孫海潮，肖明霞，劉韶娜，張 斌，趙彥光*，趙素梅*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201；2.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南昆明 650224）

雜交后代杜藏豬（杜洛克豬♂×迪慶藏豬♀）是以杜洛克豬為父本、迪慶藏豬為母本雜交而成，雜交杜滇豬（杜洛克豬♂×滇南小耳豬♀）是以杜洛克豬為父本、滇南小耳豬為母本雜交而成。迪慶藏豬、滇南小耳豬是云南省優(yōu)良的地方品種，其中迪慶藏豬為我國特有的高原型地方豬品種，主要分布在迪慶高寒地區(qū)，抗病力和抗逆性強，耐寒、耐粗飼[8-9]，滇南小耳豬作為小型豬具有體型小、早熟、遺傳穩(wěn)定、抗逆性強等獨特的基因資源，是理想實驗動物模型。杜洛克是世界著名瘦肉型豬種之一，其生長快、瘦肉多、適應(yīng)性強，能耐低溫，但對高溫的耐力較差。本研究采用PCR-RFLP 法對杜滇豬、杜藏豬的SLA-DQB、SLA-DRB基因第二外顯子進行研究、檢測并分析其多態(tài)性，與迪慶藏豬、滇南小耳豬、杜洛克豬的SLA-DQB、SLA-DRB基因第二外顯子的雜合度和多態(tài)信息含量等進行比較，分析其雜交后的變化，探究雜交豬SLA-DQB、SLA-DRB基因第二外顯子多態(tài)性的雜交優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗豬群：迪慶藏豬47 頭、滇南小耳豬53 頭、杜洛克豬56 頭、杜藏豬（杜洛克豬♂×迪慶藏豬♀）30 頭、杜滇豬（杜洛克豬♂×滇南小耳豬♀）33 頭，均來自云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院實驗豬場，每頭豬剪取1 g 左右豬耳組織，保存于裝有75%乙醇的1.5 mL Eppendorf 管中，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑及儀器 限制性內(nèi)切酶RsaI、限制性內(nèi)切酶HaeIII（購自北京擎科生物科技有限公司）；培清JS-780 型凝膠成像儀；PCR 擴增儀、電泳儀（購自美國BIO-RAD 公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 DNA 提取 參照DNA 提取試劑盒說明書進行提取。

1.3.2 引物設(shè)計及合成 檢索基因數(shù)據(jù)庫找到相關(guān)基因片段序列，查閱文獻，根據(jù)Shia[10]等報道對SLA-DQB基因（Gene ID：100037921）和SLA-DRB基因（Gene ID：100153386）第二外顯子的引物序列進行設(shè)計，由北京擎科生物科技有限公司合成，SLA-DQB、SLADRB擴增片段大小分別為273、245 bp，引物序列設(shè)計見表1。

表1 SLA-DQB 和SLA-DRB 基因擴增引物

1.3.3 PCR 擴增 根據(jù)參考文獻和實驗得出SLA-DQB、SLA-DRB基因第二外顯子PCR 擴增最佳反應(yīng)條件和體系。擴增體系（25 μL）為：2×Taq PCR Mix（10 mmol/L）12.5 μL、上游引物（100 mol/L）1 μL、下游引物（100 mol/L）1 μL、DNA 模板（10×）2 μL、ddH2O 8.5 μL。SLA-DQB基因PCR 擴增反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min、94℃變性30 s、61.9℃退火45 s、72℃延伸45 s、共30 個循環(huán)，最后72 ℃延伸8 min；SLADRB基因PCR 擴增反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性2 min、98℃變性10 s、59℃退火30 s、72℃延伸20 s、共30 個循環(huán)，最后72℃延伸1 min。取PCR 擴增產(chǎn)物（5 μL）進行電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照，與預(yù)期的片段大小相同則擴增成功。

1.3.4 DNA 序列測定 待測樣本送至北京擎科生物有限公司昆明分公司進行檢測。

目前，許多建筑工程在空間設(shè)計過程中都注重節(jié)能策略的應(yīng)用。進一步完善和改進節(jié)能策略的應(yīng)用理念和方式，可以為建筑空間設(shè)計工作的發(fā)展提供有利的條件。但目前，在很多建筑施工過程中仍然采用普適的空間設(shè)計理念，忽視了節(jié)能策略的應(yīng)用，為了提高建筑空間設(shè)計的質(zhì)量，實施節(jié)能戰(zhàn)略，建筑工程不僅要認(rèn)識和理解節(jié)能戰(zhàn)略與空間設(shè)計的關(guān)系，而且要注意要點和原則。只有這樣，才能有效地提高建筑空間的設(shè)計水平，有助于城市化建設(shè)和發(fā)展。

