魏清宇，張 旗，李培峰，葉紅心，崔少華，李亞妮

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院（畜牧獸醫(yī)研究所），山西太原 030032；2.山西省畜牧獸醫(yī)學(xué)校，山西太原 030024）

邊雞是山西省唯一的優(yōu)良地方雞種，是《國(guó)家畜禽遺傳資源品種名錄》中的地方品種之一，現(xiàn)保存了麻羽單冠、黑羽單冠、白羽單冠、白羽復(fù)冠和有色羽復(fù)冠共5 種固定品系[1]。在前期的研究工作中，通過(guò)采用PCRRFLP 技術(shù)對(duì)6 世代和7 世代的麻羽單冠邊雞的MSTN基因進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在MSTN基因編碼區(qū)外顯子1 的C.234 bp 處存在一個(gè)G＞A 的突變位點(diǎn)，并鑒定了3種基因型（AA、AG、GG）[2]。根據(jù)前期研究結(jié)果，本課題組剔除雜合子AG 基因型，成功建立了邊雞快長(zhǎng)系（AA）和慢長(zhǎng)系（GG）[3]。采用家系選育和個(gè)體選育相結(jié)合、以個(gè)體選育為主的方法進(jìn)行選育[4]，從2014 年到2019 年已選育6 個(gè)世代，各世代遵循112 日齡AA 選留體重大、GG 選留體重小的原則，以112 日齡體重為主要選育依據(jù)進(jìn)行常規(guī)育種的雙向選擇。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)測(cè)定邊雞新品系6 個(gè)世代的生長(zhǎng)性能，并利用PCR-RFLP技術(shù)檢測(cè)5 世代核心群的基因型，檢驗(yàn)新品系雙向選擇效果[5]，為新品系的繼續(xù)選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 用于選育的邊雞新品系（AA 與GG）來(lái)自山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所國(guó)家級(jí)邊雞保種場(chǎng)，由專人飼養(yǎng)和管理，管理和營(yíng)養(yǎng)水平一致。飼養(yǎng)至16 周齡時(shí)對(duì)5 世代核心群進(jìn)行翅靜脈采血，肝素鈉抗凝，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 生長(zhǎng)性能 對(duì)各世代核心群邊雞進(jìn)行空腹體重測(cè)定，記錄生長(zhǎng)性能（初生重、6 周齡、16 周齡體重）。

1.3 孵化性能 記錄各世代的入孵蛋數(shù)、白蛋數(shù)、死胎數(shù)、受精蛋數(shù)、出雛數(shù)，計(jì)算受精率和受精蛋孵化率。

1.4 PCR-RFLP 分析 對(duì)5 世代AA 和GG 核心群公母雞進(jìn)行基因型檢測(cè)。PCR 擴(kuò)增所用引物參考文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)，序列為：F：5'-GCATTAGCAGGGACGTTAT-3'，R：5'-AC TCCGTAGGCATTGTGAT-3'，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR 反應(yīng)體系為25 μL：Taq PCR Master Mix（2×,blue dye）12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA 模板（50 ng/μL）2 μL，ddH2O 8.5μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性6 min；94℃ 30 s，56℃30 s，72℃30 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

酶切反應(yīng)體系為20 μL：PCR 產(chǎn)物5 μL，BbvI 酶（2 U/μL）2.5 μL，10×Buffer 2 μL，ddH2O 10.5 μL，37℃酶切2 h。酶切產(chǎn)物用10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳檢測(cè)，硝酸銀染色，Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)成像，并判斷基因型。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析 對(duì)AA 和GG 公母雞生長(zhǎng)性能數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，用SPSS 18.0 軟件分析不同品系和世代間的差異，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。利用Excel 整理出2 個(gè)新品系邊雞公母雞體重?cái)?shù)據(jù)，并繪制成生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同世代相同周齡公母雞的體重分析 邊雞新品系6 個(gè)世代生產(chǎn)性能見(jiàn)表1～2。由表1 可見(jiàn)，各世代從初生到16 周齡，AA 公雞的體重均極顯著高于GG 公雞。從2 世代開(kāi)始，AA 公雞16 周齡的體重與上世代相比，分別增加223.93、128.65、82.55、10.03、62.09 g，6 個(gè)世代平均增重101.45 g；AA 公雞6 世代的16 周齡體重由1 世代的1 600.37 g 增加到2 107.62 g，提高了31.70%；GG 公雞16 周齡的體重與上世代相比，分別減少47.49、87.95、110.34、19.28、181.09 g，6 個(gè)世代平均減重89.23 g；GG 公雞6 世代的16 周齡體重由1 世代的1 429.30 g 降低到1 078.13 g，減少了24.57%。

由表2 可知，邊雞各世代母雞從出生到16 周齡，AA 體重均極顯著高于GG。從2 世代開(kāi)始，AA 母雞16 周齡的體重與上世代相比，分別增加175.03、64.09、89.93、11.30、46.96 g，6 個(gè)世代平均增重77.46 g。AA 母雞6 世代的16 周齡體重由1 世代的1 205.18 g 增加到1 592.49 g，提高了32.14%；GG 母雞16 周齡的體重與上世代相比，分別減少92.05、125.50、69.66、87.83、50.97 g，6 個(gè)世代平均減重85.20 g；GG 母雞6 世代的16 周齡體重由1 世代的1 056.03 g 降低到814.12 g，減少了22.91%，說(shuō)明以分子標(biāo)記輔助育種為基礎(chǔ)的邊雞新品系雙向選擇效果明顯。

