李文兵，畢江濤，惠治兵，劉 鵬，王 兵，孫 權(quán)

一株纖維素降解菌的分離、鑒定及發(fā)酵優(yōu)化

李文兵1，畢江濤2*，惠治兵1，劉 鵬1，王 兵3，孫 權(quán)1

(1. 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；2.寧夏大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院，銀川 750021；3. 寧夏壹泰豐生態(tài)肥業(yè)有限公司，銀川 750100)

纖維素降解菌在堆肥發(fā)酵中具有加快腐熟、提升堆肥品質(zhì)的作用，其中抗逆性強(qiáng)的芽孢桿菌屬具有一定的優(yōu)勢(shì)。從新鮮牛糞中篩選具有降解糞污能力的纖維素降解菌，通過(guò)羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基與革蘭氏碘液結(jié)合培養(yǎng)、濾紙搖瓶復(fù)篩，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化分析、16S rDNA基因序列對(duì)比鑒定，獲得一株纖維素降解菌CK41，經(jīng)NCBI提交序列BLAST比對(duì)后，鑒定為內(nèi)生芽孢桿菌（）（登錄號(hào)：MT023630）。研究結(jié)果顯示，利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化產(chǎn)酶條件試驗(yàn)，在溫度為37 ℃，時(shí)間為72 h，pH為7.0，接種量為4%（）時(shí)，獲得羧甲基纖維素酶活量3.14 U·mL-1，較優(yōu)化前提高了149.5%。結(jié)果表明，溫度、時(shí)間和pH對(duì)于羧甲基纖維素酶活力是重要影響因素，接種量影響程度較小。菌株CK41具有較強(qiáng)的纖維素酶生產(chǎn)能力，在堆肥發(fā)酵中具有一定的潛力。

堆肥；纖維素降解菌；內(nèi)生芽孢桿菌；分離；鑒定；響應(yīng)面優(yōu)化

我國(guó)是世界上畜禽養(yǎng)殖廢棄物產(chǎn)出量最大的國(guó)家[1]，每年產(chǎn)生的糞便量超過(guò)30億t[2]，大量的畜禽糞便排放堆積，造成的環(huán)境問(wèn)題日益突出，如造成地下水面源污染、臭氣排放以及病原菌排入土壤等嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量。堆肥發(fā)酵被認(rèn)為是畜禽糞便資源化利用的有效方式之一[3]。畜禽糞便主要成分為纖維素類物質(zhì)[4]，利用自然界的微生物分泌大量胞外酶將纖維素類大分子物質(zhì)降解為腐殖質(zhì)[5-6]，與物理和化學(xué)法相比具有安全、環(huán)保無(wú)污染的特點(diǎn)[7]。堆肥不僅解決了環(huán)境污染問(wèn)題，還能將廢棄物制成肥料產(chǎn)生一定的經(jīng)濟(jì)效益[8]。

傳統(tǒng)堆肥存在功能微生物少，發(fā)酵周期長(zhǎng)，腐熟程度低的問(wèn)題[9]，因此需要人工添加外源菌劑，提高微生物的數(shù)量，縮短堆肥周期，提升腐熟品質(zhì)[8]。吳慶珊[10]篩選出具有纖維素降解能力的芽孢桿菌屬（）和類芽孢桿菌屬（），將其制成菌劑應(yīng)用于羊糞堆肥中，提高或維持了堆體高溫發(fā)酵，縮短了堆肥和腐熟周期；周勇[11]將枯草芽孢桿菌（）應(yīng)用于豬糞堆肥中，大大縮短了堆肥周期，使物料完全達(dá)到了腐熟狀態(tài)；諸葛誠(chéng)祥[12]從菌糠中篩選出高效纖維素降解菌屬：短芽孢桿菌屬（）和芽孢桿菌屬，將其制成菌劑應(yīng)用于堆肥中，相較于對(duì)照組，縮短了堆肥周期，提升了肥效。細(xì)菌具有易繁殖、適應(yīng)性強(qiáng)、培養(yǎng)周期短等特點(diǎn)[13]，特別是芽孢桿菌屬具有耐高溫、耐酸堿、產(chǎn)羧甲基纖維素酶活力較高等特點(diǎn)[14]。因此，從堆肥菌劑的角度出發(fā)，纖維素降解能力強(qiáng)的芽孢桿菌具有一定的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

