鄭雯靜，楊靖亞，劉克海

殼寡糖對(duì)三氧化二砷致大鼠肝細(xì)胞毒性的保護(hù)作用

鄭雯靜，楊靖亞*，劉克海

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

為研究殼寡糖（COS）對(duì)三氧化二砷（ATO）致大鼠正常肝細(xì)胞（BRL-3A）毒性的保護(hù)作用，測(cè)定三氧化二砷和殼寡糖對(duì)BRL-3A細(xì)胞的增殖抑制率、三氧化二砷誘導(dǎo)殼寡糖預(yù)處理BRL-3A細(xì)胞的細(xì)胞存活率、細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶（LDH）水平、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和線粒體膜電位（MMP）的變化。結(jié)果表明，三氧化二砷對(duì)BRL-3A細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）為19.8 μmol·L-1，殼寡糖濃度低于230 μmol·L-1時(shí)對(duì)細(xì)胞并未產(chǎn)生損傷。殼寡糖預(yù)處理BRL-3A細(xì)胞24 h，三氧化二砷再處理細(xì)胞24 h，通過(guò)檢測(cè)以上指標(biāo)表明殼寡糖預(yù)處理能夠降低LDH水平至176.23% ± 5.87%，從而降低三氧化二砷引起的細(xì)胞毒性；殼寡糖可顯著抑制三氧化二砷引起的脂質(zhì)過(guò)氧化對(duì)機(jī)體造成的損傷作用，MDA相對(duì)釋放含量降低至191.91%± 2.89%；殼寡糖顯著提高了抗氧化酶GST、SOD和CAT的活性，分別提高至86.20% ± 1.41%、90.09% ± 1.33%和61.29% ± 0.21%，提高細(xì)胞的抗氧化能力，降低三氧化二砷引起的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷；殼寡糖預(yù)處理可減緩三氧化二砷引起的線粒體膜電位的降低，降低三氧化二砷對(duì)細(xì)胞的線粒體產(chǎn)生的傷害。殼寡糖對(duì)三氧化二砷引起的大鼠肝細(xì)胞的細(xì)胞毒性損傷起到了有效地保護(hù)作用。

殼寡糖；三氧化二砷；細(xì)胞毒性；氧化損傷；保護(hù)作用

殼寡糖（Chitosan oligosaccharide，COS）是殼聚糖的降解后的產(chǎn)物，又名β-1，4-寡糖-葡萄糖胺，是不同寡糖的混合物[1]。COS因具有強(qiáng)于殼聚糖的溶解性、抗氧化性和免疫作用等而受到廣泛關(guān)注。COS的抗氧化活性在體內(nèi)外得到證實(shí)，COS可逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的GSH活性、降低CAT活性和升高M(jìn)DA水平[2]。

砷是土壤和水中的天然成分，是眾所周知的人類致癌物[3]。長(zhǎng)期燃燒含砷的煤取暖或者飲用含砷的水源，是生活中導(dǎo)致砷中毒的主要原因[4]。三氧化二砷是劇毒藥品，因其安全劑量到中毒劑量之間的劑量差值較小，導(dǎo)致作為藥物時(shí)會(huì)產(chǎn)生較多不良反應(yīng)，大大限制了其臨床應(yīng)用[5]。

氧化應(yīng)激是因氧化作用和抗氧化作用失去平衡導(dǎo)致生化生理發(fā)生異常。砷中毒的作用機(jī)制包括氧化還原代謝失衡。砷作用后產(chǎn)生過(guò)量的氧化物引起抗氧化酶（GST、SOD和CAT等）活力降低[6]。有研究表明，ATO誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與活性氧和氧化損傷有關(guān)[7]。氧化應(yīng)激對(duì)人體造成很多損傷，這和很多疾病都有很大的關(guān)系[8-10]。有研究表明, COS有很好的抗氧化能力[11-13]。通過(guò)利用抗氧化劑降低活性氧和氧化損傷，為減輕ATO的毒副作用提供了很大的可能性。

本試驗(yàn)以大鼠正常肝細(xì)胞（BRL-3A）作為研究對(duì)象，研究ATO對(duì)BRL-3A細(xì)胞毒性作用和COS對(duì)ATO致BRL-3A細(xì)胞毒性的保護(hù)作用并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

