石福岳，王燕燕，容維中*，高 博，徐建峰，董 和，張艷麗

（1.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅平?jīng)?744000；2.平?jīng)鍪修r(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測檢驗中心，甘肅平?jīng)?744000）

鈣蛋白酶（Calpain）屬于半胱氨酸內(nèi)肽酶類，在所有類型的動物細胞中都有存在，其活性取決于細胞內(nèi)Ca2+的濃度。依據(jù)激活其所需的Ca2+濃度不同，將鈣蛋白酶分為m-calpain 和μ-calpain 2 種[1]。肌肉細胞中鈣蛋白酶的活性與宰后肌原纖維蛋白及細胞骨架蛋白水解有關(guān)[2～3]，高活性的μ-calpain 會促進屠宰后肌肉的成熟、增加嫩度和引起質(zhì)地紋理的變化等[4-5]。為探究編碼μ-calpain 大亞基的CAPN1基因結(jié)構(gòu)變化對家畜肉品質(zhì)的影響，一些學者進行了相關(guān)研究。姜成國[6]等在草原紅牛、延邊黃牛CAPN1基因內(nèi)含子14 的4 685 bp處檢測到C→T 突變，且該變異與肉嫩度、眼肌面積等肉質(zhì)指標密切相關(guān)。田璐[7]等研究發(fā)現(xiàn)，中國西門塔爾牛CAPN1基因外顯子9 和內(nèi)含子17 上分別存在C316G 和C4751T 2 個多態(tài)位點，且對肉牛大理石花紋和剪切力有顯著影響。華金玲[8]等在皖東牛CAPN1基因內(nèi)含子8、外顯子9 和內(nèi)含子9 上共檢測到4 個多態(tài)位點，且與肉質(zhì)性狀中的剪切力顯著相關(guān)。因此，CAPN1基因被認為是與肉品質(zhì)性狀相關(guān)的候選基因[9-11]。

早勝牛是甘肅省優(yōu)良的地方品種，其發(fā)展歷史悠久，具有生長速度快、抗逆性強、適應(yīng)性好等優(yōu)點。近年來，早勝牛正處于由役用向役肉兼用型及肉用型轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵時期[12]，但由于長期以來缺乏科學有效的選育方法，部分地區(qū)盲目引種雜交，造成早勝牛部分優(yōu)良基因丟失、血統(tǒng)不純，選育進程緩慢。因此，采用分子標記輔助選擇技術(shù)研究與其肉用性能相關(guān)的分子標記位點可加快其向肉用方向轉(zhuǎn)變的育種進程。本研究采用直接測序法分析CAPN1基因外顯子21 至外顯子22 區(qū)域內(nèi)的SNPs，進一步分析與肉質(zhì)性狀相關(guān)的單倍型，為加快肉用型早勝牛選育進程提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 本實驗選擇的早勝牛來自慶陽市寧縣富春早勝肉牛調(diào)運中心和寧縣康壯肉牛養(yǎng)殖場。選取320 頭牛（公牛40 頭，母牛280 頭），每頭牛采集血樣7 mL，置于含有EDTA 抗凝劑的采血管中，搖勻后-20℃冷凍保存?zhèn)溆?。選擇1.5 歲公牛21 頭，屠宰后采集背最長肌樣品，保存于-20℃，用于測定其肉品質(zhì)。

1.1.2 主要試劑 本實驗所用的瓊脂糖、無水乙醇、DL1000 Marker 等試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司，D3392-01 型全血DNA 提取試劑盒購自O(shè)mega Bio-Tek 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA 提取 采用OMEGA 全血DNA 提取試劑盒D3392-01，按照說明書要求提取基因組DNA。提取完成后用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度，使用NanoDrop ND-1000 濃度測定儀測定OD260/OD280值，于-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計 參考GenBank 數(shù)據(jù)庫中牛的CAPN1基因DNA 序列（登錄號：AH009246）設(shè)計2 對引物，用于擴增CAPN1基因外顯子21 至外顯子22，引物序列信息見表1。引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成，用去離子水溶解并使其濃度達到10 pmol/μL。