本研究從寧夏某牧業(yè)養(yǎng)殖場(chǎng)采集牛糞，分離出一株具有纖維素降解功能的芽孢桿菌，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，16S rDNA基因序列分析，并進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，以期為畜禽養(yǎng)殖業(yè)糞污堆肥資源化利用提供微生物菌種資源。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

本試驗(yàn)菌源樣品采集于寧夏某牧業(yè)養(yǎng)殖場(chǎng)。采樣時(shí)去除雜質(zhì)，裝入采樣袋中并編號(hào)，帶回實(shí)驗(yàn)室，并于4 ℃保存。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

（1）LB培養(yǎng)基（g·L-1）：用于纖維素降解菌株的富集培養(yǎng)。胰蛋白胨10.0、酵母浸膏粉5.0、NaCl 10.0，1×105Pa滅菌30 min。

（2）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（g·L-1）：用于纖維素降解菌的分離。牛肉膏3.0、蛋白胨10.0、NaCl 5.0、瓊脂20.0，1×105Pa滅菌30 min。

（3）羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基（CMC-Na培養(yǎng)基）（g·L-1）：用于高效纖維素降解菌的篩選。羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）20.0、Na2HPO42.5、KH2PO41.5、蛋白胨2.5、酵母浸膏粉0.5，瓊脂20，pH調(diào)至7.0，1×105Pa滅菌30 min。

（4）發(fā)酵培養(yǎng)基[15]（g·L-1）：用于測(cè)定酶活。麩皮50.0、蛋白胨3.0、NaCl 5.0、(NH4)2SO43.0、KH2PO41.0、MgSO4·7H2O 0.3，用NaOH飽和溶液調(diào)至pH 7.0，1×105Pa滅菌30 min。

（5）濾紙條崩解培養(yǎng)基[16]（g·L-1）：經(jīng)濾紙條崩解試驗(yàn)可進(jìn)一步判斷出菌株的降解能力。(NH4)2SO43.0、KH2PO41.0、MgSO4·7H2O 0.4、酵母浸膏粉0.1，pH 7.0，1×105Pa滅菌30 min。

（6）革蘭氏碘液：用于纖維素水解圈的測(cè)定。KI 2.0 g，I21.0 g，H2O 300 mL。

（7）DNS 試劑（3, 5二硝基水楊酸）按照農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)DNS試劑配制，檸檬酸緩沖溶液、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液按照QB 2583-—2003 標(biāo)準(zhǔn)配置。

1.3 纖維素降解菌的篩選

1.3.1 富集培養(yǎng) 取4 ℃保存的新鮮牛糞10.0 g裝入裝有90 mL無(wú)菌水的250 mL三角瓶中，連續(xù)震蕩30 min混勻。取1 mL接入LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行富集12 h。

1.3.2 初篩 將富集后的糞便混合液做標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度稀釋，分別取稀釋度為10-8、10-9和10-10倍的菌液200 μL涂抹于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋梯度做3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)基置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，挑取不同形態(tài)的單菌落于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，純化3～4代斜面接種后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫粚⒓兓蟮木挈c(diǎn)接于CMC-Na培養(yǎng)基，28 ℃倒置培養(yǎng)12 h，加入革蘭氏碘液浸染5～10 min，觀察有無(wú)明顯水解圈，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量培養(yǎng)基中菌落的透明圈直徑（，cm）與菌落直徑（，cm），計(jì)算二者的比值，根據(jù)比值大小初步確定分離菌株纖維素酶活力的高低。

1.3.3 復(fù)篩 選取比值較大的菌株分別接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃、150 r·min-1震蕩培養(yǎng)24 h，5 000 r·min-1離心10 min，取上清液用于后續(xù)纖維素酶活的測(cè)定。纖維素酶活采用DNS法[17]。酶活力單位（U）規(guī)定為：在特定條件下，1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 μmoL底物，或者底物中1 μmoL有關(guān)基團(tuán)所需的酶量。

