肖 成，薛佳佳,2，王 晶,3，柳儉強(qiáng)，于永生，張立春，馬惠海，金海國(guó)*，曹 陽(yáng)*

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林公主嶺 136100 2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130000；3.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133000）

隨著居民生活水平的提高，高品質(zhì)羊肉越來(lái)越受到歡迎。遺傳因素是影響肉質(zhì)性狀的重要因素之一，提高肌內(nèi)脂肪含量能夠顯著提升肉質(zhì)，而肌內(nèi)脂肪含量受到脂肪細(xì)胞分化及脂滴積累的影響。因此，探究脂肪細(xì)胞分化形成的機(jī)制，尋找新的調(diào)控基因?qū)τ谔岣呒?nèi)脂肪含量有重要作用。

參與綿羊脂代謝的基因眾多且復(fù)雜，不易找到相關(guān)的新調(diào)控基因，需借助生物信息學(xué)方法進(jìn)行尋找。第2代測(cè)序技術(shù)可以高效準(zhǔn)確地檢測(cè)特定狀態(tài)下細(xì)胞或組織全部的轉(zhuǎn)錄本信息，因此適合研究不同組織器官或發(fā)育階段之間的差異表達(dá)基因[1]。目前，第2 代測(cè)序技術(shù)快速發(fā)展并已被廣泛應(yīng)用，大量測(cè)序數(shù)據(jù)被上傳到公共平臺(tái)。利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，可以快速尋找到與脂代謝相關(guān)的預(yù)測(cè)基因。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，可以快速鎖定脂代謝相關(guān)候選基因，減少大量前期工作，縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)生物信息相關(guān)網(wǎng)站及分子實(shí)驗(yàn)結(jié)合方式，探究影響綿羊脂肪細(xì)胞分化的新標(biāo)志基因，以期為深入探索綿羊脂代謝調(diào)控機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)選擇2 月齡健康雄性綿羊（雙乾肉羊）1 只，屠宰后取其腹股溝脂肪組織，用于分離綿羊前體脂肪細(xì)胞。選擇體重相近（50 kg）的6 月齡健康雄性綿羊（杜寒雜交羊子一代）8 只，屠宰后取其肌肉、脂肪、十二指腸、小腸、心、肝、胃組織，置于凍存管中液氮保存，用于提取組織總RNA。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物生物技術(shù)研究所飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器 蛋白裂解液購(gòu)自索萊寶生物公司；Western 相關(guān)儀器以及試劑均為實(shí)驗(yàn)室之前保存；細(xì)胞培養(yǎng)皿來(lái)自corning 公司；細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑（胰島素、地塞米松）、PBS 緩沖液、細(xì)胞分離試劑（胰蛋白酶、膠原酶）等均購(gòu)自Sigma 公司；RNA 提取試劑TRIzol購(gòu)自Invitrogen 公司；PCR 預(yù)混酶購(gòu)自康為世紀(jì)生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DL2000 Maker 購(gòu)自TaKaRa 生物有限公司；PCR 引物及測(cè)序服務(wù)由蘇州金唯智生物科技有限公司提供；LightCycler 480 SYBR Green I Master由羅氏（中國(guó)）公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 候選基因選擇 利用NCBI 網(wǎng)站（www.ncbi.nlm.nih.gov）選擇GEO Data Sets 項(xiàng)目，輸入與脂肪細(xì)胞相關(guān)的關(guān)鍵詞，尋找與脂代謝相關(guān)的公共測(cè)序數(shù)據(jù)3 組，分別為GSE97241、GSE90580、GSE51905。利用網(wǎng)站公布測(cè)序數(shù)據(jù)自帶的分析程序GEO2R 截取前250 個(gè)差異表達(dá)基因，然后將3 組測(cè)序數(shù)據(jù)合并，使用Venn 圖找到共有的差異表達(dá)基因，即富含半胱氨酸酸性分泌蛋白類(lèi)似物1（Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine Like 1，SPARCL1）。