表1 引物信息表

1.2.3 PCR 擴增 以DNA 為模板進行PCR 擴增，反應(yīng)體系為25 μL，包括：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、上下游引物（10 pmol/L）各1 μL、DNA 模板（100 ng）1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 擴增反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性35 s，退火30 s，72℃延伸30 s，32 個循環(huán)；最后72℃延伸10 min；產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，選取條帶清晰、特異性良好的PCR 產(chǎn)物委托北京天一輝遠生物科技有限公司進行測序。

1.2.4 肉品質(zhì)測定 實驗牛屠宰后測定背膘厚、眼肌面積，采集背最長肌進行剪切力、pH、失水率和肌內(nèi)脂肪含量等指標的測定，具體測定方法參照肉牛生產(chǎn)性能測定技術(shù)規(guī)范（NY/T 2660-2014）[13]。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 應(yīng)用chromas 看圖軟件、BioEdit以及DNASTAR 8.0 軟件進行序列比對，分析堿基變化并篩選SNPs 位點。使用Haploview 4.2 軟件進行連鎖不平衡分析及單倍型的構(gòu)建，采用SPSS 19.0 軟件進行單因素方差分析，差異顯著用Duncan's 法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 提取及PCR 擴增結(jié)果 使用試劑盒提取的基因組DNA OD260/OD280值在1.8～2.0 范圍內(nèi)，經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，DNA 條帶清晰、無雜帶或拖尾現(xiàn)象，表明DNA 未發(fā)生降解、無雜質(zhì)，可用于PCR 擴增（圖1）。Primer-1 和Primer-2 引物PCR 擴增的產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，條帶特異性好（圖2），可用于測序分析。

圖1 血液基因組DNA 提取結(jié)果

圖2 PCR 擴增結(jié)果

2.2 測序結(jié)果分析 PCR 產(chǎn)物直接測序結(jié)果經(jīng)DNASTAR軟件比對分析發(fā)現(xiàn)，Primer-1 擴增產(chǎn)物在14 899 bp 處發(fā) 生C→T 突 變，在15 176 bp 處發(fā)生C→A 突變，在15 299 bp 處發(fā)生G→A 突變（圖3），并分別存在3 種基因型。Primer-2 擴增產(chǎn)物在15 682 bp 處發(fā)生G→C 突變，存在3 種基因型。C14899T 和C15176A突變位點位于內(nèi)含子21 上，G15299A 和G15682C 突變位于外顯子22 上，其中，G15299A 位點突變未引起所編碼氨基酸的改變，G15682C 位點位于3'-UTR，屬不翻譯氨基酸的區(qū)域。外顯子21 上未檢測到突變。

圖3 多態(tài)位點測序圖

2.3 多態(tài)位點遺傳參數(shù)分析 通過對早勝牛CAPN1基因內(nèi)含子21 和外顯子22 上的多態(tài)位點遺傳多態(tài)性進行分析（表2），4 個位點均分別產(chǎn)生了2 個等位基因和3 種基因型。C14899T 和C15176A 位點的優(yōu)勢基因型均為雜合型，野生型和突變純合型的基因型頻率相近，優(yōu)勢等位基因為野生型。G15299A 和G15682C 位點的優(yōu)勢基因型為野生型，突變純合型的基因型頻率較低，優(yōu)勢等位基因為野生型。多態(tài)位點的遺傳變異參數(shù)分析結(jié)果表明（表3），C14899T 位點的純合度與雜合度相同，其余3 個位點的純合度均高于雜合度。4 個多態(tài)位點的有效等位基因數(shù)在1.6～2.0 之間，PIC 均處于0.25～0.5范圍內(nèi)，屬中度多態(tài)。Hardy-Weinberg 平衡檢驗（χ2）結(jié)果表明，C14899T、C15176A 和G15299A 位點處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)，而G15682C 位點則顯著偏離Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)。