BRL-3A細(xì)胞購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清、噻唑藍(lán)（MTT）購(gòu)于上海仕寰生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；PBS緩沖液、100×青霉素-鏈霉素溶液購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司。Western及IP細(xì)胞裂解、乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）、線粒體膜電位（MMP）購(gòu)于碧云天生物技術(shù)。谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）、超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

二氧化碳培養(yǎng)箱，賽默飛世爾科技有限公司；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；CT14RD離心機(jī)，上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司；SYNERGY2酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；AE31倒置生物顯微鏡，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；HH-S11-2-S恒溫水浴鍋，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) BRL-3A細(xì)胞用DMEM高糖培養(yǎng)基（10%胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素）培養(yǎng)于5% CO2、37 ℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿底部后篩選出生長(zhǎng)至80%左右狀態(tài)良好的細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行細(xì)胞消化，一部分細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，剩余細(xì)胞傳代培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法測(cè)定BRL-3A細(xì)胞增殖抑制率 細(xì)胞培養(yǎng)操作如1.2.1，細(xì)胞于DMEM培養(yǎng)基（5%胎牛血清（體積分?jǐn)?shù)，下同））中吹至均勻單細(xì)胞懸液，取密度為每孔5′103個(gè)的細(xì)胞懸液于96孔板內(nèi)培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)基后加入含不同濃度的ATO（0、0.8、4、20、100和500 μmol·L-1）或COS（0、7.812 5、31.25、125、500和2 000 μmol·L-1）培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，每孔加10 μL MTT溶液，混勻后避光繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去96孔板中的液體，加150 μL DMSO于96孔板，在微型振蕩器上充分震蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸收光（檢測(cè)波長(zhǎng)：570 nm；參考波長(zhǎng)：655 nm）。

式（1）中：為ATO/COS處理組吸光度；為培養(yǎng)基組吸光度；為無(wú)藥物處理組吸光度。

1.2.3MTT法測(cè)定ATO誘導(dǎo)COS預(yù)處理的BRL-3A細(xì)胞的細(xì)胞存活率細(xì)胞鋪板操作如1.2.2。培養(yǎng)24 h棄培養(yǎng)基后加入含不同濃度COS（0、25、50、100和200 μmol·L-1）的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)基再加入含不同濃度的ATO（0、5、10和 20 μmol·L-1）的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加10 μL MTT，輕輕拍打混勻避光繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去96孔板中的液體，每孔加150 μL DMSO，在微型振蕩器上充分震蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸收光（檢測(cè)波長(zhǎng)為570 nm，參考波長(zhǎng)為655 nm）。

式（2）中：為COS預(yù)處理ATO再處理組吸光度；為培養(yǎng)基組吸光度；為無(wú)藥物處理組吸光度。

1.2.4 LDH法測(cè)定細(xì)胞毒性細(xì)胞鋪板操作如1.2.3。培養(yǎng)24 h棄培養(yǎng)基后加入含不同濃度COS（0、100和200 μmol·L-1）的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基再加入含不同濃度ATO（0、5和10 μmol·L-1）的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，于結(jié)束培養(yǎng)前1 h取出96孔板并向最大酶活性對(duì)照孔中加入100 μL（1′）釋放劑，輕晃使其與細(xì)胞充分接觸繼續(xù)孵育1 h。結(jié)束培養(yǎng)后，根據(jù)乳酸脫氫酶（LDH）細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)氧化還原指標(biāo)的測(cè)定 （1）待測(cè)蛋白樣品的制備及蛋白濃度測(cè)定。取密度為每皿1′106個(gè)的細(xì)胞于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)基后加入含不同濃度COS（0、100和200 μmol·L-1）的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)基再加入含不同濃度ATO（0、5和10 μmol·L-1）的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，結(jié)束培養(yǎng)后在冰上進(jìn)行操作，根據(jù)Western及IP細(xì)胞裂解液說(shuō)明書進(jìn)行操作，–80℃保存?zhèn)溆?。使用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)蛋白濃度。

