡下觀察可見細胞呈圓形且量較多，達1×106個/mL 以上，繼續(xù)培養(yǎng)至18 h，在倒置顯微鏡下觀察到細胞開始貼壁分裂成團生長（圖3-B），培養(yǎng)到48 h，貼壁的細胞開始朝著不規(guī)則的形態(tài)大面積生長（圖3-C），培養(yǎng)到96 h，細胞大面積生長且形態(tài)規(guī)則，細胞核較大，細胞間緊密相連，間隙清晰，細胞達到80%的融合度，此時可進行細胞轉(zhuǎn)染（圖3-D、3-E、3-F）。

圖3 長順綠殼蛋雞子宮上皮細胞分離及生長狀態(tài)圖

2.3 真核表達載體轉(zhuǎn)染結(jié)果 pcDNA3.1（+）+OC-116+Flag 與PEGFP-N3 共轉(zhuǎn)染效果見圖4，pEGFP-N3能正常發(fā)出熒光，說明轉(zhuǎn)染成功，也說明pcDNA3.1（+）+OC-116+Flag 能夠在同一條件下成功轉(zhuǎn)染到雞子宮上皮細胞。

圖4 OC-116+pcDNA3.1（+）+Flag 與PEGFP-N3共轉(zhuǎn)染熒光圖（100×）

2.4 Ca2+熒光負載檢測 由圖5 可見，在熒光顯微鏡下可觀察到綠色的明亮熒光，表明Ca2+染色成功。

圖5 Ca2+富集熒光圖（100×）

2.5 雞OC-116基因過表達與子宮上皮細胞內(nèi)Ca2+濃度及脂質(zhì)指標的相關(guān)性 由表2 可知，HDL 隨表達量增加而降低，其他指標隨OC-116基因過表達增高不呈規(guī)律性變化；通過Flag 標簽檢測OC-116基因在空白對照組的過表達量為0，脂質(zhì)指標LDL 和HDL 平均濃度低于對照組，TCHO 和TG 高于對照組。由表3 可知，OC-116基因過表達量與Ca2+呈顯著正相關(guān)，與HDL呈極顯著正相關(guān)，與TCHO 和LDL 呈顯著負相關(guān)；Ca2+與HDL 呈極顯著正相關(guān)；LDL 與HDL 呈極顯著負相關(guān)，其他指標間無相關(guān)性。

表2 OC-116 真核表達載體在長順綠殼蛋雞子宮上皮細胞表達量及脂質(zhì)含量

表3 OC-116 基因過表達量及其與脂質(zhì)指標和Ca2+的相關(guān)性分析

3 討 論

OC-116是一種與生物鈣化緊密關(guān)聯(lián)的蛋殼基質(zhì)蛋白，是雞蛋殼基質(zhì)的主要成分，在雞體內(nèi)發(fā)生生物鈣化的組織器官中都有廣泛分布，尤其在蛋殼鈣化強烈期子宮液中含量最多[10-11]。OC-116能夠影響蛋殼表面有機基質(zhì)的形成，在控制蛋殼鈣化過程中起主要作用[12]。蛋殼鈣化需要許多過程的相互作用，包括細胞外和細胞旁Ca2+的轉(zhuǎn)運和基質(zhì)蛋白的分泌[13]。Marie 等[14]研究證實蛋殼基質(zhì)蛋白能調(diào)控蛋殼腺內(nèi)的Ca2+運輸，并且調(diào)控蛋殼的紋理和超微結(jié)構(gòu)而影響礦化過程。本研究發(fā)現(xiàn)OC-116基因過表達量與Ca2+呈顯著正相關(guān)，表明OC-116基因能促進Ca2+的釋放，推測可能與OC-116能顯著影響蛋殼表面有機層的沉積、OC-116增加會使蛋殼鈣化過程適當(dāng)延長、子宮中Ca2+含量會相對增加有關(guān)[15-16]?？梢?，OC-116活性在雞的子宮上皮細胞中與Ca2+含量有著密切的調(diào)控關(guān)系。

Ca2+可以促進脂肪合成，抑制脂肪分解，在脂肪細胞代謝中起著重要作用，當(dāng)Ca2+濃度增加時，脂肪酸的合成代謝會加快[17]。本研究發(fā)現(xiàn)OC-116基因過表達量與HDL 呈極顯著正相關(guān)，與TCHO 和LDL 呈顯著負相關(guān)，Ca2+與HDL 呈極顯著正相關(guān)，LDL 與HDL呈極顯著負相關(guān)。表明OC-116基因可能通過調(diào)控子宮上皮細胞的Ca2+來影響脂質(zhì)的合成轉(zhuǎn)運。郭玉婷等[18]研究表明Ca2+可能會通過調(diào)控脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)中與脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因來影響脂質(zhì)的合成與轉(zhuǎn)運。王麗[8]等研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠日糧中添加鈣能顯著減少小鼠增重，降低血清TG 和TCHO 水平，提高HDL-C 水平，同時伴隨著脂肪組織和肝臟減重。Kawashima 等[19]研究證實了Ca2+濃度增加會促進VLDL-C 和LDL-C 被脂蛋白脂肪酶（Lipoprotin lipase，LPL）水解，這與本研究結(jié)果大致相符。本研究通過測量OC-116基因過表達量與雞子宮上皮細胞Ca2+濃度和脂質(zhì)的參數(shù)，證實了OC-116基因過表達能夠調(diào)控雞子宮上皮細胞Ca2+濃度和脂質(zhì)合成代謝，為深入闡釋雞子宮上皮細胞中鈣和脂質(zhì)的分泌路徑提供理論基礎(chǔ)，也為該基因在雞的研究與運用上奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了pcDNA3.1（+）+OC-116+Flag真核表達載體，并成功共轉(zhuǎn)染雞子宮上皮細胞，分別檢測了OC-116基因過表達量、鈣離子濃度和脂質(zhì)指標。結(jié)果顯示，OC-116基因在空白對照組的過表達量為0，脂質(zhì)指標LDL 和HDL 平均濃度低于對照組，TCHO 和TG 高于對照組，Ca2+濃度高于對照組。相關(guān)性分析顯示，OC-116基因過表達量與Ca2+呈顯著正相關(guān)，與HDL呈極顯著正相關(guān)，與TC 和LDL 呈顯著負相關(guān)，Ca2+與HDL 呈極顯著正相關(guān)，LDL 與HDL 呈極顯著負相關(guān)，進一步說明了OC-116基因過表達能夠調(diào)控雞子宮上皮細胞鈣離子含量和脂質(zhì)的合成代謝。