邢青華，鄒超霞，魏耀昶，張瑞門，潘 雨，石德順，鄧彥飛

（廣西大學動物科學技術(shù)學院，廣西南寧 530004）

現(xiàn)階段，核移植技術(shù)仍是哺乳動物克隆最有效的方法，該技術(shù)的發(fā)展為拯救瀕危動物、生產(chǎn)可供人類移植的器官、某些藥物原料等提供了發(fā)展方向[1]。1977 年克隆羊Dolly 誕生，表明成年哺乳動物的體細胞不僅具有基因組的全能性，還能在卵母細胞質(zhì)中恢復(fù)到發(fā)育的起始狀態(tài)，完成整個個體的發(fā)育[2]。但核移植效率低下，一般僅為1%～6%[3]。在核移殖技術(shù)中，供體細胞準備是核移植技術(shù)中關(guān)鍵的一環(huán)。鑒于此，可通過探索不同條件的供體細胞去提高克隆效率。

供體細胞初始表觀遺傳修飾的類型和模式顯著影響體細胞核移植胚胎的發(fā)育能力[4]。DNA 甲基化和組蛋白乙?；鳛轶w細胞核移植重編程的重要過程，在自然條件下，幫助精子和卵母細胞的細胞核到達全能性狀態(tài)[5]。一方面，DNA 甲基化作為細胞分裂遺傳的表觀遺傳標記，維持細胞記憶[6]。另一方面，適當?shù)娜ゼ谆梢越档突虮磉_并恢復(fù)細胞分化和發(fā)展。而組蛋白乙?；ǔＥc轉(zhuǎn)錄允許狀態(tài)相關(guān)，組蛋白H3 的乙酰化水平通過引起染色質(zhì)解聚，從而促進體細胞重編程[7]。因此，本研究從不同年齡的水牛耳組織成纖維細胞入手，分析不同年齡水牛成纖維細胞的增殖能力，檢測細胞DNA甲基化和組蛋白乙酰化水平，為水牛體細胞克隆等研究提供理想的實驗材料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要樣品 3 月齡胎兒水牛、新生水牛、10 歲齡水牛耳部成纖維組織，牛只來源于南寧市魯班路肉聯(lián)廠和崇左市農(nóng)戶。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清（FBS）、細胞培養(yǎng)基（DMEM）、胰蛋白酶、PBS 緩沖液、青鏈霉素等（Gibco公司）；一抗（5-mC，Proteintech 公司）；二抗（抗鼠，Abcam 公司）；多聚甲醛、牛血清白蛋白（BSA）、PI染液（Sigma 公司）；臺盼藍染液（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；RNA 提取試劑盒（翼飛雪公司）；反轉(zhuǎn)試劑盒HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、熒光定量試劑盒ChamQ Universal SYBR?qPCR Master Mix（諾唯贊公司）；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.3 主要儀器 倒置顯微鏡（Nikon 公司），細胞培養(yǎng)箱（Thermo 公司），ND-1000 微量分光光度計（Nano Drop 公司），7500 實時熒光定 量PCR 儀（Applied Biosystems 公司），EVOS 細胞成像系統(tǒng)（Thermo 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 水牛耳部原代成纖維細胞的分離培養(yǎng) 分別將不同年齡的水牛耳部成纖維組織放入高抗的PBS（含雙倍青鏈霉素混合液）中漂洗3 次，再放入75%酒精中漂洗20～30 s，隨即將組織用高抗PBS 漂洗3～5 次。漂洗之后，將組織塊剪成1 cm2左右的小塊，均勻鋪入60 mm 的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5% CO2環(huán)境中倒置培養(yǎng)6 h，之后將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)過來，沿皿壁逐滴加入完全培養(yǎng)基，連續(xù)4～7 d 補、換完全培養(yǎng)基，觀察成纖維細胞的生長及形態(tài)變化。