1.3.5 PCR-RFLP 檢測 用限制性內(nèi)切酶HaeIII、RsaI分別對實驗豬群SLA-DQB、SLA-DRB基因第二外顯子PCR 擴增產(chǎn)物進行酶切，37℃過夜完成酶切反應(yīng)。酶切體系（20 μL）為：HaeIII 酶（1000 0 U/mL）0.2 μL/RsaI 酶（1000 0 U/mL）0.2 μL、PCR 擴增產(chǎn)物10 μL、Cut Smart Buffer（10×）1 μL、ddH2O 8.8 μL。最后用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，觀察酶切結(jié)果并判斷基因型。

1.3.6 統(tǒng)計分析 運用DNA Star 軟件對DNA 序列進行比較分析，用Primer 5.0 軟件進行酶切位點分析，根據(jù)HaeIII、RsaI 內(nèi)切酶的識別位點，對SLA-DQB基因和SLA-DRB基因第二外顯子的酶切帶型圖譜進行分析，確定各個泳道的RFLP 帶型，判斷基因型并標(biāo)記。通過Excel 計算限制性酶切位點的等位基因頻率、雜合度（He）及多態(tài)信息含量（PIC）。

2 結(jié)果

2.1 PCR 擴增結(jié)果 用1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測實驗豬SLA-DQB、SLA-DRB基因第二外顯子PCR 擴增產(chǎn)物，結(jié)果如圖1、圖2，長度分別為273、245 bp，符合預(yù)期的擴增片段長度，可進行RFLP 分析。

圖1 SLA-DQB 基因第二外顯子的PCR 擴增結(jié)果

圖2 SLA-DRB 基因第二外顯子的PCR 擴增結(jié)果

2.2 DNA 序列檢測結(jié)果及SNP 位點識別 目的片段測序結(jié)果顯示，實驗豬群SLA-DQB、SLA-DRB基因第二外顯子的片段大小分別為273 bp 和245 bp，與本研究結(jié)果相符，與有關(guān)文獻報道一致[11]。實驗豬群SLADQB基因第二外顯子擴增序列共5 個SNP 位點：5'端第二外顯子40 bp 處存在堿基T 突變?yōu)閴A基G（T40G），5'端第二外顯子84、189 bp 處存在堿基G 突變?yōu)閴A基A（G84A、G189A），5'端第二外顯子171 bp 處存在堿基A 突變?yōu)閴A基G（A171G），5'端第二外顯子221 bp處存在堿基C 突變?yōu)閴A基A（C221A）（圖3）。

圖3 SLA-DQB 基因第二外顯子SNP 位點序列比對

實驗豬群SLA-DRB基因第二外顯子擴增序列有4個SNP 位點：5'端第二外顯子92 bp 處存在堿基A 突變?yōu)閴A基G（A92G）；5'端第二外顯子112 bp 處存在堿基A 突變?yōu)閴A基T（A112T）；5'端第二外顯子142 bp處存在堿基A 突變?yōu)閴A基T（A142T）；5'端第二外顯子180 bp 處存在堿基G 突變?yōu)閴A基T（G180T）（圖4）。

圖4 SLA-DRB 基因第二外顯子的序列SNP 位點比對

2.3 PCR-RFLP 分型結(jié)果及多態(tài)性分析結(jié)果 實驗豬個體用PCR-RFLP 方法檢測分型并計算出基因型頻率和等位基因頻率，將條帶屢次不清晰沒有結(jié)果的樣本舍棄，得到有效樣本總數(shù)。杜洛克豬、迪慶藏豬、滇南小耳豬、杜藏豬、杜滇豬SLA-DQB基因第二外顯子的有效樣本個數(shù)分別為56、47、53、30、33 個，SLA-DRB基因第二外顯子的有效樣本個數(shù)分別為53、44、49、29、29 個。

