李嬌嬌，焦亞飛，石德順

（廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點實驗室，廣西南寧 530005）

哺乳動物生殖發(fā)育是繁衍后代的重要生理過程，其中卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟是哺乳動物生殖的重要方面。卵泡是維持雌性哺乳動物卵巢功能的基本單元[1]，卵泡發(fā)育是一個連續(xù)的生長過程，起于胎兒時期。伴隨著卵泡發(fā)育，卵母細(xì)胞逐漸成熟，卵母細(xì)胞成熟可分為核成熟和質(zhì)成熟；核成熟對于卵母細(xì)胞的受精和受精后胚胎的發(fā)育都非常重要，此過程主要包括同源染色體的配對及分離、生發(fā)泡的破裂和第一極體的排出；而細(xì)胞質(zhì)成熟主要包括卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（Cumulus Oocyte Complex，COCs）縫隙連接的改變和消失、細(xì)胞器形態(tài)及其位置的改變和蛋白質(zhì)含量的積累[2]。卵母細(xì)胞成熟的質(zhì)量對早期胚胎發(fā)育至關(guān)重要，然而由于體外培養(yǎng)獲得的卵母細(xì)胞與體內(nèi)自然發(fā)育的卵母細(xì)胞相比質(zhì)量較差[3]，最終會導(dǎo)致多精受精或雌性動物妊娠失敗，因此通過體外培養(yǎng)較高發(fā)育能力的卵母細(xì)胞來生產(chǎn)胚胎，需要深入了解卵母細(xì)胞的成熟機(jī)制。

PI3K/Akt 信號通路被認(rèn)為是最重要的細(xì)胞內(nèi)通路之一，它在癌癥、細(xì)胞增殖、胚胎干細(xì)胞和胚胎發(fā)生等生命過程中起著重要作用。近年來，越來越多的報道證實了PI3K/Akt 和一些下游效應(yīng)分子組成的信號通路在卵泡形成、生長、排卵和黃體化過程中發(fā)生變化[4-5]，提示PI3K/Akt 信號通路對卵巢卵泡發(fā)育有重要作用。也有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt 信號通路可以調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂事件，影響卵母細(xì)胞成熟能力，表明PI3K/Akt 信號通路參與調(diào)控卵母細(xì)胞的成熟[6]。本文綜述了PI3K/Akt 信號通路在卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟方面的研究進(jìn)展，為家畜繁殖機(jī)制研究提供理論參考。

1 PI3K/Akt 信號通路

1.1 PI3K/Akt 信號通路的組成 PI3K/Akt 信號通路由PI3K、中間效應(yīng)因子、Akt 構(gòu)成（圖1）。PI3K 是由PIK3CA/B/D/G和PIK3R1/2基因編碼的催化亞基和調(diào)控亞基組成，隨著受體酪氨酸激酶（RTKs）的激活，PI3K 將磷脂酰肌醇（4，5）-二磷酸（PIP2）磷酸化為磷脂酰肌醇（3，4，5）-三磷酸（PIP3）。PIP3 積累可以促進(jìn)Akt 及其下游蛋白激活，如proline-riche Akt底物40（PRAS40）、結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合物2（TSC2）和Forkhead Box O3A 轉(zhuǎn)錄因子（FOXO3A）等。Akt存 在PKBα、PKBβ、PKBγ3 個亞型，也叫Akt1、Akt2、Akt3，通常在Thr308 和Ser473 位點發(fā)生磷酸化，但也可以在其他位點發(fā)生磷酸化。

1.2 PI3K/Akt 信號通路的抑制劑和激活劑

1.2.1 PI3K 通路的抑制劑和激活劑 目前，許多針對PI3K 信號蛋白的單一抑制劑或激活劑藥物已經(jīng)開發(fā)并應(yīng)用于臨床前期研究，并取得了良好的治療效果，具體見表1。

表1 PI3K 通路的抑制劑和激活劑

1.2.2 Akt 通路的抑制劑和激活劑 Akt 是PI3K 信號傳導(dǎo)途徑中一個重要的下游靶點。PI3K 被激活后，其產(chǎn)物PIP2 及PIP3 與Akt 的PH 區(qū)結(jié)合，不僅導(dǎo)致Akt 從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到胞膜，還可促其構(gòu)象生變，得以在絲氨酸473（Serine 473，Ser473）和蘇氨酸308（Threonine 308，Thr308）2 個重要位點磷酸化激活，而且二者的磷酸化是Akt 激活的必要條件。目前針對Akt 信號蛋白，新型、有效的抑制劑和激活劑已進(jìn)入臨床研究（表2）。

