付開斌，陳 祥*，吳 雨，周志楠，張 艷，惠茂茂

（1.貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴州貴陽 550025；2.貴州大學動物科學學院，貴州貴陽 550025）

IGF（Insulin-Like Growth Factors）家族因其結(jié)構(gòu)與胰島素十分相似，故被人們稱作“胰島素樣生長因子”。IGF 有3 種配體：IGF-1、IGF-2以及胰島素[1]。IGF 通過基因間的相互作用，共同調(diào)節(jié)動物的生物學過程，也是動物胚胎正常發(fā)育以及出生后動物生長發(fā)育所必需的生長因子[2]。研究表明，IGF 信號系統(tǒng)是構(gòu)成下丘腦-垂體-肝臟軸的主要調(diào)控部分，可以通過控制不同的生長因子及激素的分泌從而控制生物有機體的生長和發(fā)育[3]。IGF-1是一種多效性激素，可影響葡萄糖代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、免疫和神經(jīng)系統(tǒng)[4]。此外，IGF-1能控制脂肪、背最長肌比重、體重，促進非組蛋白磷酸化和細胞的生長和分化[5]。在斑馬魚咽裂期，在其胚胎中注射IGF-1，可提高相關(guān)家族基因的表達量，這表明IGF-1在促進前側(cè)結(jié)構(gòu)的生長發(fā)育方面有作用[6]。同時，研究發(fā)現(xiàn)IGF-1基因還可作為生長發(fā)育的候選基因[7]。IGF-2被人們稱為生長調(diào)節(jié)素A，在細胞增殖分化、有絲分裂以及程序性死亡等方面發(fā)揮重要作用，對生物個體的生長發(fā)育有重要影響[8]。有研究顯示，IGF-2在機體中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達量較高，說明IGF-2與大腦的生長及智力發(fā)育密切相關(guān)[9]。同時IGF-2還是胚胎和胎兒時期最重要的生長因子之一，IGF-2在胎兒時期的血液中濃度較高，出生后IGF-1的濃度迅速上升，推測IGF-2主要是調(diào)節(jié)胚胎時的生長，而IGF-1則主要調(diào)節(jié)出生后的生長發(fā)育[10]。另有研究發(fā)現(xiàn)IGF-2基因多態(tài)性對豬有重要的生理影響，它可以調(diào)節(jié)豬的瘦肉率、生長速度、背膘厚、心臟重量和背最長肌面積[11-13]。且IGF-2基因與腫瘤的發(fā)生有密切聯(lián)系，在動物體內(nèi)過表達會導致動物產(chǎn)生乳腺癌、前列腺癌和肝癌等多種疾病，在腫瘤病人的血中發(fā)現(xiàn)IGF-2及其結(jié)合蛋白異常增高[14]。IGF 家族在被研究者發(fā)現(xiàn)后，大多數(shù)動物IGFs 相繼被克隆并測序驗證，但IGF-1與IGF-2基因在牛不同組織中的表達譜卻鮮有報道。

關(guān)嶺牛作為貴州寶貴的畜禽遺傳資源，具有許多獨特的優(yōu)勢，其在數(shù)量性狀、經(jīng)濟性狀以及質(zhì)量性狀方面與其他黃牛相比，均呈現(xiàn)出顯著優(yōu)勢，在地方畜禽動物資源保護與利用方面具有重要的研究意義和較大的經(jīng)濟價值。因此，本研究通過熒光定量PCR 檢測IGF-1和IGF-2基因在關(guān)嶺牛不同組織中的表達，構(gòu)建關(guān)嶺牛IGF-1基因和IGF-2基因組織表達圖譜，以期為關(guān)嶺牛的生長發(fā)育、良種選育等提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 關(guān)嶺牛來自貴州省關(guān)嶺縣，根據(jù)生長飼養(yǎng)記錄，選取年齡為18 月齡、飼養(yǎng)條件相同、體重與體格相近的公牛3 頭。屠宰后，迅速采集肺臟、心臟、脾臟、腎臟、肝臟及背最長肌組織樣，對組織樣進行處理并標記，放入液氮中冷凍保存。帶回實驗室后，立即轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 儀器設(shè)備 PCR 擴增儀（C1000 TouchTM）、凝膠成像系統(tǒng)（Universal Hood II）及電泳儀（DYY-2C 型）均購自美國BIO-RAD 公司；超微量紫外分光光度計（μl trospec 2100 pro）購自安瑪西亞中國有限公司；實時熒光定量PCR 儀（CFX96 Real-Time System）購自上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.1.3 主要試劑 TRIzol、FirstStrand cDNA Synthesis、氯仿、異丙醇及2×Taq MasterMix 均購自貴州艾瑞特生物有限公司；八聯(lián)管、熒光染料UitraSYBRMixture（With ROX）及DNA Marker 1000 均購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設(shè)計及合成 在NCBI 數(shù)據(jù)庫中查找牛IGF-1基因（NM_001077828.1）和IGF-2基因（NM_001367627.1）mRNA 序列，通過Primer 5.0 軟件設(shè)計IGF-1基因和IGF-2基因的熒光定量引物，以GAPDH基因作為qRTPCR內(nèi)參基因，送生工生物（上海）股份有限公司進行合成。引物序列信息詳見表1。

