周步峰，石福岳，張建軍，何茂昌，王耀榮，謝文章

（1.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅平?jīng)?744000；2.華池縣畜牧獸醫(yī)站，甘肅華池 745600；3.環(huán)縣畜禽改良站，甘肅環(huán)縣 745700）

隴東絨山羊是科技工作者深入一線經(jīng)多年選育、提純、復(fù)壯形成的一個(gè)絨肉兼用型山羊品種。該品種能很好地適應(yīng)隴東地區(qū)干旱、半干旱的自然生態(tài)環(huán)境，且因其遺傳性能穩(wěn)定、產(chǎn)絨量高、羊絨品質(zhì)優(yōu)良和肉質(zhì)細(xì)嫩等優(yōu)點(diǎn)[1]，深受本地區(qū)養(yǎng)殖戶的青睞，已成為隴東及周邊地區(qū)羊產(chǎn)業(yè)的主導(dǎo)品種。然而，隴東絨山羊?yàn)榧竟?jié)性發(fā)情，產(chǎn)仔數(shù)少，從而制約了羊產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；l(fā)展，提高其繁殖效率也就成為研究熱點(diǎn)。雖有部分產(chǎn)雙羔的群體，但是其遺傳機(jī)制不清楚。有研究結(jié)果表明，動(dòng)物的繁殖性狀與FSHR基因存在重要的聯(lián)系。龍威海等[2]采用熒光定量PCR 技術(shù)分析了南江黃羊不同組織中FSHR基因的表達(dá)量，結(jié)果表明，F(xiàn)SHR基因在母羊子宮中的表達(dá)水平顯著高于其他組織，在公羊睪丸組織中的表達(dá)量顯著高于下丘腦和垂體。王德迪[3]等研究了綿羊FSHR基因3'UTR 多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的SNP 位點(diǎn)，且等位基因頻率在高繁殖力品種（湖羊）和低繁殖力品種（巴什拜羊）間存在顯著差異，因此推測(cè)FSHR基因的多態(tài)性可能與綿羊高繁殖力有關(guān)。本研究以隴東絨山羊雙羔母羊及所產(chǎn)F1代為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)隴東絨山羊FSHR基因第10 外顯子進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，旨在尋找與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的SNPs 位點(diǎn)，探討該基因作為候選基因標(biāo)記隴東絨山羊雙羔性狀的可行性，以便為隴東絨山羊雙羔品系的選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取來(lái)自華池縣和環(huán)縣的隴東絨山羊160 只，其中單羔和多羔母羊各55 只、雙羔母羊的F1代母羊50 只；具有產(chǎn)羔記錄的遼寧絨山羊母羊50 只。

1.2 血液采集及DNA 提取 頸靜脈采集血液5 mL，于EDTA 抗凝管中-20℃保存?zhèn)溆?。使用OMEGA 全血DNA 提取試劑盒提取基因組DNA，并于-20℃冰箱冷凍保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)及PCR 擴(kuò)增 參考山羊FSHR基因序列（登錄號(hào)：KJ817181），使用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5 設(shè)計(jì)3 對(duì)引物（表1）。PCR 反應(yīng)體系為20 μL，包 括：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，DNA 模 板1 μL（100 ng），上、下游引物各1 μL（10 pmol/L），ddH2O 7 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，退火30 s，72℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)合格的PCR 產(chǎn)物用于SSCP 檢測(cè)。

表1 FSHR 基因引物序列信息

1.4 PCR-SSCP 檢測(cè)及測(cè)序 取2 μL PCR 產(chǎn)物和8 μL 變性緩沖液（9.6 mL 甲酰胺、10 mmol/L EDTA 200 μL，0.025% 溴酚藍(lán)、0.025% 二甲苯氰FF），混勻，98℃變性10 min，然后迅速放入冰浴中10 min。用10%的聚丙烯酰胺凝膠（29:1）140 V 電泳12 h，銀染后判定基因型。選取不同基因型的PCR 產(chǎn)物送至北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 應(yīng)用POPGEN 1.32 計(jì)算基因頻率、有效等位基因數(shù)（Ne）、表觀雜合度（Ho）、期望雜合度（He），用PIC 分析軟件計(jì)算多態(tài)信息含量（PIC），并進(jìn)行χ2檢驗(yàn)和加性顯性模型分析。采用SPSS18.0 軟件的GLM 程序分析基因型與絨山羊產(chǎn)羔數(shù)（TNB）的相關(guān)性，采用LSD 法進(jìn)行多重比較，不同基因型對(duì)應(yīng)的TNB 均用“最小二乘均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)誤（LSM±SE）”來(lái)表示。

