張 強(qiáng)，次旦央吉，巴桑旺堆，洛桑頓珠，達(dá)娃央拉，吉 布，陳曉英*

（1.省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西藏拉薩 850000；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏拉薩 850009；3.西藏聶榮縣農(nóng)牧業(yè)科學(xué)技術(shù)服務(wù)站，西藏那曲 853500）

牦牛作為我國(guó)青藏高原特有畜種，其在當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)經(jīng)濟(jì)和文化傳承中起重要作用。尤其是在動(dòng)物高原適應(yīng)性研究領(lǐng)域，牦牛作為動(dòng)物模型，大量相關(guān)遺傳機(jī)制被鑒定。血清生化指標(biāo)作為廣泛應(yīng)用于人類各類疾病臨床輔助診斷工具[1]，其在家養(yǎng)動(dòng)物中也普遍應(yīng)用[2]。

近年來(lái)，學(xué)者們開(kāi)展了大量針對(duì)人[3]及羊[4]、豬[5]、雞[6]、鹿[7]、狗[8]等動(dòng)物高海拔適應(yīng)性的血清生化學(xué)指標(biāo)的研究。在牦牛方面，大量研究分析了不同海拔和生態(tài)區(qū)域的牦牛血清生化指標(biāo)，如九龍牦牛、玉樹(shù)牦牛、高原型牦牛等[9]。近些年針對(duì)不同海拔高度分布牦牛的生化血清研究越來(lái)越得到重視[10]。本研究旨在檢測(cè)棲息地具有不同海拔高度的那曲和阿里地區(qū)牦牛類群的血清學(xué)生化指，以期尋找不同海拔分布與牦牛生化指標(biāo)間的聯(lián)系，進(jìn)而闡述牦牛高原適應(yīng)性的生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及樣本采集 本次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)所采集的樣品分別為20 頭那曲地區(qū)聶榮縣（NR，采樣地海拔高度4 500～4 700 m）成年雌性牦牛，20 只阿里地區(qū)改則縣（AL，采樣地海拔高度約＞5 100 m）成年雌性牦牛，全部40 只牦牛年齡均在3.5～4 歲、體重為280～350 kg。采集時(shí)間為2020 年5 月12 日—5 月18 日，采集血液樣品之前，所有備檢動(dòng)物經(jīng)過(guò)禁食禁水處理12 h，使用非抗凝真空采血管收集動(dòng)物頸靜脈血10 mL，利用38℃溫水孵育20 min 后分離血清，并于-80℃超低溫冰箱保存。

1.2 血清生化指標(biāo)檢測(cè)及試劑儀器 選用博科B-400 全自動(dòng)生化分析儀（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司，濟(jì)南，中國(guó)）對(duì)以上40 個(gè)樣本的39 項(xiàng)血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)。其中包括16 項(xiàng)肝臟功能指標(biāo)：總蛋白、白蛋白、球蛋白、白球比、總膽紅素、直接膽紅素、間接膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷草/谷丙、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶、總膽汁酸、前白蛋白、C 反應(yīng)蛋白、總膽固醇；4 項(xiàng)心肌功能指標(biāo)：肌酸激酶、肌酸酶同工酶、乳酸脫氫酶、α-羥丁酸脫氫酶；6 項(xiàng)腎臟功能指標(biāo)：尿素、肌酐、胱抑素C、β-2 微球蛋白、尿酸、尿素氮/肌酐；10 項(xiàng)臨床常用生物化學(xué)指標(biāo)：鉀、鈉、氯、鈣、二氧化碳、鎂、磷、葡萄糖、甘油三酯、高密度脂蛋白；3 項(xiàng)其他血清學(xué)檢測(cè)指標(biāo)：淀粉酶、陰離子間隙、滲透壓。各項(xiàng)標(biāo)檢測(cè)指標(biāo)試劑盒均為武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 血清脂肪代謝相關(guān)因子檢測(cè)及試劑儀器 選取NR及AL 牦牛群體內(nèi)各16 個(gè)個(gè)體血清樣本，利用德鐵Multiskan Sky 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技公司，美國(guó)）及Thermo Scientific SkanIt 軟件系統(tǒng)對(duì)腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素6、脂聯(lián)素3 個(gè)脂肪代謝相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，3 項(xiàng)ELISA 酶聯(lián)免疫指標(biāo)檢測(cè)試劑盒采購(gòu)于侖昌碩生物科技有限公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 使用SAS 9.4 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，其中各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)結(jié)果以均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示，另外組間生化指標(biāo)差異的獨(dú)立樣本顯著性T-test 檢驗(yàn)。P＜0.05 代表差異顯著。