內(nèi)切 β-1, 4-葡萄糖苷酶（簡(jiǎn)稱EG或Cx酶）活性的測(cè)定：采用羧甲基纖維素（CMC）酶活性測(cè)定方法。在25 mL具塞比色管中加入用磷酸緩沖溶液配制的質(zhì)量濃度為1%的CMC-Na溶液1 mL，加入待測(cè)酶液0.5 mL，50 ℃具塞水浴30 min，加入2.0 mL DNS試劑，具塞沸水浴5 min，立即冷卻，蒸餾水定容至25 mL，搖勻后在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定吸光度值，每管做5個(gè)重復(fù)，取平均值，通過(guò)查葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線求出還原糖的含量。

外切 β-1, 4-葡萄糖苷酶（簡(jiǎn)稱CBH或C1酶）活性的測(cè)定：采用微晶纖維素（MCC)酶活性測(cè)定法。取1 mL用pH 7.0 的磷酸氫二鈉檸檬酸緩沖液配制的2 g·L-1微晶纖維素溶液，加入1 mL待測(cè)酶液，于50 ℃水浴條件下反應(yīng) 2 min后，5 000 r·min-1離心5 min。然后取1 mL反應(yīng)上清液加入1 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，再加入2 mL DNS試劑，沸水浴中煮沸 10 min，冰浴冷卻后于 540 nm處比色。

纖維素酶總活性的測(cè)定：采用濾紙酶活性（FPA檢測(cè)法）。在25 mL比色管中加入1 cm × 5 cm的濾紙條，加入待測(cè)酶液0.5 mL，其余同羧甲基纖維素酶活性的測(cè)定方法一致。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取無(wú)水葡萄糖（80 ℃烘至恒重）配置成1 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取此標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mL補(bǔ)加蒸餾水至2 mL，加DNS試劑2 mL具塞沸水浴30 min，冰浴冷卻至室溫，定容至25 mL，反復(fù)搖勻在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，每管3個(gè)重復(fù)，取平均值，以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并建立回歸方程。

濾紙條崩解試驗(yàn)：取5.0 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的培養(yǎng)液加入盛有100 mL濾紙條崩解培養(yǎng)基的三角瓶中，每個(gè)三角瓶放入1/4 Φ 9 cm的扇形濾紙，于28 ℃、150 r·min-1條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，以未加菌株的搖瓶作為對(duì)照，觀察濾紙條崩解情況。

1.4 菌株鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)觀察 將復(fù)篩出的菌株接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)12 h，觀察單菌落的生長(zhǎng)狀況和形態(tài)特征。菌株的生理生化特征描述參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》。

1.4.2 分子生物學(xué)鑒定 將菌株接種于斜面送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，利用微生物16S rDNA通用引物 27F(5′-AGAGTTTGA TCATGGCTCAG-3′)、1492R (5′-TAGGGTTACCT TGTTACGACTT-3′)對(duì)菌株進(jìn)行16S擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 45 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)30次，72 ℃延伸10 min。將測(cè)定的序列通過(guò)NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，選擇同源性較高的菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，初步確定篩選菌株的種屬和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

1.5 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.5.1 優(yōu)化結(jié)果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 羧甲基纖維素酶是纖維素酶的重要組成部分，其酶活力一般也高于其他纖維素酶。因此本優(yōu)化以羧甲基纖維素酶活力作為評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。

1.5.2 單因素優(yōu)化 在液體發(fā)酵培養(yǎng)基上，依次對(duì)發(fā)酵時(shí)間（12、24、36、48、60、72、84和96 h）、pH（5、6、7、8和9）、培養(yǎng)溫度（28、31、34、37、40和43 ℃）和接種量（2%、3%、4%、5%和6%，）這4個(gè)因素進(jìn)行單因素優(yōu)化，觀察其對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響。

1.5.3 響應(yīng)面優(yōu)化及驗(yàn)證 根據(jù)單因素優(yōu)化的結(jié)果，選擇顯著因素根據(jù)Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用Design-Expert 8.0進(jìn)行多元回歸擬合分析，以羧甲基纖維素酶活（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別選取發(fā)酵時(shí)間（A）、發(fā)酵溫度（B）、pH（C）及接種量（D）4個(gè)影響因素，優(yōu)化最佳產(chǎn)酶條件，最后驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌的篩選