1.2.2 水牛成纖維細胞的傳代培養(yǎng) 當細胞匯合度至80%～90%時，即可進行細胞的傳代培養(yǎng)。用PBS 清洗2 次，去除組織塊和死細胞，加入提前預(yù)熱的0.25%胰蛋白酶，37℃培養(yǎng)箱中消化2～3 min，倒置顯微鏡下觀察細胞收縮變圓時，加入含10% FBS 的DMEM 終止消化，反復(fù)吹打細胞至單個細胞，1:3 的比例傳代培養(yǎng)。

1.2.3 水牛成纖維細胞生長曲線的繪制 采用血球計數(shù)板對水牛成纖維細胞進行計數(shù)。將P1 代細胞傳代接種于24 孔板中，每孔接種約5×103個細胞。從接種之日算起，每隔24 h 取出每組各3 個孔進行細胞計數(shù)，取10 μL 重懸細胞與10 μL 的臺盼藍充分混勻，然后取10 μL混合的細胞懸浮液沿著蓋玻片注入血球計數(shù)板中，在倒置顯微鏡下進行計數(shù)。計數(shù)時依照“計上不計下，計左不計右”的原則，記錄4 個區(qū)域的細胞數(shù)。然后按照公式C=（細胞數(shù)/4）×2×104即可得到單位體積內(nèi)細胞個數(shù)。在連續(xù)8 d 計數(shù)之后將所得數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 8.0 軟件分析。

1.2.4 水牛成纖維細胞DNA 甲基化的檢測 采用免疫熒光的方法檢測水牛成纖維細胞的DNA 甲基化水平。取P1 代細胞傳至96 孔板中，每孔接種2.5×104個細胞。細胞培養(yǎng)24～30 h 后，用4%的多聚甲醛室溫固定30 min，固定完成后的細胞用PBS 洗滌2 次，接著用0.5%tritonX-100 對細胞透化25 min，之后用PBS 清洗3 次，清洗后加入1%牛血清白蛋白（BSA）封閉30 min，封閉完成后用PBS 清洗3 次，然后加入一抗（5-mC，1:200）放入4℃冰箱過夜孵育，12 h 后用PBS 清洗3 遍，加入二抗（抗鼠，1:500）避光孵育50 min，然后加入PI 染料（用PBS 稀釋成10 μg/mL）進行避光染色10 min，染色完成后加入PBS 即可用EVOS 細胞成像系統(tǒng)拍照，利用Image-Pro Plus 6.0 軟件進行圖像處理。

1.2.5 水牛成纖維細胞DNA 甲基化與組蛋白乙?；嚓P(guān)基因的表達分析 不同年齡水牛P2 代成纖維細胞總RNA 的提取嚴格按照RNA 提取試劑盒說明書進行操作，并用ND-1000 微量分光光度計檢測RNA 濃度與純度，用0.1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性，符合要求后立即使用HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA 的體外合成，反轉(zhuǎn)錄嚴格按照cDNA 反轉(zhuǎn)試劑盒說明書操作進行，然后將cDNA濃度稀釋到100 ng/μL，以β-actin為內(nèi)參，采用熒光定量試劑 盒ChamQ Universal SYBR?qPCR Master Mix 進行qRT-PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系20 μL：10 μmol/L 上、下游引物各0.4 μL，模板（100 ng/μL）1 μL，2×chamQ Universal SYBR?qPCR Master Mix 10 μL，三蒸水補至20 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性15 s，60℃退火延伸30 s，40 個擴增循環(huán)數(shù)。每個樣品重復(fù)3次。利用2-ΔΔct法計算目的基因相對表達水平。所用到的熒光定量引物如表1 所示。

1.2.6 統(tǒng)計分析 使用SPSS 20.0 軟件單因素方差分析對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果以平均值± 標準差表示。P＞0.05 表示差異不顯著，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同年齡水牛耳部成纖維細胞的形態(tài)學觀察 經(jīng)過細胞組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)不同年齡階段水牛成纖維細胞，觀察原代細胞的擴展情況及P1 代細胞的形態(tài)。在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，不同年齡的組織塊向外爬出的細胞數(shù)量和速度不同，3 月齡胎兒水牛的成纖維細胞在3～4 d 開始爬出（圖1-A），而新生水牛和10 歲齡水牛細胞在6～7 d 才開始爬出（圖1-B，圖1-C）。觀察P1 代的細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)：不同年齡的細胞狀態(tài)良好，細胞形態(tài)呈梭形，其中3 月齡胎兒水牛的細胞之間的界限更加分明（圖1-D，1-E，1-F）。