（2）細(xì)胞內(nèi)氧化還原指標(biāo)的測(cè)定。根據(jù)MDA檢測(cè)試劑盒、GST活性檢測(cè)試劑盒、SOD活性檢測(cè)試劑盒和CAT活性檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.6 JC-1檢測(cè)細(xì)胞中線粒體膜電位（MMP）的變化 取細(xì)胞接種于6孔板，密度為1′105個(gè)·mL-1，每孔2 mL。培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基加入含不同濃度COS（0、100和200 μmol·L-1）的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基再用加入含有不同濃度ATO（0、5和10 μmol·L-1）的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后。按照線粒體膜電位說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.7 COS預(yù)處理對(duì)ATO誘導(dǎo)的BRL-3A細(xì)胞形態(tài)的影響細(xì)胞鋪板和分組如1.2.6。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，于倒置顯微鏡下對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)均表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean ± SD）”；顯著性分析采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析。< 0.05表明結(jié)果有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 ATO對(duì)BRL-3A細(xì)胞的半數(shù)抑制率（IC50）及COS對(duì)BRL-3A細(xì)胞的無(wú)損害作用濃度

ATO的濃度處于0.8 ～ 500 μmol·L-1范圍時(shí)顯著提高BRL-3A細(xì)胞的增殖抑制率并表現(xiàn)出良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系（表1），由改良寇氏法計(jì)算得到三氧化二砷對(duì)BRL-3A細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）為19.8 μmol·L-1。COS的濃度低于230 μmol·L-1時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯抑制作用，而當(dāng)COS的濃度高于230 μmol·L-1時(shí)對(duì)細(xì)胞的增殖出現(xiàn)抑制作用，具體見(jiàn)表1。

2.2 COS對(duì)ATO誘導(dǎo)BRL-3A細(xì)胞存活率降低的影響

如圖1所示，低濃度的COS（25、50、100和200 μmol·L-1）單獨(dú)作用于BRL-3A細(xì)胞時(shí)，對(duì)細(xì)胞的存活率無(wú)顯著影響。ATO單獨(dú)處理組從5 μmol·L-1濃度開(kāi)始顯著降低細(xì)胞存活率。當(dāng)COS預(yù)處理細(xì)胞時(shí)，升高細(xì)胞存活率最佳的是200 μmol·L-1COS處理組，可將5、10和20 μmol·L-1ATO單獨(dú)處理的細(xì)胞存活率由73.76%±1.08%、63.68%±1.02%、12.68%±1.02%分別顯著提高到83.98%±1.08%、84.54%±1.02%和38.39%±6.31%。因此，COS預(yù)處理BRL-3A細(xì)胞24 h后，可以減輕ATO對(duì)BRL-3A細(xì)胞產(chǎn)生的毒性作用。

表1 ATO/COS作用于BRL-3A細(xì)胞24 h對(duì)細(xì)胞增殖抑制率的影響

“*”表示ATO濃度相同時(shí)，COS預(yù)處理組與無(wú)COS處理組相比差異顯著，P < 0.05；“#”表示COS預(yù)處理濃度相同時(shí)，ATO處理組與無(wú)ATO處理組相比差異顯著，P < 0.05。

Figure 1 Effect of COS pretreatment on BRL-3A cells viability induced by ATO

2.3 COS預(yù)處理對(duì)細(xì)胞內(nèi)LDH水平的影響

如圖2所示，COS單獨(dú)處理組與對(duì)照組相比細(xì)胞釋放LDH水平無(wú)明顯差異，而ATO（5 和10 μmol·L-1）單獨(dú)處理細(xì)胞24 h后顯著提高細(xì)胞釋放LDH水平，分別提高至129.06%±7.47%和228.30%±18.68%。COS預(yù)處理BRL-3A細(xì)胞24 h后ATO再處理24 h，顯著降低細(xì)胞釋放的LDH水平。當(dāng)100 μmol·L-1COS預(yù)處理時(shí)，細(xì)胞釋放的LDH水平分別顯著降低至109.43% ± 1.00%（5 μmol·L-1ATO）和174.34% ± 1.50%（10 μmol·L-1ATO）。當(dāng)200 μmol·L-1COS預(yù)處理時(shí)，細(xì)胞釋放的LDH水平分別顯著降低至109.06% ± 0.53%（5 μmol·L-1ATO）和176.23% ± 5.87%（10 μmol·L-1ATO）。COS預(yù)處理效果均較好，均降低了ATO引起的LDH水平升高。說(shuō)明COS可降低ATO引起的LDH水平升高從而對(duì)ATO致細(xì)胞毒性產(chǎn)生保護(hù)作用。