表1 熒光定量引物信息

1.2.2 總RNA 的提取與檢測 使用TRIzol 法提取關(guān)嶺牛肝臟、脾臟、心臟、肺臟、腎臟及背最長肌組織的總RNA，使用超微量分光光度計測定RNA 的濃度與純度值，將檢測結(jié)果為單峰且A260/A280 值在1.80～2.10 之間的RNA 置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 cDNA 第一鏈合成 根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，對所采集的關(guān)嶺牛心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及背最長肌6 種不同組織樣品中的總RNA 進行反轉(zhuǎn)錄。反應體系為20 μL：RNA Template（ng/μL）9 μL，Oligo（dT）18Primer 1 μL，RI 1 μL，RT 1 μL，dNTP Mix 2 μL，Buffer 4 μL，Nuclease-free Water 1 μL，Random 1 μL。反應條件為42℃孵育60 min，70℃孵育5 min。結(jié)束后在超微量紫外分光光度計下進行濃度和純度檢測，將cDNA 產(chǎn)物置于-20℃冰箱保存。

1.2.4 實時熒光定量PCR 以GAPDH為內(nèi)參基因，對所采集的關(guān)嶺牛6 種不同組織的IGF-1基因和IGF-2基因mRNA 進行實時熒光定量PCR 檢測。反應體系為10 μL：2×UltraSYBR Mixture 5 μL，Primer Sense（10 pmol/μL）0.5 μL，Primer Anti-sense（10 pmol/μL）0.5 μL，cDNA（ng/μL）1 μL，ddH2O 3 μL。反應條件為：95℃ 3 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 1 min，循環(huán)39 次后進行溶解曲線分析，以每5 s 上升0.5℃的速率從65℃上升到95℃，實驗的每個樣品檢測做3 個重復，取平均值。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理及分析 采用2-ΔΔCt法分析IGF-1基因和IGF-2基因在關(guān)嶺牛6 個不同組織中的相對表達量，使用SPSS 19.0 軟件對2-ΔΔCt相對定量法所得數(shù)據(jù)進行分析，比較采用單因素方差分析，并使用LSD 法進行差異顯著性檢驗，分別以P＜0.05 和P＜0.01 為差異顯著和極顯著的判斷標準。

2 結(jié)果與分析

2.1IGF-1基因和IGF-2基因的PCR 擴增 通過反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 為模板，對IGF-1基因和IGF-2基因進行普通PCR 擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，結(jié)果見圖1。由圖1 可見，擴增產(chǎn)物條帶清晰、明亮、透明，無雜帶，且并未發(fā)現(xiàn)條帶上有引物二聚體，特異性較好，與本實驗所需要目的片段大小相符合，可進行下一步實驗。

圖1 IGF-1 基因和IGF-2 基因瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

2.2IGF-1基因和IGF-2基因熒光定量PCR 特異性檢測 由圖2、3 可見，在關(guān)嶺牛各組織中，IGF-1基因和IGF-2基因擴增曲線呈現(xiàn)完好的“S”形狀，無非特異性擴增產(chǎn)物，產(chǎn)物單一，擴增曲線平滑且未出現(xiàn)特殊趨勢；溶解曲線均呈單峰，峰值較好，且無其他引物二聚體雜峰出現(xiàn)，達到實驗要求。熒光強度均來源于特異性擴增的產(chǎn)物，表明關(guān)嶺牛IGF-1基因和IGF-2基因?qū)崟r熒光定量qRT-PCR 擴增的結(jié)果合理，并具有較好的代表性，所得數(shù)據(jù)可用于實驗結(jié)果分析。

圖2 IGF-1 基因在關(guān)嶺牛不同組織的擴增曲線與溶解曲線

2.3IGF-1基因在關(guān)嶺牛不同組織中的表達IGF-1基因在關(guān)嶺牛6 個不同組織中均有表達，表達結(jié)果如圖4所示。IGF-1基因表達趨勢由高到低依次為：肺臟＞肝臟＞心臟＞脾臟＞腎臟＞背最長??；通過比較分析可知，IGF-1基因在肺臟中的表達量極顯著高于所有組織，在肝臟中的表達量顯著高于背最長肌，其余各組織間均未達到差異顯著水平。