2.2 不同年齡水牛成纖維細胞增殖能力的變化 如圖2所示，整體來看，3 個年齡的細胞生長曲線均呈典型的S 型。1～5 d 內(nèi)3 個年齡的水牛耳組織成纖維細胞密度不斷增加，3 月齡胎兒水牛成纖維細胞的生長相比于新生水牛和10 歲齡水牛更快，5 d 后3 個年齡的水牛成纖維細胞處于平臺期，之后3 個年齡的水牛耳組織成纖維細胞的密度降低，且細胞密度下降的速率從慢到快依次是3 月齡胎兒水牛、新生水牛、10 歲齡水牛。

圖2 不同年齡水牛成纖維細胞生長曲線圖

2.3 不同年齡水牛成纖維細胞DNA 甲基化水平的變化由圖3 可知，新生水牛的DNA 甲基化水平與3 月齡胎兒水牛成纖維細胞DNA 甲基化水平相比沒有顯著差異，而10 歲齡水牛的成纖維細胞DNA 甲基化水平高于3 月齡胎兒水牛和新生水牛的DNA 甲基化水平（P＜0.01）（圖3-A，3-B）；通過qRT-PCR 檢測DNA 甲基化基因表達發(fā)現(xiàn)，新生水牛與10 歲齡水牛DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT1和DNMT3A基因的表達均高于3 月齡胎兒水牛（P＜0.01）（圖3-C，3-D）。以上結(jié)果表明，隨水牛年齡的增長，水牛成纖維細胞的DNA 甲基化水平呈上升趨勢。

圖3 不同年齡水牛成纖維細胞的DNA 甲基化水平

2.4 組蛋白乙酰化水平相關(guān)基因在不同年齡水牛成纖維細胞中的表達變化 圖4 顯示，3 月齡胎兒水牛成纖維細胞的組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶HAT1基因的表達高于新生水牛和10 歲齡水牛（P＜0.01），而新生水牛和10 歲齡水牛無顯著差異；3 月齡胎兒水牛成纖維細胞的組蛋白去乙?；窰DAC1基因的表達低于新生水牛與10 歲齡水牛（P＜0.01），10 歲齡水牛高于新生水牛（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，隨水牛年齡增長，水牛成纖維細胞的組蛋白乙酰化水平呈降低趨勢。

圖4 組蛋白乙?；嚓P(guān)基因在不同年齡水牛成纖維細胞中的相對表達

3 討 論

水牛是我國寶貴的種質(zhì)資源之一，其繁殖率低、遺傳改良程度慢等限制了水牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。成纖維細胞在動物克隆中是最常用且易獲得的供體細胞。研究水牛成纖維細胞的生長情況及表觀遺傳學將有助于提高水牛體細胞克隆效率而實現(xiàn)良種水牛的快速擴繁。因此，本研究使用細胞組織塊培養(yǎng)法獲得了水牛成纖維細胞，通過觀察原代細胞擴展情況，發(fā)現(xiàn)3 月齡胎兒水牛細胞在3～4 d 就已經(jīng)爬出，而新生水牛與10 歲齡水牛的細胞在6～7 d 才爬出，說明年齡越高原代細胞的擴展速率越慢，這可能與細胞的增殖能力有關(guān)。同時，隨著年齡增長，細胞增殖能力呈下降趨勢，主要表現(xiàn)為在1～5 d內(nèi)3 月齡胎兒水牛成纖維細胞增殖能力高于另外2 組。Young 等[8]報道，遺傳背景完全相同的牛胎兒成纖維細胞和成體成纖維細胞，前者的前8 代群體平均倍增時間為27.4 h，后者前3 代為44 h，表明胎兒細胞的增殖速度明顯較成體快。這個結(jié)果也與Herley[9]在人的成纖維細胞中的研究結(jié)果一致。這些研究表明胎兒成纖維在進行原代和傳代培養(yǎng)時生長旺盛，傳代次數(shù)較多，且能維持良好的細胞狀態(tài)，便于開展實驗研究，具有較高的應(yīng)用潛力。