1.3.2 提取8 只綿羊各組織總RNA 利用液氮將目的組織研磨成粉末，按照TRIzol 說(shuō)明書(shū)指示方法提取各組織總RNA。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。合格后利用TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄酶體外合成cDNA，反應(yīng)體系：Total RNA 500 ng，5×Master Mix 2 μL，RNase Free ddH2O 補(bǔ)充到 10 μL。反應(yīng)條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，12℃保存。雙蒸水將cDNA 稀釋10 倍，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)。

1.3.3 分離綿羊前體脂肪細(xì)胞并誘導(dǎo) 屠宰2 月齡綿羊，無(wú)菌取腹股溝處白色脂肪組織，剔除筋膜及血塊，將組織剪成1 mm3方塊。膠原酶II 消化組織1 h，期間每5 min 混勻1 次，消化后液體經(jīng)200 目以及400 目濾網(wǎng)，過(guò)濾出未消化的組織及雜細(xì)胞。1 500 r/min 離心15 min 棄上清，完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并接種到60 mm培養(yǎng)皿中。細(xì)胞6 h 貼壁，12 h 換液，除掉雜細(xì)胞及未貼壁細(xì)胞。每48 h 換液，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，胰蛋白酶消化細(xì)胞，傳代培養(yǎng)。第3 代細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)，胰島素、地塞米松以及IBMX 混合培養(yǎng)液作為誘導(dǎo)I 液誘導(dǎo)細(xì)胞，48 h 換誘導(dǎo)II 液（含胰島素的完全培養(yǎng)基），48 h 后換完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)直到顯微鏡下看到細(xì)胞出現(xiàn)脂滴，油紅O 染色驗(yàn)證成熟的脂肪細(xì)胞。選擇細(xì)胞分化前及分化后2 個(gè)時(shí)期提取RNA 和蛋白，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 引物設(shè)計(jì)及驗(yàn)證 根據(jù)Genbank 中綿羊SPARCL1基因mRNA 序列（XM_004009982.3）以及內(nèi)參基因GAPDH序列（NM_001190390.1）利用Primer 5 軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量RCR 引物序列，引物具體信息見(jiàn)表1。普通PCR 方法檢測(cè)引物特異性。PCR 反應(yīng)體系20 μL：預(yù)混酶10 μL、上下游引物（10 pmol/μL）各0.5 μL、模板 1 μL、ddH2O 8 μL；擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，退火溫度30 s，72℃延伸溫度8 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸8 min，4℃保存。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，條帶單一的PCR 引物可用于定量實(shí)驗(yàn)。

表1 SPARCL1 基因引物序列

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 和Western Blot 檢測(cè) RTqPCR 體系為20 μL：Light Cycler 480 SYBR Green I Master（2×）10 μL、ddH2O 8 μL、cDNA 1 μL、上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL。反應(yīng)程序：95℃ 5 min，95℃10 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)，95 ℃ 5 s，65 ℃ 1 min，40 ℃ 10 s，每組 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。Roche Lightcycler 480 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。Western Blot 檢測(cè)，裂解液裂解細(xì)胞30 min 獲得細(xì)胞蛋白，100℃沸水煮蛋白10 min，使其變性。制備分離膠與濃縮膠，待膠凝固后，將蛋白注入膠孔20 μL，電壓80 V，20 min，待蛋白跑到分離膠后，換電壓120 V，40 min，跑膠結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。將分離膠上蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，200 mA 條件下轉(zhuǎn)膜60 min，TBST 洗5 min 后，用含有5% 脫脂奶粉的封閉液封閉膜2 h。TBST 洗3 次，每次5 min，一抗4℃搖過(guò)夜。第二天TBST 洗3 次，每次5 min，二抗室溫?fù)u2 h，TBST 洗3 次，每次5 min，顯色液孵育1 min 后照相。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用GraphPad Prism 軟件作圖，利用SPSS 17.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)或單因素方差分析，顯著性水平定為P＜0.05，極顯著水平定為P＜0.01。

2 結(jié)果

2.1SPARCL1基因在綿羊各組織的表達(dá)差異 如圖1所示，SPARCL1基因在綿羊各組織的表達(dá)譜中，在綿羊脂肪組織中表達(dá)最高。

圖1 SPARCL1 基因在綿羊各組織表達(dá)譜

2.2SPARCL1基因在不同綿羊個(gè)體脂肪組織中的表達(dá)差異 如圖2 所示，SPARCL1基因在7 號(hào)個(gè)體綿羊脂肪組織表達(dá)量最高。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室前期測(cè)定，7 號(hào)綿羊的耗料增重比最高（表2）。