表2 Akt 通路的抑制劑和激活劑

1.3 PI3K/Akt 通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號 Akt 磷酸化之后，繼續(xù)磷酸化下游的mTOR、GSK3、rs-1 等蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)具有調(diào)控細(xì)胞的生存生長、細(xì)胞代謝以及腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和移位等重要作用。雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是Akt 下游信號傳導(dǎo)的重要傳遞者，在細(xì)胞增殖、凋亡和卵泡發(fā)育方面發(fā)揮重要作用。在減數(shù)分裂過程中，mRNA 翻譯在蛋白質(zhì)合成中發(fā)揮重要作用。在體細(xì)胞中，mTOR 通過PI3K/Akt 途徑介導(dǎo)mRNA 的翻譯已經(jīng)被證實[21]。mTOR 復(fù)合物1（mTORC1）的激活刺激S6 核糖體蛋白和真核起始因子4E，增加VEGF、FGF-2和Cyclin D1的翻譯[22]。在小鼠上，PI3K-Akt-mTOR 信號級聯(lián)反應(yīng)調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的起始，進(jìn)而影響母體mRNA 的翻譯和早期胚胎的發(fā)育能力[23]。

此外，PI3K/Akt 信號通路與雌激素受體（Estrogen Receptor，ER）活性密切相關(guān)，兩者相互調(diào)控[24]。在缺乏雌激素的情況下，ER 與PI3K 調(diào)控亞基p85 的結(jié)合啟動了PI3K/Akt 通路；p-Akt 被認(rèn)為可以磷酸化ER的絲氨酸167 位點（ser167），這提示存在ER-PI3K/Akt2-ER 通 路[24]。Bratton 等[25]研究了ER/PI3K/Akt對MCF-7 乳腺癌細(xì)胞存活的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)ER 通過激活A(yù)kt 導(dǎo)致Bcl-2基因啟動子轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，最終導(dǎo)致Bcl-2 蛋白水平升高，揭示ER-PI3K-Akt 是一個完整的信號通路。

2 PI3K/Akt 信號通路對卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟的影響

越來越多的研究表明PI3K/Akt 信號通路與卵巢功能相關(guān)，包括原始卵泡的募集、顆粒細(xì)胞（Granulosa Cells，GC）的增殖、黃體的形成及卵母細(xì)胞的成熟[26-27]。

2.1 PI3K/Akt 信號通路調(diào)控卵泡發(fā)育 卵泡閉鎖是動物卵泡發(fā)育過程中的一個選擇性過程，而顆粒細(xì)胞凋亡在這一過程中起著關(guān)鍵作用。Zhang 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，赭曲毒素A（Ochratoxin A，OTA）通過PI3K/Akt 信號通路對顆粒細(xì)胞增殖和凋亡具有一定作用，OTA 主要是激活整合素家族成員Itgb1 和F2r，進(jìn)而激活Pik3r1和Pik3r5，這2 個基因參與調(diào)控第二信使PIP3，導(dǎo)致PIP3發(fā)生磷酸化，激活PI3K/Akt 信號通路。在小鼠卵巢中，PTEN在小鼠卵母細(xì)胞中缺失導(dǎo)致泛卵泡的激活和卵母細(xì)胞的過早耗竭，而顆粒細(xì)胞特異性破壞并不影響卵泡的啟動生長，而是促進(jìn)了GCs 增殖和促進(jìn)排卵[29]。同時在卵巢卵泡發(fā)育過程中，PI3K 通路下游效應(yīng)分子PTEN、TSC、FOXO3、P27表達(dá)增加使原始卵泡發(fā)育受阻，而PI3K、PDK1、Akt以及mTOR表達(dá)增加對原始卵泡的發(fā)育具有促進(jìn)作用，這些效應(yīng)分子在卵泡發(fā)育過程中起到重要作用，任何效應(yīng)分子效應(yīng)減弱都會導(dǎo)致卵巢早衰[30]。原始卵泡的募集受到顆粒細(xì)胞增殖、Notch 和PI3K/Akt 通路相互作用調(diào)控的影響[31]。卵泡的損失、維持和生長受到包括PI3K/Akt 信號在內(nèi)的復(fù)雜分子的嚴(yán)格控制，PI3K 的刺激可促進(jìn)Akt 磷酸化，促進(jìn)卵泡存活和生長。