2.1.1 菌株初篩 從新鮮牛糞中分離出4株具有纖維素分解能力的菌株，通過(guò)富集及在CMC-Na培養(yǎng)基上經(jīng)革蘭氏碘液染色篩選透明圈直徑比值（D/d）較大的菌株，分別命名為CK12、CK41、FE21和ZF22，其菌落直徑測(cè)定結(jié)果如表1所示。CK41菌株菌落直徑明顯大于其他3株菌，說(shuō)明該菌株在CMC-Na培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌株CK41的D/d值為4.83，高于其他3株菌，初步說(shuō)明菌株CK41的纖維素降解能力高于其他3株菌。

2.1.2 菌株復(fù)篩 利用DNS法對(duì)初篩得到的具有纖維素降解能力的菌株進(jìn)行復(fù)篩，以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量為橫坐標(biāo)制作回歸曲線，回歸方程為0.273 90.009 8，相關(guān)系數(shù)R為0.993 1，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。從表1中看出菌株CK41的CMC、MCC和FPA值均高于其他菌株。將菌株富集后以一定量接入濾紙條崩解培養(yǎng)基中，每天觀察培養(yǎng)基中的濾紙變化情況。2 d后對(duì)照培養(yǎng)基澄清，接菌的培養(yǎng)基開始變渾濁，3 d后濾紙邊緣開始毛化，5 d后CK12、CK41、FE21和ZF22均出現(xiàn)了不同程度的破碎、分解，且CK41濾紙碎裂程度最大（圖1），而對(duì)照培養(yǎng)基依舊清澈透明。由此說(shuō)明CK41菌株降解纖維能力較強(qiáng)。

2.2 菌株生理生化特征及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

菌株CK41在牛肉膏蛋白胨平板上28 ℃培養(yǎng)12 h進(jìn)行觀察：菌落呈圓形，邊緣不整齊，表面無(wú)凸起，扁平、光滑無(wú)褶皺，白色，如圖1所示。經(jīng)革蘭式染色，顯微鏡觀察，菌體為細(xì)桿狀，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，并做了相應(yīng)的生理生化特征實(shí)驗(yàn)，如吲哚實(shí)驗(yàn)、耐堿性實(shí)驗(yàn)、淀粉利用實(shí)驗(yàn)等（表2）。

該菌株經(jīng)DNA提取、PCR擴(kuò)增獲得16S rDNA片段長(zhǎng)度1 500 bp，經(jīng)BLAST比對(duì)，得到該菌株與內(nèi)生芽孢桿菌的同源性為100%。選取親緣關(guān)系較近的菌株運(yùn)用MEGA7.0的N-J法建立系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，確定菌株CK41是內(nèi)生芽孢桿菌（），提交基因序列到GenBank后，獲得登錄號(hào)（MT023630）。

表1 D/d和纖維素酶活測(cè)定結(jié)果

圖1 菌株CK41初篩、復(fù)篩、形態(tài)學(xué)觀察和革蘭氏染色結(jié)果

Figure 1 Primary screening, rescreening, morphological observation and gram staining results of strain CK41

表2 菌株CK41的生理生化特征

注：“+”為陽(yáng)性；“-”為陰性。

圖2 菌株CK41系統(tǒng)發(fā)育樹

Figure 2 Phylogenetic tree of strain CK41

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 單因素優(yōu)化結(jié)果 分別對(duì)菌株CK41發(fā)酵時(shí)間、溫度、pH和接種量進(jìn)行單因素優(yōu)化，結(jié)果如圖3所示。從圖3（a）可以看出：隨著溫度的增加，羧甲基纖維素酶活力逐漸升高；當(dāng)發(fā)酵溫度到37 ℃時(shí)酶活力最高，為2.50 U·mL-1，當(dāng)溫度超過(guò)37 ℃時(shí)酶活力急劇下降。由圖3（b）可知：隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，酶活力逐步升高；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為72 h時(shí)酶活力最高，為2.25 U·mL-1；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過(guò)72 h時(shí)，酶活力開始下降。由圖3（c）可知：pH在5～6間酶活力增速緩慢，pH在6～7時(shí)酶活力迅速升高；當(dāng)pH值為7.0時(shí)酶活力最高，為1.31 U·mL-1；當(dāng)pH大于7時(shí)，酶活力開始下降。從圖3（d）可看出：隨著接種量的增加酶活力逐漸升高；當(dāng)接種量為4%時(shí)酶活力最高，為1.94 U·mL-1；當(dāng)接種量大于4%時(shí)，酶活力開始下降。因此，發(fā)酵所選擇的最優(yōu)條件為：時(shí)間72 h，發(fā)酵溫度37 ℃，pH 7.0，接種量4%（）。