不同字母表示差異顯著，P < 0.05。下同。

Figure 2 Effect of COS pretreatment on the release of LDH of BRL-3A cells induced by ATO

圖3 COS預(yù)處理對(duì)ATO引起的BRL-3A細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的影響

Figure 3 Effect of COS pretreatment on ATO-induced lipid peroxidation in BRL-3A cells

2.4 COS預(yù)處理對(duì)細(xì)胞內(nèi)MDA含量的影響

如圖3所示，COS單獨(dú)處理組與對(duì)照組相比MDA含量無(wú)顯著性差異，而ATO（5 和10 μmol·L-1）單獨(dú)處理細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)的MDA相對(duì)含量顯著升高，其含量分別為180.09%±10.05%和302.61%± 11.98%。當(dāng)100 μmol·L-1COS預(yù)處理時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的MDA相對(duì)含量顯著降低，可將MDA含量由180.09%±10.05%降低到146.51%±7.36%，將302.61%±11.98%降低到214.06%±8.77%。當(dāng)200 μmol·L-1COS預(yù)處理時(shí)，可將MDA含量由180.09%±10.05%降低到145.08%±7.11%，由302.61%±11.98%降低到191.91%±2.89%。說(shuō)明COS可抑制ATO引起的脂質(zhì)過(guò)氧化對(duì)BRL-3A細(xì)胞產(chǎn)生的損傷，從而達(dá)到保護(hù)作用。

2.5 COS預(yù)處理對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡的影響

如圖4所示，COS單獨(dú)處理組與對(duì)照組相比抗氧化體系無(wú)顯著性差異，而ATO（5 和10 μmol·L-1）單獨(dú)處理細(xì)胞后可顯著降低細(xì)胞內(nèi)的GST、SOD和CAT的活性。ATO（5 和10 μmol·L-1）單獨(dú)處理時(shí)細(xì)胞內(nèi)GST相對(duì)活性分別為71.06%±1.32%、55.06%±1.88%。當(dāng)100 μmol·L-1COS預(yù)處理時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的GST相對(duì)活性顯著升高至69.38%±1.66%（10 μmol·L-1ATO）。當(dāng)200 μmol·L-1COS預(yù)處理時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的GST相對(duì)活性分別顯著升高至85.32%± 1.66%（5 μmol·L-1ATO）和86.20%±1.41%（10 μmol·L-1ATO）（圖4(a)）。當(dāng)100 μmol·L-1COS預(yù)處理時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的SOD相對(duì)活性由75.11%±11.04%（5 μmol·L-1ATO）顯著升高至90.09%±1.33%。（圖4(b)）。ATO（5 μmol·L-1和10 μmol·L-1）單獨(dú)處理時(shí)細(xì)胞內(nèi)CAT相對(duì)活性分別為51.44%±0.31%和51.94%± 0.27%。當(dāng)100 μmol·L-1COS預(yù)處理時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的CAT相對(duì)活性分別顯著升高至61.58%±0.42%（5 μmol·L-1ATO）和57.95%±0.15%（10 μmol·L-1ATO）。當(dāng)200 μmol·L-1COS預(yù)處理時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的CAT相對(duì)活性分別顯著升高至61.55%±0.33%（5 μmol·L-1ATO）和61.29% ± 0.21%（10 μmol·L-1ATO）（圖4(c)）。

COS處理組（100 和200 μmol·L-1）均可以提高ATO誘導(dǎo)的GST、SOD和CAT活性。由圖4可知，200 μmol·L-1COS預(yù)處理效果相對(duì)比較好。研究結(jié)果表明COS預(yù)處理可顯著增強(qiáng)抗氧化酶GST、SOD和CAT的活性和細(xì)胞抗氧化能力。COS對(duì)ATO引起的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷起到了有效的保護(hù)作用，使細(xì)胞回歸于平衡的氧化還原狀態(tài)。