2.2 PI3K/Akt 信號通路調(diào)控卵母細(xì)胞成熟 在卵泡發(fā)生過程中，卵原細(xì)胞進(jìn)行減數(shù)分裂，形成成熟的卵母細(xì)胞。在卵母細(xì)胞成熟方面，Tomek 等[32]分析了牛卵母細(xì)胞成熟（從前期I 向中期II 轉(zhuǎn)變）過程中Akt 的磷酸化模式和活性，發(fā)現(xiàn)Akt 在Thr 308 和Ser 473 位點發(fā)生磷酸化，在第1 次減數(shù)分裂中期（Metaphase I，MI）達(dá)到峰值，而在生發(fā)泡期（Germinal Vesicle，GV）和第2 次減數(shù)分裂中期（Metaphase II，MII），只觀察到兩側(cè)較低磷酸化水平，表明Akt 參與了牛卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中MI/MII 的轉(zhuǎn)變。Feng 等[33]向卵母細(xì)胞注入mRNA Akt1-WT 和mRNA myr-Akt1，然后再將編碼野生型CDC25B（CDC25B-WT）和Akt-非磷酸化Ser351 的mRNA 注 入CDC25B 突變體（CDC25BS351A)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDC25B-S351A 對Akt 的抑制作用較強(qiáng)，表明Akt 通過誘導(dǎo)CDC25 磷酸酶家族成員CDC25B 的Akt 依賴性磷酸化，引起成熟促進(jìn)因子（Mitosis-Promoting Factor，MPF）的激活，并促進(jìn)小鼠受精卵的發(fā)育。

Liu 等[34]探討了鈣調(diào)蛋白依賴性激酶II（calmodulindependent protein kinase II，CaMK II）對Akt1 的 潛在影響，發(fā)現(xiàn)抑制CaMKII 會增加二倍體的阻滯；利用小分子化合物KN-93、SH-6、LY294002 和PIP3 處理卵母細(xì)胞后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KN-93 下調(diào)了pCaMKII，降低了pAkt1（Ser473）的水平；SH-6 下調(diào)了pAkt1（Ser473），并重新排列了pCaMKII（Thr286）的分布；此外，外源性PIP3 顯著上調(diào)了GVBD 率，并增加了pCaMKII（Thr286）和pAkt1（Ser473）的水平；相反，LY294002 下調(diào)PIP3，降低GVBD 率，也降低了pCaMKII（Thr286）和pAkt1（Ser473）水平。

Song 等[6]在豬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中加入表皮生長因子（EGF）或抑制劑（wortmannin 和U0126）來調(diào)節(jié)激酶活性，研究了Akt 和ERK 信號通路的關(guān)系以及激酶調(diào)節(jié)對COCs 中細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)成熟的影響，首次發(fā)現(xiàn)抑制ERK 活性可負(fù)調(diào)控Akt 信號通路來提高豬卵母細(xì)胞成熟率。這些發(fā)現(xiàn)可能有助于在轉(zhuǎn)基因豬生產(chǎn)方面提高豬COCs 的發(fā)育能力和利用率，并提高對激酶參與相關(guān)的減數(shù)分裂事件的認(rèn)識。Kalous 等[35]探討了Akt 在體外成熟的豬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中的調(diào)控作用，添加Akt 特異性抑制劑SH-6，不抑制GVBD，減數(shù)分裂的恢復(fù)速度明顯加快，Ser473 磷酸化水平未受影響；然而，Thr308 的磷酸化水平降低，Akt 活性在GVBD 時降低，并且在MI 期早期就阻止了減數(shù)分裂進(jìn)程；SH-6 處理的卵母細(xì)胞經(jīng)過GVBD 處理后，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）和MAP 激酶活性下降，說明Akt 活性參與了CDK1 和MAP 激酶的調(diào)控；結(jié)果表明，Akt 活性對豬卵母細(xì)胞GVBD 的誘導(dǎo)并不重要，但在減數(shù)分裂MI/MII 期起重要作用。

3 展 望

卵母細(xì)胞作為雌性生殖細(xì)胞直接影響哺乳動物的繁殖能力，近年來卵母細(xì)胞成熟和卵泡發(fā)育已成為研究的熱點，然而卵母細(xì)胞成熟和卵泡發(fā)育的機(jī)制還不完善。PI3K/Akt 信號通路是動物體內(nèi)生殖細(xì)胞發(fā)育的重要信號通路，對于其在動物繁殖方面的研究越來越多，尤其是卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟，而且在不同物種間也進(jìn)行了初步研究。未來還需要深入探究PI3K/Akt 信號通路不同效應(yīng)因子在卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟方面的調(diào)控機(jī)制。通過這些研究將為完善家畜繁殖機(jī)制、提高家畜繁殖力奠定理論依據(jù)。