2 結(jié)果

2.1 隴東絨山羊血液DNA 提取結(jié)果 采用試劑盒法提取血液DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后結(jié)果見(jiàn)圖1。如圖1 所示，所提取的DNA 濃度較高，無(wú)雜帶及拖尾現(xiàn)象，表明提取的DNA 純度較高，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 血液DNA 提取結(jié)果

2.2FSHR基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果 由圖2 可知，各引物擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期產(chǎn)物大小一致，且特異性較好，可以用于下一步SSCP 分析。

圖2 FSHR 基因擴(kuò)增結(jié)果

2.3FSHR基因SSCP 檢測(cè)結(jié)果 分別對(duì)3 對(duì)引物的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SSCP 分析，結(jié)果只有P2 引物擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)到4 種不同帶型，這4 種帶型分別定義為AA、AB、AC 型和BB 型，其中AA 型為野生型，其余3 種基因型為突變型。將這4 種不同基因型PCR 產(chǎn)物送生物公司測(cè)序。通過(guò)DNASTAR 軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析和比對(duì)，結(jié)果在1 542 bp 處和1 595 bp 處發(fā)生堿基突變（圖4）。其中1 542 bp 處堿基突變（G/T）未引起氨基酸改變，為同義突變，而1 595 bp 處堿基突變（T/G）為錯(cuò)義突變，導(dǎo)致所編碼氨基酸由甲硫氨酸（Met）變?yōu)榫彼幔ˋrg）。

圖3 P2 引物擴(kuò)增產(chǎn)物的SSCP 檢測(cè)電泳圖

圖4 P2 引物擴(kuò)增產(chǎn)物的SSCP 測(cè)序結(jié)果

2.4 遺傳學(xué)統(tǒng)計(jì)分析

2.4.1 基因型頻率與基因頻率 由表2 可知，隴東絨山羊雙羔母羊群體及其F1代的優(yōu)勢(shì)基因型為突變型AB，BB 型次之，等位基因B 的頻率最高，因此可初步確定優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)锽。而隴東絨山羊單羔母羊群體和遼寧絨山羊群體的優(yōu)勢(shì)基因型均為AA 型，等位基因A 的頻率最高。4 個(gè)群體中的AC 型頻率均最低。

表2 FSHR 基因P2 引物基因型頻率和等位基因頻率

2.4.2 多態(tài)性群體遺傳結(jié)構(gòu)分析 對(duì)FSHR基因多態(tài)位點(diǎn)雜合度、有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量等多態(tài)性參數(shù)及Hardy-Weinberg（H-W）平衡進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3 可知，隴東絨山羊雙羔群體及其F1代群體的SNPs 位點(diǎn)雜合度較高，而遼寧絨山羊群體和隴東絨山羊單羔群體的純合度較高。有效等位基因數(shù)在4 個(gè)群體間總體趨勢(shì)一致，與實(shí)際檢測(cè)到的基因數(shù)基本相符。隴東絨山羊雙羔群體及其F1代群體的多態(tài)信息含量均表現(xiàn)為高度多態(tài)（PIC＞0.50），單羔群體和遼寧絨山羊群體的PIC 表現(xiàn)為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.50）。經(jīng)Hardy-Weinberg 平衡（χ2）檢驗(yàn)，隴東絨山羊雙羔母羊群體達(dá)到了顯著水平，即FSHR基因該位點(diǎn)偏離了Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)；而F1代群體、單羔群體和遼寧絨山羊的χ2檢驗(yàn)值均未達(dá)到顯著水平，即群體FSHR基因該位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)。

表3 FSHR 基因多態(tài)位點(diǎn)遺傳變異參數(shù)

2.5FSHR基因SNPS 與隴東絨山羊繁殖性能相關(guān)性分析 隴東絨山羊及遼寧絨山羊FSHR基因第10 外顯子不同基因型母羊產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)誤分析結(jié)果見(jiàn)表4。由表4 可見(jiàn)，隴東絨山羊AB 型和BB 型個(gè)體的產(chǎn)羔數(shù)高于AA 型和AC 型的，且差異顯著；AA 型與AC 型間、AB 型與BB 型間的產(chǎn)羔數(shù)則無(wú)顯著差異。遼寧絨山羊各基因型個(gè)體的產(chǎn)羔數(shù)無(wú)顯著差異。