2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果 為了進(jìn)一步優(yōu)化菌株CK41的產(chǎn)酶條件，根據(jù)單因素優(yōu)化結(jié)果，選取發(fā)酵時(shí)間、溫度、pH和接種量作為影響因素，以羧甲基纖維素酶活力作為響應(yīng)值進(jìn)行Box-Benhnken試驗(yàn)。試驗(yàn)因素與水平如表3所示，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果如表4所示。

利用Design-Expert 8.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸方程擬合，得到羧甲基纖維素酶活（Y）與溫度（A）、時(shí)間（B）、pH（C）和接種量（D）的二次回歸方程為：= 3.13 + 0.083+ 0.065+ 0.051–0.087–0.02–(2.5×103)+ 0.04–0.05–0.11+ 0.02–0.422–0.42–0.472–0.42, 其中為預(yù)測(cè)值。

P>F<0.05，表明模型擬合度好，可以利用響應(yīng)面模型進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化設(shè)計(jì)[18]。從表5中值可以看出，方程中A、B、C、D、BD、A2、B2、C2和D2對(duì)Y值的影響極顯著，表明試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，二次項(xiàng)與響應(yīng)值的關(guān)系很大；交互項(xiàng)AB、AC、AD、BC和CD對(duì)Y值的影響不顯著。其校正決定系數(shù)R= 0.975 0，說(shuō)明該模型能夠解釋97.5%響應(yīng)值變化；RAdj= 0.950 1，表明該模型與數(shù)據(jù)擬合程度較好，試驗(yàn)誤差較小；離散系數(shù)= 3.19% < 10% ，失擬項(xiàng)0.067 8 > 0.05，不顯著，表明試驗(yàn)的可信度和精確度高。擬合回歸方程符合以上檢驗(yàn)原則，說(shuō)明適應(yīng)性好，即可用此模型和方程分析羧甲基纖維素酶活力。

圖3 菌株CK41單因素優(yōu)化結(jié)果

Figure 3 Single factor optimization results of strain CK41

表3 Box-Benhnken試驗(yàn)因素與水平

為了驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性，根據(jù)單因素最優(yōu)結(jié)果進(jìn)行了5組平行試驗(yàn)，羧甲基纖維素酶活力均值為3.14 U·mL-1，與預(yù)測(cè)值3.13 U·mL-1基本一致，說(shuō)明模型能夠較好的應(yīng)用于試驗(yàn)。

等高線圖的形狀可以反映出兩因素交互作用的強(qiáng)弱，中心圈呈橢圓狀表示兩因素交互作用強(qiáng)，呈圓狀表示交互作用弱[19]。在圖4（a）—圖9（a）中，等高線中心圈皆呈橢圓狀，說(shuō)明溫度、時(shí)間、pH和接種量4因素兩兩交互作用較強(qiáng)，再結(jié)合表5交互項(xiàng)值可知，雖交互作用較強(qiáng)但不顯著。

在響應(yīng)面和等高線圖中，所選的范圍內(nèi)存在極值, 既是響應(yīng)面的最高點(diǎn), 也是等高線最小橢圓的中心點(diǎn)[20]。圖4（a）中，溫度37 ℃與時(shí)間72 h相交；圖7（a）中，時(shí)間72 h和pH 7.0相交；圖8（a）中，時(shí)間72 h和接種量4%（）相交。所以37℃、72 h、pH 7.0和接種量4%（）處存在極大值，該結(jié)果與圖3單因素優(yōu)化結(jié)果一致。

表4 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表5 回歸系數(shù)顯著性分析

注： ** 表示極顯著（< 0.01）；* 表示顯著（< 0.05）。

圖4 溫度與時(shí)間對(duì)羧甲基纖維素酶活影響的等高線圖（a）和響應(yīng)面圖（b）

Figure 4 Contour diagram (a) and response surface diagram (b) of the influence of temperature and time on CMCase activity