2.3.1SLA-DQB基因第二外顯子PCR-RFLP 分型結(jié)果及多態(tài)性分析結(jié)果HaeIII 內(nèi)切酶識別位點為5'...GG↓CC...3'，經(jīng)DNAStar 軟件分 析，SLA-DQB基因第二外顯子含有4 個HaeIII 酶切位點，理論上，酶切帶型為84 bp/83 bp/23bp/29 bp/54 bp，記為“B 等位基因”；但實際研究中出現(xiàn)4 條酶切帶型，與理論上不同的3 條分別為：167 bp/52 bp/54 bp；167 bp/4 bp/102 bp；40 bp/127 bp/4 bp/102 bp，分別記為A、C、E 等位基因；與測序結(jié)果相符合，說明基因發(fā)生突變，酶切識別位點位置發(fā)生改變。5 個豬種共檢測得到A、B、C、E 4 個等位基因，AA、AB、AC、BB、BC、CC、EE 7 種基因型。杜洛克豬共檢測到AA、AB、BB、BC、CC 5 種基因型，A、B、C 3 個等位基因。迪慶藏豬共檢測到AA、BB、BC、CC、EE 5 種，A、B、C、E 4個等位基因，是檢測的所有豬種中唯一擁有E 等位基因、EE 基因型的豬種。滇南小耳豬共檢測到AB、BC、CC 3 種基因型，A、B、C 3 個等位基因。3 個豬種的優(yōu)勢基因都是C 等位基因，基因頻率分別為0.661、0.511、0.774，優(yōu)勢基因型都為CC 型，HaeIII 酶切結(jié)果見圖5。

圖5 父本、母本豬SLA-DQB 基因第二外顯子Hae III 酶切結(jié)果

杜藏豬共檢測到AB、AC、BB、BC、CC 5 種基因型，A、B、C 3 個等位基因，且優(yōu)勢基因與其雙親一致為C等位基因，基因頻率為0.517，優(yōu)勢基因型也都為CC 型。杜滇豬共檢測到AB、AC、BB、BC、CC 5 種基因型，A、B、C 3 個等位基因。杜滇豬與其雙親不同的是，優(yōu)勢基因為B 等位基因，基因頻率為0.470，優(yōu)勢基因型也與雙親不同，為BC 型。酶切結(jié)果見圖6。

圖6 雜交后代豬SLA-DQB 基因第二外顯子Hae III 酶切結(jié)果

SLA-DQB基因第二外顯子在HaeIII-RFLP 位點上，被檢測的豬群均表現(xiàn)多態(tài)性。如表2 所示，迪慶藏豬SLA-DQB基因第二外顯子PIC 為0.555，呈高度多態(tài)（PIC＞0.5），在5 個豬種中最高，杜洛克豬和滇南小耳豬分別為0.419、0.298，呈中度多態(tài)（0.25≤PIC≤0.5）；杜藏豬的PIC 為0.420，呈中度多態(tài)（0.25≤PIC≤0.5）；杜滇豬的PIC 為0.523，呈高度多態(tài)（PIC＞0.5）。迪慶藏豬的He 為0.619，呈高度雜合（He＞0.5），在5 個豬種中最高；杜洛克豬和滇南小耳豬的He 分別為0.487、0.354，都呈中度雜合（0.25≤He≤0.5）；杜藏豬和杜滇豬的He 分別為0.529、0.606，都呈高度雜合（He＞0.5）。

表2 SLA-DQB 基因第二外顯子等位基因頻率和基因型頻率

2.3.2SLA-DRB基因第二外顯子PCR-RFLP 分型結(jié)果及多態(tài)性分析結(jié)果RsaI 內(nèi)切酶識別位點為5'...GT↓AC...3'；經(jīng)DNA Star 軟件分析，理論上，RsaI酶含有2 個酶切位點，酶切后產(chǎn)生一條酶切帶型為：141 bp/93 bp/11 bp，記為A 等位基因；實際研究中出現(xiàn)4 條酶切帶型，不同于理論上的3 條帶型分別為：111 bp/69 bp/54 bp/11 bp；93 bp/48 bp/39 bp/54 bp/11 bp；180 bp/54 bp/11 bp；分別記為B、C、D 等位基因；與測序結(jié)果相符合，說明基因發(fā)生突變。用2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，5 個豬種共檢測得到A、B、C、D 4 個等位基因，AA、AB、AC、AD、BB、BD、CC、DD 8 種基因型。