在哺乳動物克隆中，細胞供體核的完全重新編程是保證克隆效率和產(chǎn)生正常克隆動物的先決條件[10-12]，DNA 甲基化和組蛋白乙?；揎椀腻e誤被認為是供體核的不完全編程的重要原因[13-14]。CpG（二核苷酸胞嘧啶殘基）的DNA 甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾，由3 種DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B介 導(dǎo)[15]。Giraldo 等[16]證明了使用低DNMT1mRNA 表達水平的供體細胞獲得的核移植胚胎比使用高DNMT1mRNA 表達水平的供體細胞獲得的核移植胚胎具有更強的發(fā)育能力。這說明供體細胞中的DNMT1和DNMT3A敲低可提高基因特異性DNA甲基化和組蛋白修飾的重編程效率，從而提高胚胎發(fā)育能力[17-18]。在豬的體細胞核移植研究中發(fā)現(xiàn)SCNT 胚胎中DNMT1的敲低可以提高SCNT 的效率，進一步表明合子基因激活（ZGA）之前DNMT1的同工型基因DNMT1s的高表達是SCNT 胚胎發(fā)育停滯的原因[19]。所以為增強SCNT 胚胎發(fā)育，應(yīng)去除供體細胞中的DNMT1。在不同的表觀遺傳修飾中，高乙酰化狀態(tài)通過核小體與DNA 的結(jié)合松弛，促進各種因子進入核小體，促進轉(zhuǎn)錄激活，進而增強SCNT 胚胎的體外發(fā)育。另一方面，DNA 甲基化可以使組蛋白乙?；嚓P(guān)基因的表達受到抑制而處于靜止表達的狀態(tài)，從而導(dǎo)致高DNA 甲基化和低組蛋白乙酰化狀態(tài)共存的現(xiàn)象[20]。本研究中，水牛成纖維細胞DNA 甲基化水平隨年齡的增加而升高，組蛋白乙?；脚c之相反，這一結(jié)果證實了高DNA 甲基化與低組蛋白乙?；泊娴默F(xiàn)象。供體細胞核的DNA 甲基化狀態(tài)可以影響體細胞核移植效率，核的低DNA 甲基化程度可以改善重編程效率[21]。本研究中3 月齡的胎兒水牛成纖維細胞DNA 甲基化水平最低，其分化程度相對于新生水牛和10 歲齡水牛較低，暗示其更容易發(fā)生重編程過程。

為了提高哺乳動物體細胞克隆效率，還需要對SCNT 涉及的因素和機制進行系統(tǒng)分析。近年來，隨著生物技術(shù)的進步，特別是單細胞轉(zhuǎn)錄組測序的應(yīng)用，在發(fā)現(xiàn)和鑒定與克隆胚胎發(fā)育有關(guān)的重編程因子方面取得了巨大進展，尤其是非編碼RNA 和染色質(zhì)開放有關(guān)的研究[22-24]。在本實驗基礎(chǔ)上，深入探索不同調(diào)控因素對水牛成纖維細胞供體細胞增殖、表觀遺傳修飾的變化，如不同細胞代數(shù)、不同的培養(yǎng)方法、表觀遺傳修飾物等，進一步運用生物測序技術(shù)解析細胞轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控與染色質(zhì)開放性的關(guān)系，可為完善水牛成纖維細胞作為核移植供體提供更多的分析數(shù)據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究成功獲得了廣西3 月齡的胎兒水牛、新生水牛和10 歲齡水牛成纖維細胞系，3 月齡胎兒水牛成纖維細胞增殖能力最強、DNA 甲基化水平最低、組蛋白乙?；阶罡摺⒔M蛋白去乙?；阶畹停醪胶Y選出3 月齡胎兒水牛成纖維細胞可能更適合作為水?？寺」w細胞。