圖5 溫度與pH對(duì)羧甲基纖維素酶活影響的等高線圖（a）和響應(yīng)面圖（b）

Figure 5 Contour diagram (a) and response surface diagram (b) of the influence of temperature and pH on CMCase activity

圖6 溫度與接種量對(duì)羧甲基纖維素酶活影響的等高線圖（a）和響應(yīng)面圖（b）

Figure 6 Contour diagram (a) and response surface diagram (b) of the influence of temperature and inoculation on CMCase activity

圖7 時(shí)間與pH對(duì)羧甲基纖維素酶活影響的等高線圖（a）和響應(yīng)面圖（b）

Figure 7 Contour diagram (a) and response surface diagram (b) of the influence of time and pH on CMCase activity

圖8 時(shí)間與接種量對(duì)羧甲基纖維素酶活影響的等高線圖（a）和響應(yīng)面圖（b）

Figure 8 Contour diagram (a) and response surface diagram (b) of the influence of time and inoculation amount on CMCase activity

圖9 pH與接種量對(duì)羧甲基纖維素酶活影響的等高線圖（a）和響應(yīng)面圖（b）

Figure 9 Contour diagram (a) and response surface diagram (b) of the influence of pH and inoculation amount on CMCase activity

響應(yīng)面圖考察在某個(gè)因素固定在中心值不變的情況下,其他兩個(gè)因素的交互作用對(duì)羧甲基纖維素酶活的影響，曲面顏色向中心點(diǎn)逐漸加深，坡度越來(lái)越陡說(shuō)明兩因素交互越來(lái)越強(qiáng)[21]。圖4（b）—圖9（b）中，曲面的輪廓嶺脊越來(lái)越陡，顏色越來(lái)越深，到達(dá)最高點(diǎn)時(shí)，酶活力不再增大反而下降，說(shuō)明在達(dá)到極值前，因素間交互作用越來(lái)越強(qiáng)。同時(shí)，根據(jù)曲面顏色變化趨勢(shì)不同，可以看出不同因素的重要影響程度。圖5（b）中，隨溫度的增加，輪廓嶺脊顏色開始由藍(lán)變紅，按重要影響程度分，溫度比接種量的影響大；同理，圖7（b）中，時(shí)間比接種量的影響大；圖8（b）中，pH比接種量影響大。說(shuō)明接種量是最小影響因素。再結(jié)合表5中單因素項(xiàng)值，可得出：溫度、時(shí)間和pH等因素對(duì)于羧甲基纖維素酶活力是重要影響因素，接種量影響程度較小。

3 討論與結(jié)論

芽孢桿菌屬是自然界分布極廣的一類細(xì)菌，因其具有芽孢，能夠抵御外界有害因子，適應(yīng)能力強(qiáng)的特點(diǎn)[22]廣泛應(yīng)用于堆肥中，成為目前研究產(chǎn)纖維素酶微生物的一個(gè)重要方向[23]。本研究從新鮮牛糞中分離得到一株纖維素降解菌CK41，通過(guò)對(duì)該菌株形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征實(shí)驗(yàn)、分子鑒定等確定該菌株為內(nèi)生芽孢桿菌（）。劉東陽(yáng)等[24]以結(jié)晶纖維素作為唯一碳源，從牛糞中篩選出具有纖維素降解能力的蠟狀芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌；張喜慶等[25]從牛糞中分離出高效纖維素降解菌，枯草芽孢桿菌，其羧甲基纖維素酶活力達(dá)100.81 U·mL-1；楊力等[26]從奶牛糞污中分離得到高產(chǎn)纖維素降解菌并經(jīng)構(gòu)建混合菌群，CMC酶活力高達(dá)1 617.92 U·mL-1。目前，關(guān)于具有纖維素降解能力的內(nèi)生芽孢桿菌研究較少。袁春紅[27]從黃水中分離得到內(nèi)生芽孢桿菌菌株，其羧甲基纖維素酶活力為0.132 U·mL-1，與其相比，菌株CK41羧甲基纖維素酶活力為3.14 U·mL-1，具有一定的優(yōu)勢(shì)，從而為纖維素降解菌提供了一個(gè)新的品種。