圖3 IGF-2 基因在關(guān)嶺牛不同組織的擴增曲線與溶解曲線

圖4 IGF-1 基因在關(guān)嶺牛6 個組織中的相對表達量

2.4IGF-2基因在關(guān)嶺牛不同組織中的表達 如圖5 所示，IGF-2基因在關(guān)嶺牛6 個組織中均有表達，表達量由高到低依次為：肺臟＞肝臟＞腎臟＞心臟＞脾臟＞背最長肌。組內(nèi)分析得知，IGF-2基因在肺臟組織中的表達量極顯著高于其他組織，在腎臟、肝臟表達量顯著高于脾臟和背最長肌，其余各組織間均未達到差異顯著水平。

圖5 IGF-2 基因在關(guān)嶺牛6 個組織中的相對表達量

3 討 論

IGF 是調(diào)節(jié)動物體細胞生長的重要激素之一[15]。IGF-1是動物機體內(nèi)必不可少的重要調(diào)控因子，對動物機體的生長發(fā)育、生理代謝以及生產(chǎn)等具有重要作用，同時，IGF-1介導著動物生長激素的生長活性[16]。IGF-2基因的表達在動物的胚胎發(fā)育、脂肪沉積、骨骼與神經(jīng)發(fā)育、細胞的增殖分裂以及調(diào)控轉(zhuǎn)化等方面具有極其顯著的作用[17-18]。

本實驗以關(guān)嶺牛為研究對象，采用qRT-PCR 方法，對關(guān)嶺牛6 個組織IGF-1基因和IGF-2基因的表達水平進行了檢測，發(fā)現(xiàn)IGF-1基因和IGF-2基因在關(guān)嶺牛的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟以及背最長肌中均有表達。實驗結(jié)果與IGF-1基因mRNA 在藍塘仔豬[19]、薩?？斯騕20]、努比亞黑山羊[21]、昆明犬[22]、藏綿羊[23]諸多組織中均有表達的研究結(jié)果一致；與IGF-2基因mRNA 在河川沙塘鱧[24]、西藏小型豬[25]、揚子鱷[26]、從江香豬[2]等均有表達的研究結(jié)果一致，說明IGF-1基因和IGF-2基因的表達具有廣譜性。

生長激素/ 類胰島素生長因子軸（GHR/IGF 軸）在調(diào)節(jié)動物機體生長發(fā)育和代謝方面具有極其重要的生理意義[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1基因和IGF-2基因均在關(guān)嶺牛肺臟組織中表達量最高，這可能就與GHR/IGF軸的調(diào)節(jié)機制有關(guān)。朱曉鋒[2]、李文楊[22]以及李豐耘[27]等研究表明，家畜組織器官中IGF-1基因高表達對動物機體的生長發(fā)育具有重要作用，可促進生長，直接影響動物的個體體型，這可能與IGF-1基因在動物不同組織中均有表達的結(jié)果密切相關(guān)，其具體調(diào)控機制有待進一步研究。在本實驗中，IGF-1基因高表達于關(guān)嶺牛的肺臟組織，這與IGF-1在大白豬[2,25]背最長肌中表達量最高的實驗結(jié)果相反，推測可能是物種不同所致，其具體作用機理有待進一步研究；本實驗結(jié)果又與IGF-1基因在薩?？斯騕21]、昆明犬[23]較高表達于肝臟的結(jié)果一致，說明肝臟是IGF-1合成的主要器官之一[28]。早在2016 年就有研究報道，IGF-2基因在肝臟細胞的表達對反映肝功能狀態(tài)具有重要意義[29]。而馬彥等[30]研究發(fā)現(xiàn)IGF-2基因過表達可促進肝癌細胞生長、遷移與侵襲，進而參與肝細胞癌發(fā)生。IGF-2基因在從江香豬[2]肺臟和肝臟中為高表達，與本實驗研究結(jié)果一致，說明IGF-2基因在肺臟和肝臟的功能調(diào)控中有重要意義。

4 結(jié) 論

關(guān)嶺牛IGF-1、IGF-2基因均于肺臟組織表達量最高，極顯著高于其他5 個組織，在背最長肌組織中的表達量最低，說明IGF-1、IGF-2基因主要定位于肺臟組織；推測IGF-1、IGF-2基因?qū)﹃P(guān)嶺牛的肺臟功能調(diào)控具有十分重要的生理意義。本研究結(jié)果為進一步發(fā)掘我國優(yōu)質(zhì)地方畜禽遺傳資源、探究影響關(guān)嶺牛生長發(fā)育的分子機制提供了參考。