圖2 SPARCL1 基因在不同綿羊脂肪組織中表達(dá)趨勢(shì)

表2 不同個(gè)體綿羊耗料增重比

2.3 體外培養(yǎng)脂肪細(xì)胞并誘導(dǎo) 如圖3 所示，成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴能夠被染成紅色以鑒定為脂肪細(xì)胞。脂肪細(xì)胞通常會(huì)聚集在一起，脂滴形成串珠形態(tài)。

圖3 油紅O 染脂肪細(xì)胞圖

2.4SPARCL1基因在綿羊脂肪細(xì)胞分化過(guò)程的表達(dá)差異如圖4 所示，細(xì)胞分化后SPARCL1基因相對(duì)表達(dá)較細(xì)胞分化前顯著升高（P≤0.05）。Western Blot 蛋白免疫印跡結(jié)果也具有相同趨勢(shì)（圖5）。

圖4 SPARCL1 基因脂肪細(xì)胞分化前后期表達(dá)趨勢(shì)

圖5 SPARCL1 蛋白在脂肪細(xì)胞分化前后期表達(dá)趨勢(shì)

3 討 論

本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法尋找到綿羊脂代謝相關(guān)新的調(diào)控基因SPARCL1。該候選基因源自小鼠脂肪細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)，因此需要在綿羊個(gè)體進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SPARCL1基因不僅在綿羊脂肪組織中高表達(dá)，且在不同綿羊個(gè)體脂肪組織中的表達(dá)也存在差異。SPARCL1基因在飼料利用率最高的綿羊個(gè)體脂肪組織中表達(dá)最高。這也間接說(shuō)明SPARCL1基因可能對(duì)于飼料利用率或者脂肪增殖方面具有影響。脂肪細(xì)胞分化前期與后期2 個(gè)階段，SPARCL1基因在分子水平以及蛋白水平均出現(xiàn)顯著變化且趨勢(shì)相同，說(shuō)明SPARCL1基因可能參與脂肪細(xì)胞分化，其具體機(jī)制值得研究。

SPARCL1 屬于SPARC 家族成員，為具有分泌功能的基質(zhì)糖蛋白。SPARCL1 是介導(dǎo)細(xì)胞基質(zhì)相互作用的黏附分子，參與機(jī)體多項(xiàng)生理過(guò)程，如細(xì)胞黏附、增殖、分化、遷移、成熟等[2]。SPARCL1基因在動(dòng)物胚胎期以及組織受傷重塑時(shí)高表達(dá)，惡性腫瘤組織中SPARCL1基因表達(dá)顯著低于正常組織。有研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染外源過(guò)表達(dá)SPARCL1質(zhì)粒后，腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲、生長(zhǎng)受到抑制[3]。目前SPARCL1基因在癌癥預(yù)防、治療等方面研究較多，研究也表明SPARCL1基因是與腫瘤相關(guān)的重要因子[4-9]，具有腫瘤抑制作用[10]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，SPARCL1基因能夠抑制小鼠前體脂肪細(xì)胞分化，參與脂代謝過(guò)程[11]，這也堅(jiān)定了本課題組對(duì)于SPARCL1基因在綿羊脂代謝方面進(jìn)行深入研究的信心。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用NCBI 網(wǎng)站公共測(cè)序數(shù)據(jù)GSE97241、GSE90580、GSE51905，取3 組共有差異表達(dá)基因SPARCL1作為綿羊脂代謝相關(guān)候選基因，結(jié)果顯示SPARCL1基因在綿羊脂肪組織中高表達(dá)，同時(shí)在飼料轉(zhuǎn)化率高的綿羊個(gè)體脂肪組織中顯著表達(dá)。分子以及蛋白水平均檢測(cè)出SPARCL1基因在脂肪細(xì)胞分化前后出現(xiàn)差異表達(dá)。