表2 不同位點的遺傳多態(tài)性

表3 多態(tài)位點的遺傳變異參數(shù)

2.4 基因連鎖不平衡性分析及單倍型構(gòu)建 應(yīng)用Haploview 4.2 軟件對早勝牛CAPN1基因內(nèi)含子21 和外顯子22 的4 個多態(tài)位點進行連鎖不平衡性分析（圖4），結(jié)果表明，這4 個位點間存在連鎖不平衡性。C14899T 與C15176A、G15299A、G15682C 之間以及G15299A 與G15682C 之間均具有較強的連鎖不平衡性（D’＞0.85，r2＞0.33）。基于上述條件構(gòu)建單倍型，并過濾掉頻率小于0.01 的單倍型，結(jié)果顯示（表4），可構(gòu)建6 種單倍型。其中單倍型Hap 1 的頻率最高，為優(yōu)勢單倍型。

表4 單倍型構(gòu)建及其頻率

圖4 4 個多態(tài)位點間的連鎖不平衡分析圖

2.5 單倍型與肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)性分析 單倍型與早勝牛肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果表明（表5），基于CAPN1基因內(nèi)含子21 和外顯子22 的4 個多態(tài)位點構(gòu)建的單倍型與早勝牛肉質(zhì)性狀的眼肌面積、剪切力和失水率有顯著相關(guān)性，而與背膘厚度、pH 值及肌內(nèi)脂肪含量無顯著相關(guān)性。單倍型Hap 2、Hap 3 的眼肌面積顯著高于單倍型Hap 4、Hap 6 的，單倍型Hap 1、Hap 2 的剪切力顯著小于Hap 6 的，單倍型Hap 3、Hap 4 的失水率顯著小于單倍型Hap 6 的。

表5 單倍型與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性

3 討 論

3.1 早勝牛CAPN1基因多態(tài)性分析 本研究分析了早勝牛CAPN1基因外顯子21 至外顯子22 區(qū)域內(nèi)的多態(tài)性，共檢測到4 個多態(tài)性位點，分別為C14899T、C15176A、G15299A 和G15682C，其 中C14899T 和C15176A 位于內(nèi)含子21 上，G15299A 和G15682C 位于外顯子22 上。課題組在前期的研究中采用混合池測序法分析了早勝牛CAPN1基因外顯子的多態(tài)性，也檢測到突變位點G15299A 和G15682C[14]，本研究進一步驗證了上述結(jié)果。

純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量等參數(shù)通常用來衡量一個群體的遺傳變異程度。從遺傳特性分析結(jié)果可知，早勝牛CAPN1基因內(nèi)含子21 和外顯子22 上的4 個多態(tài)位點的雜合度均低于或等于純合度，且C14899T、C15176A、G15299A 位點的雜合度都在0.4 以上，均高于G15682A 位點；有效等位基因數(shù)均在1.6 以上，多態(tài)信息含量在0.3 以上，屬中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5）。表明4 個位點的多態(tài)性相對豐富，且符合有效等位基因數(shù)越多，雜合度和多態(tài)信息含量越高的規(guī)律，具有較大選擇潛力[15]。

經(jīng)Hardy-Weinberg 平衡（χ2）檢驗，G15682C 位點極顯著偏離了平衡狀態(tài)，可能是由于人工選擇、遺傳漂變、遷移和突變等因素所致，表明該位點遺傳變異程度較高，人工選擇潛力較大。而C14899T、C15176A和G15299A 位點均處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)，反映出該位點人工選擇程度較小。