杜洛克豬共檢測到AA、AB、CC 3 種基因型、A、B、C 3 個等位基因；迪慶藏豬共檢測到AA、AB、AD、BB、CC、DD 6 種基因型，A、B、C、D 4 個等位基因；滇南小耳豬共檢測到AA、AB、AC、AD、BB 5 種基因型，A、B、C、D 3 個等位基因。3 個豬種的優(yōu)勢基因都是A 等位基因，基因頻率分別為0.943、0.670、0.633，杜洛克豬和迪慶藏豬的優(yōu)勢基因型都為AA 型，滇南小耳豬為AB 型，RsaI 酶切結(jié)果見圖7。

圖7 父本、母本豬SLA-DRB 基因第二外顯子Rsa I 酶切結(jié)果

杜藏豬共檢測到AB、AB、AC、AD、BB、BD、CC、DD 8 種基因型，A、B、C、D 4 個等位基因。杜藏豬的優(yōu)勢基因與雙親一致為A 等位基因，基因頻率為0.448，優(yōu)勢基因型也與雙親一致為AA 型，但杜藏豬出現(xiàn)了雙親都沒有的AC、BD 基因型。杜滇豬共檢測到AA、AB、BB、BD、DD 5 種基因型，A、B、D 3 個等位基因，杜滇豬與父本杜洛克豬一致，沒有C 等位基因，優(yōu)勢基因為B 等位基因，基因頻率為0.483，優(yōu)勢基因型為BB 型。RsaI 酶切結(jié)果見圖8。

圖8 雜交后代豬SLA-DRB 基因第二外顯子Rsa I 酶切結(jié)果

SLA-DRB基因第二外顯子在RsaI-RFLP 位點上，被檢測的豬群均表現(xiàn)多態(tài)性。由表6 可知，杜洛克豬SLA-DRB基因第二外顯子PIC 為0.101 1，呈低度多態(tài)（PIC＜0.25），在5 個豬種中最低；迪慶藏豬和滇南小耳豬的PIC 分別為0.456、0.426，都呈中度多態(tài)（0.25≤PIC≤0.5）。杜藏豬的PIC 為0.602，呈高度多態(tài)（PIC＞0.5），在5 個豬種中最高；杜滇豬中為0.533，呈高度多態(tài)（PIC＞0.5）。杜洛克豬的He 為0.106，呈低度雜合（He＜0.25），在5 個豬種中最低；迪慶藏豬和滇南小耳豬He 分別為0.503、0.503，都呈高度雜合（He＞0.5）。杜藏豬的He 為0.602，呈高度雜合（He＞0.5），在5 個豬種中最高；杜滇豬的He 為0.612，呈高度雜合（He＞0.5）。各遺傳多態(tài)性參數(shù)計算結(jié)果見表3。

3 討 論

豬品種間雜交會使核苷酸序列變異，從而引起基因型的變異。喻傳洲[12]研究雜種優(yōu)勢的表現(xiàn)規(guī)律時提出，雜交親本的遺傳差異程度與雜種優(yōu)勢率呈正向關(guān)聯(lián)，即親本差異越大，雜種優(yōu)勢越大，且雜種優(yōu)勢與雜種群內(nèi)的基因雜合程度有關(guān)。并且有關(guān)研究表明，SLA-DQB、SLA-DRB基因的高雜合度和高度多態(tài)信息含量有利于機體對多樣性的外來抗原選擇，提高其抗病力[13]。本研究結(jié)果顯示：杜藏豬SLA-DQB基因第二外顯子含5 個基因型，出現(xiàn)雙親沒有的AC 型；杜滇豬SLA-DQB基因第二外顯子含5 個基因型，出現(xiàn)雙親沒有的AC 型。杜藏豬的PIC 和He 高于父本杜洛克豬但略低于母本迪慶藏豬，而杜滇豬的PIC 和He 都高于雙親，因此杜滇豬SLA-DQB基因第二外顯子的多態(tài)性表現(xiàn)出良好的雜交優(yōu)勢。談永松等[14]研究表明杜洛克豬SLA-DRB第二外顯子呈低度多態(tài)，出現(xiàn)AA、AB 型，變異程度較低，品種純合度高。本研究結(jié)果表明，杜藏豬SLA-DRB第二外顯子含8 個基因型，出現(xiàn)了雙親都沒有的AC、BD 基因型；杜滇豬SLA-DRB第二外顯子含5 個基因型，出現(xiàn)雙親都沒有的BD、DD 基因型；其他豬種的優(yōu)勢等位基因都為A 等位基因，只有杜滇豬為B 等位基因。杜滇豬和杜藏豬SLA-DRB基因第二外顯子的PIC 和He 都高于雙親，表現(xiàn)出了良好的雜交優(yōu)勢。