2 結(jié)果

本研究對(duì)那曲地區(qū)聶榮縣和阿里地區(qū)改則縣的家養(yǎng)牦牛的血清組織的39 項(xiàng)生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1、表2。其中，高海拔牦牛群體的白蛋白、白球比、鉀、鈉、氯、鈣、鎂、肌酐、尿酸、總膽固醇、陰離子間隙和滲透壓高于低海拔NR 牦牛資源群體（P＜0.05）。另外，高海拔牦牛群體的球蛋白、堿性磷酸酶、總膽汁酸、肌酸激酶、α-羥丁酸脫氫酶、二氧化碳、磷和尿素低于NR 牦牛資源群體（P＜0.05）。而總蛋白、總膽紅素、、間接膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)氨酸酶等18 項(xiàng)生化指標(biāo)在2 個(gè)牦牛群體內(nèi)無(wú)顯著差異。

表1 不同海拔棲息地牦牛類群肝臟、心肌、腎臟功能血清學(xué)指標(biāo)分析

表2 不同海拔棲息地牦牛類群臨床常用和其他血清學(xué)指標(biāo)分析

如表3 所示，低海拔NR 牦牛的脂聯(lián)素指標(biāo)高于高海拔AL 群體（P＜0.05），而白細(xì)胞介素與腫瘤壞死因子在2 個(gè)群體間均表現(xiàn)為無(wú)顯著差異。

表3 不同海拔棲息地牦牛群體的3 個(gè)脂肪代謝指標(biāo)檢驗(yàn)與比較 ng/mL

3 討 論

眾所周知，肝臟是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)重要的代謝器官，也是機(jī)體能量代謝和各類生理作用的活性物質(zhì)合成與加工場(chǎng)所。有研究表明，長(zhǎng)期暴露于高海拔環(huán)境下，鼠谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶顯著升高[11]，另外，在牦牛中也發(fā)現(xiàn)，高海拔分布的牛群的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、間接膽紅素、總蛋白、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶、直接膽紅素、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶/谷丙轉(zhuǎn)氨酶顯著高于低海拔牛群[10]。然而本研究中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、總蛋白、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶、直接膽紅素等指標(biāo)在2 個(gè)不同海拔分布的牦牛群體中無(wú)差異，尤其是AL 牦牛的堿性磷酸酶低于低海拔NR 牦牛，與前人研究相反[10]。這可能是由于群體間遺傳特征的差異，或是研究中選取的2 個(gè)群體的海拔差異不大，均在4 000 m 以上，未能在肝功能代謝指標(biāo)上體現(xiàn)出明顯差異。

肌酸激酶主要存在于細(xì)胞質(zhì)和線粒體中，是一個(gè)與細(xì)胞內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP 再生有直接關(guān)系的重要激酶。肌酸激酶主要存在于骨骼肌和心肌內(nèi)，少量存在于肺和腦。肌酸激酶活性測(cè)定可以用于骨骼肌疾病及心肌疾病的診斷[12]。有研究表明，高海拔分布的牦牛肌酸激酶血清含量較低海拔牦牛一定程度有所增高[10]；但也有研究表明，攝入不同劑量紅景天使得高原人體血清肌酸激酶含量顯著降低[13]。由于大量臨床研究已證實(shí)紅景天對(duì)高原病有顯著的臨床療效[14]，故而不難理解本研究中高海拔牦牛群體的肌酸激酶低于低海拔牦牛，暗示長(zhǎng)期處于高海拔地區(qū)的牦牛群體在長(zhǎng)期的自然選擇作用下，已經(jīng)建立完善且良好的高原適應(yīng)性能力，故而無(wú)需肌酸激酶大量分泌而提高機(jī)體對(duì)高原環(huán)境的適應(yīng)性。