表2 邊雞新品系母雞6 個(gè)世代生長(zhǎng)性能 g

2.2 邊雞新品系公母雞生長(zhǎng)趨勢(shì)比較 由表1～2 可知，在選育初期的1 世代和2 世代，AA 公雞、GG 公雞的體重均高于AA 母雞和GG 母雞。如圖1 所示，AA 公母雞的生長(zhǎng)曲線走向一致，呈上升趨勢(shì)，體重在6 世代達(dá)最大；GG 公母雞的生長(zhǎng)曲線相似，體重呈下降趨勢(shì)，體重在6 世代達(dá)最小。這表明，6 個(gè)世代的選育對(duì)AA和GG 邊雞的生長(zhǎng)速度產(chǎn)生了積極的改變，反映出育種效果明顯。

表1 邊雞新品系公雞6 個(gè)世代生長(zhǎng)性能 g

圖1 邊雞新品系16 周齡生長(zhǎng)曲線

2.3 邊雞新品系的孵化性能 如表3 所示，除3 世代和6 世代的AA，其他各世代AA 和GG 的種蛋受精率均在90%以上。

表3 孵化記錄

2.4 PCR-RFLP 分子檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)BbvI 酶切后，檢測(cè)到AA 型（162 bp）和GG 型（127 bp）2 種基因型（圖2和圖3）。AA 基因型無(wú)BbvI 酶切位點(diǎn)，此時(shí)是162 bp的片段；GG 基因型有一個(gè)BbvI 酶切位點(diǎn)，酶切后產(chǎn)生127 bp 和35 bp 2 個(gè)片段。檢測(cè)的AA 個(gè)體均為AA純合子基因型，GG 個(gè)體均為GG 純合子基因型，基因型純合率為100%，無(wú)雜合子個(gè)體。

圖2 AA 酶切產(chǎn)物電泳圖

3 討 論

MSTN基因第1 外顯子C.234 G＞A 的突變（G2283A）在多個(gè)雞種中都有報(bào)道。王彥欽等[7]發(fā)現(xiàn)MSTN基因多態(tài)性與拜城公雞12 周齡時(shí)的體重呈顯著相關(guān)，AA 基因型個(gè)體的體重顯著高于GG 基因型個(gè)體。金崇富[8]的研究結(jié)果表明鹽城地方雞種MSTN基因G2283A 處的突變位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)。Zhang 等[9]采用PCRRFLP 技術(shù)在0～18 周齡邊雞母雞群體中檢測(cè)到該基因的相同突變位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)在6～16 周齡時(shí)，AA 和GA 基因型個(gè)體的體重均極顯著高于GG 基因型個(gè)體，AA和GA 基因型間差異不顯著（12 周齡除外）；在12、16、18 周齡時(shí)，AA 基因型個(gè)體的體重顯著高于GA 基因型個(gè)體，GA 基因型個(gè)體的體重顯著高于GG 基因型個(gè)體，AA 基因型雞的體重最大，GG 基因型雞的體重最小。不同世代相同周齡公母雞的體重分析結(jié)果顯示16 周齡是2 個(gè)邊雞新品系生長(zhǎng)的拐點(diǎn)日齡，這也是本研究將16 周齡作為統(tǒng)計(jì)分析節(jié)點(diǎn)的原因。本實(shí)驗(yàn)中，在初生重、6 周齡和12 周齡時(shí)，AA（公雞和母雞）的體重均極顯著高于GG，與前人研究結(jié)果相似。經(jīng)過(guò)6個(gè)世代的雙向選擇，AA 公雞6 世代16 周齡的體重相較于1 世代提高了31.70%，母雞提高了31.24%。GG 公雞的6 世代16 周齡體重相較于1 世代減少了24.57%，母雞減少了22.91%，說(shuō)明MSTN基因第1 外顯子的C.234 G＞A 突變位點(diǎn)在本實(shí)驗(yàn)中得到充分利用，對(duì)邊雞的生產(chǎn)性能進(jìn)行了標(biāo)記輔助選擇，AA 越選體重約大，GG 越選體重越小，最終會(huì)在某一個(gè)世代趨于穩(wěn)定。

本實(shí)驗(yàn)利用MSTN基因第1 外顯子的突變位點(diǎn)，對(duì)6 個(gè)世代邊雞的生長(zhǎng)性狀進(jìn)行輔助選育，形成由AA快長(zhǎng)系和GG 慢長(zhǎng)系2 個(gè)新品系組成的快慢型群體，驗(yàn)證了MSTN基因C.234 位點(diǎn)應(yīng)用于邊雞分子輔助選擇的可行性和可靠性，同魏岳[10]研究結(jié)果一致。結(jié)果顯示，從初生到16 周齡體重，AA 體重均極顯著高于GG 體重，這與張跟喜[6]前期的研究結(jié)果不一致，原因可能是邊雞經(jīng)過(guò)選育，MSTN基因外顯子1 的C.234 突變位點(diǎn)對(duì)邊雞初生重的影響逐漸凸顯。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果將為邊雞配套系的培育提供新的選育素材，最終為邊雞種質(zhì)資源的保護(hù)和利用提供科學(xué)依據(jù)。