表4 FSHR 基因不同基因型個(gè)體產(chǎn)羔數(shù)最小二乘平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤

3 討 論

3.1FSHR基因外顯子10 多態(tài)性分析FSHR在人和雌性哺乳動(dòng)物生殖活動(dòng)中具有重要作用，其基因含有10個(gè)外顯子和9 個(gè)內(nèi)含子，主要在第10 外顯子進(jìn)行跨膜域和胞內(nèi)域的編碼[3]，由此可見(jiàn)，第10 外顯子的功能是非常重要的。有研究結(jié)果顯示，F(xiàn)SHR基因多態(tài)性可能與動(dòng)物產(chǎn)仔數(shù)等性狀有關(guān)聯(lián)。關(guān)于動(dòng)物FSHR基因多態(tài)性的研究多集中在5' 非翻譯區(qū)、外顯子1 和外顯子10。許瑤[5]等在香豬FSHR基因第10 外顯子發(fā)現(xiàn)3 個(gè)SNPs 位點(diǎn)，即rs322800083（C/T）、rs322115220（T/C）和novel 1（G/A），其中rs322800083（C/T）位點(diǎn)突變導(dǎo)致其編碼氨基酸由蘇氨酸（Thr）變?yōu)楫惲涟彼幔↖le）。吳井生[6]等在小梅山母豬FSHR基因外顯子10 中檢測(cè)到C1166T 和T1491C 位點(diǎn)。楊孔[7]等研究發(fā)現(xiàn)FSHR基因第1 外顯子和第4 外顯子在藏雞和羅曼雞種群間分別存在SNP 位點(diǎn)，Exon1 處表現(xiàn)為EE 和EF 2 種基因型，Exon 4 表現(xiàn)為3 種基因型（GH、GI和HI），且會(huì)引起氨基酸突變。陳祥[8]等在貴州黑山羊和黔北麻羊FSHR基因第1 和第10 外顯子各檢測(cè)到1 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，即C126T 和C1246A，表現(xiàn)為3 種基因型。本研究在隴東絨山羊和遼寧絨山羊FSHR基因第10 外顯子處檢測(cè)到2 個(gè)SNPs 位點(diǎn)：T1595G 和G1542T，其中1 595 位點(diǎn)的堿基突變導(dǎo)致氨基酸由甲硫氨酸（Met）變?yōu)榫彼幔ˋrg）。表現(xiàn)為4 種基因型（AA、AB、BB 和AC），其中在隴東絨山羊雙羔母羊群體及其F1代群體中，AB 型和BB 型基因型頻率均高于AA 型和AC 型基因型頻率，隴東絨山羊單羔母羊群體和遼寧絨山羊群體中，AA 基因型頻率最高，AB 型次之。說(shuō)明該基因突變位點(diǎn)可能是影響隴東絨山羊產(chǎn)羔數(shù)性狀的一個(gè)重要候選基因并可以遺傳給其后代。未檢測(cè)出BC 基因型和CC 基因型，可能與檢測(cè)樣本量偏少有關(guān)。這一結(jié)果與姜懷志[9]、陳祥[8]等的研究結(jié)果類似。