2.6 COS預(yù)處理對(duì)ATO引起的BRL-3A細(xì)胞線粒體膜電位變化的影響

如圖5所示，COS單獨(dú)處理組與對(duì)照組相比紅綠熒光強(qiáng)度比值無(wú)明顯差異，即線粒體膜電位不受殼寡糖影響。ATO（5 和10 μmol·L-1）單獨(dú)處理組使得紅綠熒光強(qiáng)度比值有顯著的降低，即線粒體膜電位下降。COS預(yù)處理后可顯著提高紅綠熒光強(qiáng)度比值，說(shuō)明COS預(yù)處理可顯著提高ATO導(dǎo)致的MMP降低，從而降低ATO對(duì)線粒體產(chǎn)生的傷害。

2.7 COS預(yù)處理對(duì)ATO誘導(dǎo)的BRL-3A細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖6所示，COS單獨(dú)處理組細(xì)胞的密度和細(xì)胞形態(tài)均正常，呈貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)、多邊形或梭形、細(xì)胞形態(tài)飽滿。ATO單獨(dú)處理時(shí)，隨著ATO濃度升高而細(xì)胞密度降低，且呈橢圓形的細(xì)胞量增多。當(dāng)100 μmol·L-1COS和200 μmol·L-1COS預(yù)處理時(shí)，能夠有效減輕ATO導(dǎo)致的細(xì)胞密度下降并改善細(xì)胞的形態(tài)。

圖4 COS預(yù)處理對(duì)BRL-3A細(xì)胞內(nèi)抗氧化體系的影響

Figure 4 Effect of COS pretreatment on antioxidant system in BRL-3A cells

圖5 COS預(yù)處理對(duì)ATO引起B(yǎng)RL-3A細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位變化的影響

Figure 5 Effect of COS pretreatment on changes of mitochondrial membrane potential induced by ATO in BRL-3A cells

圖6 COS預(yù)處理對(duì)ATO誘導(dǎo)的BRL-3A細(xì)胞形態(tài)的影響

Figure 6 Effect of COS pretreatment on changes of morphological induced by ATO in BRL-3A cells

3 討論與結(jié)論

研究殼寡糖對(duì)三氧化二砷致BRL-3A細(xì)胞毒性的保護(hù)作用并探討其機(jī)制。BRL-3A細(xì)胞產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)引起細(xì)胞凋亡，這可能是導(dǎo)致三氧化二砷對(duì)BRL-3A細(xì)胞產(chǎn)生毒性的重要原因。殼寡糖可以通過(guò)平衡細(xì)胞原有的抗氧化防御體系來(lái)降低細(xì)胞死亡率，從而顯著地降低三氧化二砷產(chǎn)生的毒性，這可能與提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性和降低脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)。

乳酸脫氫酶釋放被看作一種細(xì)胞膜體系完整性的重要指標(biāo)，正常生理?xiàng)l件下，LDH是存在于胞漿內(nèi)不能穿過(guò)細(xì)胞膜；當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死時(shí)，細(xì)胞漿內(nèi)的LDH釋放到培養(yǎng)基里，導(dǎo)致產(chǎn)生細(xì)胞毒性[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，100和200 μmol·L-1殼寡糖預(yù)處理可降低三氧化二砷引起的細(xì)胞LDH水平的升高，說(shuō)明殼寡糖能降低三氧化二砷引起的LDH釋放。丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激而產(chǎn)生脂質(zhì)氧化時(shí)，MDA水平便會(huì)升高，MDA被廣泛用作氧化應(yīng)激的標(biāo)志[13, 15]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，100和200 μmol·L-1殼寡糖預(yù)處理可降低三氧化二砷引起的脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的MDA的水平升高，說(shuō)明殼寡糖能有效抑制三氧化二砷引起脂質(zhì)過(guò)氧化對(duì)機(jī)體造成的損害作用。氧化應(yīng)激是由過(guò)多的氧化自由基引起的，這些自由基直接與生物分子反應(yīng)，破壞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA及細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致細(xì)胞或器官損傷[16-17]。當(dāng)細(xì)胞受損時(shí)，原本穩(wěn)定的氧化還原體系就會(huì)發(fā)生改變。超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化酶類[18]。100和200 μmol·L-1殼寡糖預(yù)處理均可以升高三氧化二砷誘導(dǎo)的GST、SOD和CAT活性。殼寡糖預(yù)處理能顯著提高抗氧化酶GST、SOD和CAT的活性從而提高細(xì)胞的抗氧化能力。在一定程度上，殼寡糖對(duì)三氧化二砷引起的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷起到了有效的保護(hù)作用并使細(xì)胞處于平衡的氧化還原狀態(tài)。結(jié)果表明：100和200 μmol·L-1的殼寡糖對(duì)5和10 μmol·L-1三氧化二砷引起的BRL-3A細(xì)胞毒性有顯著的保護(hù)作用。線粒體膜通透性的轉(zhuǎn)變是細(xì)胞凋亡的早期跡象。凋亡中的線粒體功能障礙與線粒體膜對(duì)大分子(包括與凋亡過(guò)程相關(guān)的離子)的特殊通透性有關(guān)。線粒體膜電位下降表明細(xì)胞凋亡可以通過(guò)一種獨(dú)特的熒光陽(yáng)離子染料JC-1來(lái)檢測(cè)[19]。殼寡糖預(yù)處理可顯著升高三氧化二砷引起的線粒體膜電位的降低，從而減輕三氧化二砷對(duì)線粒體造成的傷害，降低細(xì)胞凋亡率。殼寡糖預(yù)處理能夠有效減輕三氧化二砷導(dǎo)致的細(xì)胞密度下降并改善細(xì)胞形態(tài)。