單因素優(yōu)化結(jié)果中（圖3），當(dāng)溫度超過(guò)37 ℃時(shí)，酶活力急劇下降，高溫會(huì)影響酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)從而抑制代謝物的產(chǎn)生，菌株難以存活。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過(guò)72 h時(shí)，酶活力開始下降，一方面隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，水解產(chǎn)生的葡萄糖量隨之增加，當(dāng)葡萄糖的量達(dá)到一定時(shí)，抑制了內(nèi)切葡萄糖苷酶的產(chǎn)生；另一方面，長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵導(dǎo)致菌株老齡化，菌株間爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，代謝緩慢，酶活力下降。由于酶的活性部位通常含有酸性或者堿性基團(tuán)，使每種酶有自己最適pH，pH小于或大于7.0均會(huì)影響酶活力。接種量過(guò)低，菌株繁殖需要更長(zhǎng)時(shí)間，致酶活力低；接種量過(guò)高，菌株間爭(zhēng)奪溶解氧及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，代謝產(chǎn)生的物質(zhì)可能會(huì)抑制自身繁殖，致酶活力下降。

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇影響較大的因素（溫度、時(shí)間、pH和接種量）作為變量，利用響應(yīng)面法試驗(yàn)次數(shù)少、周期短、精度高的優(yōu)點(diǎn), 對(duì)影響試驗(yàn)指標(biāo)的各因子水平及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化和評(píng)價(jià)[28]。以羧甲基纖維素酶活作為響應(yīng)值建立二次回歸模型。據(jù)各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)表明，該模型可信度、精密度高，模型顯著，可用該模型和方程分析羧甲基纖維素酶活力。由等高線和響應(yīng)面圖得出：4個(gè)變量?jī)蓛砷g交互對(duì)羧甲基纖維素酶活力均產(chǎn)生較強(qiáng)影響；溫度、時(shí)間和pH等單因素是影響羧甲基纖維素酶活力的重要因素，接種量對(duì)其影響較小。結(jié)果表明：溫度為37 ℃、時(shí)間為72 h、pH為7.0、接種量為4%（）時(shí)獲得羧甲基纖維素酶活為3.14 U·mL-1，較優(yōu)化前的2.10 U·mL-1，提高了149.5%。

本研究所篩選的菌株下一步工作需要同其他功能菌株進(jìn)行復(fù)合制成菌劑，并用于堆肥試驗(yàn)，以期發(fā)揮菌株之間的協(xié)同作用，提升堆肥品質(zhì)。

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Isolation, identification and fermentation condition optimization of a cellulose degrading strain

LI Wenbing1, BI Jiangtao2, HUI Zhibing1, LIU Peng1, WANG Bing3, SUN Quan1

(1.School of Agriculture, Ningxia University, Yinchuan 750021;2. School of Ecology and Environment, Ningxia University, Yinchuan 750021;3.Ningxia Yitaifeng Ecological Fertilizer Co. Ltd., Yinchuan 750100)

Cellulose degrading bacteria can accelerate the maturation and improve the quality of compost during composting fermentation, especiallystrain with strong stress resistance. In this study, we screened cellulose degrading bacteria with the ability to degrade manure from fresh cow dung, combined culture with Gram-iodine solution by sodium carboxymethyl cellulose medium, filter paper shaking flask, and morphological observation, physiological and biochemical analysis; we compared and identified 16S rDNA gene sequence and obtained a cellulose-degrading bacteria CK41, and identified it as(registration number: MT023630) after NCBI submission sequence alignment. The results showed that the carboxymethyl cellulase activity was 3.14 U·mL-1after the strain fermentation at 37 ℃ for 72 h in the medium of pH 7.0 with the inoculation amount of 4% (), which was 149.5% higher than before the optimization. The result indicated that temperature, time and pH value were important factors affecting carboxymethyl cellulase activity, while the inoculation amount had little effect. In conclusion, strain CK41 has strong cellulase production capacity and certain potential in composting fermentation.

composting; cellulose degrading bacteria;; isolation; identification; response surface optimization

X172

A

1672-352X (2021)03-0458-09

10.13610/j.cnki.1672-352x.20210706.004

2021-7-7 11:43:27

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20210706.1641.008.html

2020-08-15

寧夏重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018ZDKJ0312）資助。

李文兵，碩士研究生。E-mail：1323234800@qq.com

畢江濤，博士，研究員。E-mail：Bi_jt@nxu.edu.cn