肌酐作為動(dòng)物體內(nèi)的肌肉代謝的產(chǎn)物，主要通過(guò)非酶脫水反應(yīng)形成肌酐，并隨體液循環(huán)，隨尿液排出體外。在臨床中，肌酐是重要的腎功能檢測(cè)指標(biāo)并被廣范應(yīng)用[15]。在人類臨床研究中發(fā)現(xiàn)高海拔地區(qū)妊娠高血壓伴腎損害與肌酐指標(biāo)存在顯著相關(guān)聯(lián)系[16]。有研究發(fā)現(xiàn)健康人群從低海拔遷入不同水平高海拔地區(qū)后肌酐、尿酸明顯升高[17]。在?？苿?dòng)物研究中發(fā)現(xiàn)甘南牦牛與黃牛間肌酐的血清含量顯著差異[18]。本研究結(jié)果也顯示，高海拔AL 群體的肌酐和尿酸顯著高于相對(duì)低海拔NR 群體。另外，本研究中高海拔AL 牦牛的總膽固醇高于NR 牦牛。但李鵬等[18]研究顯示低海拔黃牛的總膽固醇顯著高于牦牛，也有報(bào)道指出不同海拔分布的青海大通牦牛的總膽固醇濃度無(wú)顯著差異[10]。這些研究結(jié)果的分歧可能是由于不同研究之間存在樣品的品種來(lái)源和棲息分布地海拔高度不一致等原因所造成。

本研究發(fā)現(xiàn)，高海拔地區(qū)AL 群體的礦物質(zhì)和微量元素（鉀、鈉、氯、鈣、鎂）高于低海拔NR 群體。有大量研究已鑒定不同牦牛群體血清內(nèi)大量礦物質(zhì)及微量元素存在顯著差異[19]，這暗示牦牛機(jī)體的礦物質(zhì)和微量元素含量可能與不同棲息地的海拔高度和自然生態(tài)條件的適應(yīng)性存在關(guān)聯(lián)[20]。

另外，臨床上發(fā)現(xiàn)心肌梗死患者中心力衰竭程與陰離子間隙存在聯(lián)系，而且心肌梗死患者組較不規(guī)律心絞痛患者的陰離子間隙明顯升高，且二氧化碳結(jié)合力明顯降低[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，AL 牦牛陰離子間隙濃度顯著高于NR 牦牛，且NR 群體的二氧化碳高于AL 群體，這與以上的研究結(jié)果相近，暗示海拔差異直接影響個(gè)體的陰離子間隙和二氧化碳濃度。

另外，脂肪因子在動(dòng)物體內(nèi)代謝及功能作用已得到廣泛研究[22]。本研究發(fā)，現(xiàn)2 個(gè)分布在不同生態(tài)環(huán)境的棲息地牦牛群體的血清中脂聯(lián)素濃度存在顯著差異。脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞分泌的一種內(nèi)源性生物活性多肽或蛋白質(zhì)，能改善動(dòng)物機(jī)體的胰島素抗性和動(dòng)脈硬化癥，尤其是在臨床上脂聯(lián)素表現(xiàn)出抗糖尿病、抗動(dòng)脈粥樣和炎癥的能力[23]。目前大量研究表明脂聯(lián)素與多種高原缺氧環(huán)境的動(dòng)物生理及病理變化存在緊密聯(lián)系[24]。有研究表明，脂聯(lián)素通過(guò)抑制氧化應(yīng)激減輕缺氧所導(dǎo)致的胰島細(xì)胞線粒體損傷[25]，故而本研究中處于較高海拔分布的AL 牦牛群體中脂聯(lián)素濃度較高，可能與其具有較強(qiáng)的高海拔適應(yīng)能相關(guān)。也有研究表明，動(dòng)物與人的膳食組成和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝取對(duì)脂聯(lián)素[26]和多種血清生化指標(biāo)濃度也具有影響[27]。這也提示除牦牛群體棲息地海拔高度差異因素以外，草場(chǎng)植被種類分布、飼草功能成分的差異等生態(tài)因子也可能造成其相關(guān)指標(biāo)存在差異。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同海拔牦牛類群的大量肝功能、腎功能及臨床常用生化指標(biāo)存在差異，顯示不同海拔分布的牦牛群體由于經(jīng)歷長(zhǎng)期自然選擇的壓力，導(dǎo)致機(jī)體在生理生化水平上出現(xiàn)大量顯著變化，而這些變化可能正是機(jī)體乃至群體對(duì)于高原環(huán)境適應(yīng)性做出的改變。另外，本研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素在不同海拔群體間存在差異也直接印證胰島素代謝對(duì)于動(dòng)物高海拔環(huán)境適應(yīng)性的重要作用。故而，本研究可為進(jìn)一步理解牦牛極端高海拔環(huán)境適應(yīng)性的機(jī)制提供理論參考。