田大成等[15]提出，在基因序列中只要插入或缺失某一個關(guān)鍵核苷酸，或有另一個核苷酸替代原有的核苷酸，會形成新的氨基酸，其性狀就會發(fā)生變異，或者影響到周圍其他核苷酸的變異。齊芬芳[16]等篩選出與香豬抗病性狀相關(guān)的重要候選基因23 個，其中10 個基因編碼膜上蛋白，與CD14 分子、MHCII 類分子以及T 細胞誘導(dǎo)等相關(guān)，在免疫相關(guān)代謝通路中起著極其重要的作用，并提出基因組水平的結(jié)構(gòu)變異影響基因的功能，以致影響個體表型性狀。本研究中，杜藏豬SLADQB基因第二外顯子出現(xiàn)了父本杜洛克豬的4 個SNP位點（G84A、A171G、G189A、C221A），但沒有發(fā)現(xiàn)母本的T40G 突變位點；杜滇豬SLA-DQB基因第二外顯子的SNP 位點與雙親相比較，未出現(xiàn)A171G 這1個SNP 位點；杜藏豬、杜滇豬SLA-DQB基因第二外顯子的DNA 序列檢測及SNP 位點識別結(jié)果，表明是核苷酸突變。杜藏豬SLA-DRB第二外顯子出現(xiàn)了父本杜洛克豬的2 個SNP 位點（A112T、A142T）、母本迪慶藏豬的2 個SNP 位點（A92G、G180T）；杜滇豬SLA-DRB第二外顯子出現(xiàn)了父本杜洛克豬的2 個SNP位點（A112T、A142T），母本滇南小耳豬的1 個SNP位點（G180T），但出現(xiàn)了雙親沒有的BD、DD 基因型。杜藏豬、杜滇豬SLA-DRB基因第二外顯子的DNA 序列檢測及SNP 位點識別結(jié)果，表明雜交使得杜藏豬、杜滇豬核苷酸序列發(fā)生改變，從而引起基因型變異。母童等[17]對煙臺黑豬SLA-DQB基因第二外顯子多態(tài)性及其與仔豬腹瀉進行了關(guān)聯(lián)分析，王國梅等[18]對八眉豬也進行了相關(guān)研究，都表明仔豬腹瀉的易感性和抗性與不同基因型有著必然的聯(lián)系。本研究中SNP 位點突變是否對雜交仔豬腹瀉的易感性和抗性產(chǎn)生影響、有何具體關(guān)系還需進一步研究。

吳晶等[19]提出迪慶藏豬由于長期處于自繁自養(yǎng)的狀態(tài)，近交現(xiàn)象比較嚴(yán)重，農(nóng)（牧）民飼養(yǎng)管理技術(shù)欠缺指導(dǎo)等導(dǎo)致優(yōu)良個體數(shù)、群體數(shù)量和規(guī)模都呈減少狀態(tài)。本研究中迪慶藏豬SLA-DQB基因第二外顯子出現(xiàn)其他4 種豬沒有的EE 基因型，可能與品種培育歷史和高寒的地理環(huán)境有關(guān)。迪慶藏豬SLA-DQB基因第二外顯子PIC 和He 在5 個豬種中最高；SLA-DRB第二外顯子也呈高度雜合、高度多態(tài)，劉韶娜等[20]研究發(fā)現(xiàn)杜藏豬（杜洛克豬♂×迪慶藏豬♀）的生長性能及屠宰性能較雜交前均有提高，表明應(yīng)用國外優(yōu)良的瘦肉型豬與迪慶藏豬雜交不僅可以提高經(jīng)濟效益，還能利用雜交優(yōu)勢增強雜交豬對環(huán)境的適應(yīng)性、提高抗病能力，也能一定程度上保護迪慶藏豬這一珍貴的地方豬種資源。由杜藏豬、杜滇豬SLA-DQB和SLA-DRB基因第二外顯子表現(xiàn)出良好的雜交優(yōu)勢也提示，有必要進一步研究雜交豬種基于SLA基因氨基酸變異的功能多肽與豬抗病性和異種移植之間的關(guān)系，從而更好地利用雜交豬種的雜交優(yōu)勢并為抗病育種的實際工作提供理論指導(dǎo)。