綜上所述，殼寡糖能夠顯著減輕三氧化二砷對(duì)大鼠肝細(xì)胞造成的細(xì)胞毒性，這可能與殼寡糖提高細(xì)胞本身抗氧化能力有關(guān)。本研究對(duì)于殼寡糖和三氧化二砷聯(lián)合使用以減輕三氧化二砷的毒性提供了依據(jù)，具有一定的理論價(jià)值和實(shí)際意義。

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Protective effect of chitosan oligosaccharide against the toxicity of arsenic trioxide toward Buffalo rat liver cells

ZHENG Wenjing, YANG Jingya, LIU Kehai

(College of Food Sciences & Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306)

To study the protective effect of chitosan oligosaccharide (COS) against the toxicity of arsenic trioxide (ATO) toward normal Buffalo rat liver cells (BRL-3A), we determined the proliferation inhibition rate of BRL-3A cells induced by arsenic trioxide and chitosan oligosaccharide, cell survival rate of BRL-3A cells pretreated with chitosan oligosaccharides induced by arsenic trioxide, lactate dehydrogenase (LDH) release, malondialdehyde (MDA) assay, glutathione s-transferase (GST) activity, superoxide dismutase (SOD) activity, catalase (CAT) activity and mitochondrial membrane potential (MMP). The results showed that the IC50of ATO to BRL-3A cells was 19.8 μmol·L-1, while COS did not cause damage when it was below 230 μmol·L-1. BRL-3A cells were pretreated with COS for 24 h, and then ATO was applied to the cells for another 24 h. Through the detection of LDH, MDA, GST, SOD, CAT and MMP, COS pretreatment could reduce the level of LDH release to 176.23% ± 5.87% induced by ATO, thus reduced the cytotoxicity induced by ATO; COS could effectively inhibit the damage caused by ATO-induced lipid peroxidation, and relative release content of MDA decreased to 191.91% ± 2.89%; COS could significantly increase the activities of antioxidant enzymes GST, SOD and CAT, increased to 86.20% ±1.41%, 90.09% ±1.33% and 61.29% ±0.21%, respectively, improve the antioxidant capacity and defense ability of cells, and reduce the oxidative stress damage induced by ATO; COS pretreatment could inhibit the decrease of mitochondrial membrane potential induced by ATO and reduce the damage of ATO to mitochondria; COS pretreatment could retard the decrease of mitochondrial membrane potential induced by arsenic trioxide and reduce the mitochondrial damage caused by arsenic trioxide. Therefore, chitosan oligosaccharide has a certain protective effect on the toxic damage of BRL-3A induced by arsenic trioxide.

chitosan oligosaccharide; arsenic trioxide; cytotoxicity; oxidative damage; protective effect

S865.127

A

1672-352X (2021)03-0412-06

10.13610/j.cnki.1672-352x.20210706.021

2021-7-7 10:34:33

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20210706.1659.042.html

2020-08-15

國(guó)家自然科學(xué)基金( 81572989)資助。

鄭雯靜，碩士研究生。E-mail：zheng_wenjing@126.com

楊靖亞, 副教授。E-mail：jyyang@shou.cn