3.2 早勝牛CAPN1基因單倍型及其與肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)性分析 牛肉的品質(zhì)取決于外觀、顏色、風味、脂肪含量、質(zhì)地和嫩度等。嫩度是肉牛生產(chǎn)中影響市場價格的重要指標之一，因為它直接影響消費者對牛肉的滿意度。肌肉嫩化過程中的蛋白水解變化受到了廣泛關(guān)注[16-18]。大量的研究表明，CAPN 參與了肌肉中肌原纖維的水解過程，因此也直接參與了肌肉生長和畜禽屠宰后嫩化的過程[19]。Page 等[20-21]在牛的CAPN1基因編碼序列和內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)了38 個多態(tài)性位點，并證實了316 位和530 位氨基酸多態(tài)性與牛肉嫩度密切相關(guān)。但除了上述2 個位點外，還有一些研究檢測到位于調(diào)控區(qū)域的多態(tài)位點也與肉品質(zhì)性狀的某些指標相關(guān)。Katarzyna 等[22]在豬CAPN1基因檢測到7 個多態(tài)位點，其中位于內(nèi)含子的3 個位點可作為豬肉質(zhì)性狀的候選遺傳標記。Jin等[23]對延邊黃牛CAPN1基因測序后共檢測到27 個多態(tài)性位點，其中25 個位于內(nèi)含子上，且內(nèi)含子上的多態(tài)位點與牛肉的脂肪酸含量、pH 值、肉色等指標顯著相關(guān)。郭彥[24]等分析了雞CAPN1基因3'-UTR 多態(tài)性及其與肉品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果表明，該區(qū)域內(nèi)的SNPs位點存在2 種基因型并與雞肉pH 值、肌內(nèi)脂肪含量和剪切力顯著相關(guān)。因此，調(diào)控區(qū)域內(nèi)的SNPs 可能與CAPN1基因的轉(zhuǎn)錄水平和活性有關(guān)。本研究檢測到的多態(tài)位點位于內(nèi)含子區(qū)和3'-UTR 區(qū)，也可能影響早勝牛CAPN1基因的轉(zhuǎn)錄和表達水平，可作為影響早勝牛肉品質(zhì)的候選分子標記。

單倍型是指一條染色體上的一組SNPs 緊密連鎖并作為一個單位遺傳，單倍型分析已經(jīng)成為研究復(fù)雜遺傳表型的一個熱點[25]。研究同一個基因中多個SNPs 的單倍型也可以較分析單個SNPs 基因型與表型關(guān)聯(lián)性的結(jié)果更可靠。Cheong 等[18]人分析了韓牛CAPN1基因12 個多態(tài)性位點的連鎖不平衡性，結(jié)果表明各變異位點均處于連鎖不平衡狀態(tài)，從外顯子5 到內(nèi)含子7 的1.5 kb 區(qū)域和從外顯子11 到外顯子22 的9 kb 區(qū)域內(nèi)存在2 個高度連鎖的Block 區(qū)塊。在Katarzyna[22]等對豬CAPN1基因的研究中，也進行了單倍型分析，結(jié)果CAPN1基因的7 個多態(tài)位點位于高度連鎖不平衡區(qū)域。本研究對早勝牛CAPN1基因內(nèi)含子21 至外顯子22 區(qū)域內(nèi)的多態(tài)性位點進行了單倍型及其與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性分析，結(jié)果表明，該區(qū)域內(nèi)的4 個SNPs 位點處于連鎖不平衡狀態(tài)，其中C14899G 與C15176A 之間以及G15299A 與G15682C 之間分別處于高度連鎖不平衡。這一結(jié)果與Katarzyna[22]等的研究結(jié)果相似。關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果表明，單倍型與早勝牛肉質(zhì)性狀的眼肌面積、剪切力和失水率有顯著相關(guān)性。

4 結(jié) 論

本研究在早勝牛CAPN1基因內(nèi)含子21 和外顯子22 上共檢測到4 個SNPs 位點，且4 個位點間存在連鎖不平衡性，共有6 種單倍型組合，其中Hap1（CCGC）頻率最高。單倍型與剪切力、失水率和眼肌面積有顯著相關(guān)性，其中Hap 2（TAAG）為優(yōu)勢性狀單倍型，可以作為早勝牛肉用性狀選育的候選分子標記應(yīng)用于肉用型早勝牛的早期選擇中。