3.2FSHR基因多態(tài)性的遺傳結(jié)構(gòu)分析 基因雜合度又稱基因多樣度，是度量群體遺傳變異程度大小的一個(gè)參數(shù)。本實(shí)驗(yàn)中隴東絨山羊雙羔母羊群體及其F1代群體基因雜合度高于單羔母羊群體，說(shuō)明雙羔群體變異程度高于單羔群體，即遺傳多樣性高于單羔群體。有效等位基因數(shù)反映了等位基因間的相互影響，等位基因在群體中分布得越均勻，則有效等位基因數(shù)值越接近實(shí)際檢測(cè)到的等位基因數(shù)。同時(shí)，有效等位基因數(shù)值較大的品種，其期望雜合度和多態(tài)信息含量值也相應(yīng)較高[10]。對(duì)一個(gè)群體而言，多態(tài)信息含量高、有效等位基因數(shù)目多、雜合度大，則該位點(diǎn)的遺傳變異性就高，說(shuō)明其有較大的選擇潛力。本研究中3 個(gè)群體的有效等位基因數(shù)值相近，與實(shí)際檢測(cè)到的等位基因數(shù)目基本一致，但隴東絨山羊雙羔母羊及其F1代群體的有效等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量相對(duì)高于其他2 個(gè)群體，說(shuō)明其遺傳變異性較高，有較大的人工選擇潛力。遼寧絨山羊多態(tài)信息含量和有效等位基因數(shù)較低，說(shuō)明該基因位點(diǎn)在遺傳過(guò)程中較保守，趨于穩(wěn)定。經(jīng)Hardy-Weinberg 平衡（χ2）檢驗(yàn)，隴東絨山羊雙羔母羊群體及其F1代群體達(dá)到了顯著水平，即FSHR基因該多態(tài)位點(diǎn)偏離了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，說(shuō)明其可能受漂變、選擇、引種等因素的影響，可以將其作為新品系培育過(guò)程中的一個(gè)分子標(biāo)記位點(diǎn)；而單羔群體和遼寧絨山羊群體均處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)，說(shuō)明其遺傳較穩(wěn)定，受人工選擇影響程度較小。

3.3FSHR基因不同基因型與產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性 作為繁殖性能的候選基因之一，F(xiàn)SHR基因一直是遺傳學(xué)者研究的熱點(diǎn)。在FSHR基因多態(tài)性與繁殖性能相關(guān)性的研究中，對(duì)人、牛、豬和羊方面的研究較多。研究發(fā)現(xiàn)FSHR基因與一些人類生殖疾病相關(guān)，如卵巢功能早衰[11]、男性不育[12-13]、卵巢癌癥[14]等。雷雪芹[15]等在秦川牛和荷斯坦牛FSHR基因外顯子10 上檢測(cè)到T1506C 多態(tài)位點(diǎn)，且該突變?cè)谇卮ㄅｋp胎和單胎中的突變率分別為60%和20%，而在荷斯坦牛雙胎和單胎中的突變率分別為31.25%和6.67%，提示該多態(tài)位點(diǎn)可能作為牛雙胎性狀的候選SNPs。研究表明，F(xiàn)SHR基因座位的遺傳特性與二花臉豬最高產(chǎn)活仔數(shù)顯著相關(guān)[16]，也可能與波爾山羊個(gè)體的超排潛力有關(guān)[17]。姜懷志[9]通過(guò)PCR-SSCP 檢測(cè)了遼寧絨山羊和薩能奶山羊雙羔和單羔母羊FSHR基因多態(tài)性，結(jié)果表明，遼寧絨山羊雙羔母羊中突變率為53.3%，而單產(chǎn)母羊中只有6.67%的突變率，薩能奶山羊雙羔母羊的突變率是單羔母羊的3 倍。表明FSHR基因第10 外顯子可以作為雙羔性能的標(biāo)記基因，而且雙羔性狀與候選基因的多態(tài)性呈正相關(guān)。本研究通過(guò)分析隴東絨山羊FSHR不同基因型個(gè)體產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘平均數(shù)間的差異，研究FSHR基因多態(tài)位點(diǎn)與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果表明，AB 型、BB 型個(gè)體的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于AA 型和AC 型，且表現(xiàn)出BB 型＞AB型＞AA 型＞AC 型的趨勢(shì)，遼寧絨山羊各基因型個(gè)體間的產(chǎn)羔數(shù)差異雖不顯著，但仍表現(xiàn)為BB 型＞AB 型＞AA 型＞AC 型的趨勢(shì)，說(shuō)明T1595G 突變位點(diǎn)可能是影響隴東絨山羊產(chǎn)雙羔的1 個(gè)SNP 位點(diǎn)。

4 結(jié) 論

本研究在隴東絨山羊和遼寧絨山羊FSHR基因第10 外顯子檢測(cè)到2 個(gè)SNPs 位點(diǎn)，其中1 個(gè)SNPs 可引起氨基酸改變。隴東絨山羊雙羔群體優(yōu)勢(shì)基因型為AB型，優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)锽。經(jīng)最小二乘法分析，不同基因型個(gè)體產(chǎn)羔數(shù)平均數(shù)由大到小依次為BB 型＞AB 型＞AA 型＞AC 型，提示FSHR基因T1595G 突變位點(diǎn)可能是影響隴東絨山羊產(chǎn)雙羔的一個(gè)重要候選SNPs 位點(diǎn)。