傅 強(qiáng),王偉佳,黃福達(dá),繆麗韶，楊山虹，陳 康

廣東省中山市人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，廣東中山 528403

銅綠假單胞菌為革蘭陰性桿菌，是引起院內(nèi)感染的常見條件致病菌，可引起多種組織器官的感染，如肺部、皮膚、角膜等[1-2]。臨床上抗菌藥物的使用可以改善患者的病情，然而，隨著抗菌藥物的不合理使用，導(dǎo)致銅綠假單胞菌的耐藥性越發(fā)嚴(yán)重，致使應(yīng)用抗菌藥物后不能達(dá)到滿意的治療效果[1-2]。因此，如何發(fā)揮宿主的能動性、提高免疫防御功能是抗感染免疫的研究熱點(diǎn)。

Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號通路是進(jìn)化高度保守的通路，盡管參與該通路的分子眾多，β-catenin是該通路中的核心分子。當(dāng)Wnt/β-catenin通路未被激活時(shí)， β-catenin被降解失活。當(dāng)Wnt/β-catenin通路被激活后，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中累積并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核促進(jìn)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，參與胚胎的發(fā)育和多器官的穩(wěn)態(tài)[1,3-4]。有報(bào)道顯示，β-catenin可參與病原體的感染過程，且因病原體的種類不同，發(fā)揮不同的作用。有研究報(bào)道，β-catenin抑制人類免疫缺陷病毒(HIV)的復(fù)制，抑制DNA病毒的感染，抑制傷寒沙門菌的感染[5-7]；另一方面，β-catenin促進(jìn)Ⅰ型牛皰疹病毒的感染[8]。然而，β-catenin在銅綠假單胞菌感染中的作用還需研究?？咕腖L-37是具有廣譜抗菌作用的多肽，可促進(jìn)銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌等病原體的清除[9-11]。在結(jié)腸癌中，β-catenin和LL-37相伴增高[12]。然而β-catenin是否通過調(diào)控LL-37來促進(jìn)銅綠假單胞菌的清除還需進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，在RAW264.7細(xì)胞和骨髓來源巨噬細(xì)胞中，β-catenin促進(jìn)銅綠假單胞菌的清除；同時(shí)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，β-catenin促進(jìn)LL-37的基因表達(dá)；進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LL-37可回復(fù)β-catenin介導(dǎo)的細(xì)菌清除作用，具體報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠成纖維細(xì)胞株L929和小鼠巨噬細(xì)胞樣RAW264.7細(xì)胞在含10%胎牛血清的高糖達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)中于37 ℃ 5%二氧化碳(CO2)條件下培養(yǎng)。L929細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min去除細(xì)胞碎片，經(jīng)0.22 μm濾器過濾后分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆?。L929細(xì)胞上清液中富含集落刺激分子，可誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。過表達(dá)β-catenin的RAW264.7細(xì)胞和對照細(xì)胞以1×106個(gè)/毫升細(xì)胞數(shù)鋪入6孔板中，培養(yǎng)過夜，銅綠假單胞菌感染后進(jìn)行后續(xù)細(xì)菌平板計(jì)數(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)。

1.2小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng) 無特定病原體(SPF)級6周齡雌性C57BL/6小鼠，處死后無菌條件下取股骨和脛骨中的骨髓細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，1×107鋪入10 cm培養(yǎng)皿中，置于含5%胎牛血清、10% L929培養(yǎng)上清液的高糖DMEM中培養(yǎng)7 d，誘導(dǎo)成骨髓來源巨噬細(xì)胞。用β-catenin慢病毒和對照慢病毒感染骨髓來源巨噬細(xì)胞，過表達(dá)β-catenin[13]。然后，以5×105個(gè)/毫升細(xì)胞數(shù)鋪入6孔板中，培養(yǎng)過夜，銅綠假單胞菌感染后進(jìn)行后續(xù)細(xì)菌平板計(jì)數(shù)和Real-time PCR。

1.3小RNA干擾實(shí)驗(yàn) 小鼠LL-37的小干擾RNA(siRNA)和小干擾RNA對照(siNC)購于Santa Cruz Biotechnology公司。按照說明書采用陽離子脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染，以5 μmol/L為siRNA的終水平沉默細(xì)胞中LL-37，進(jìn)行后續(xù)的細(xì)菌清除實(shí)驗(yàn)。

表1 引物序列

1.5細(xì)菌清除實(shí)驗(yàn) RAW264.7細(xì)胞和骨髓來源巨噬細(xì)胞加入銅綠假單胞菌共孵育1 h后，更換含300 μg/mL 慶大霉素的培養(yǎng)基作用30 min清除胞外菌，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后，設(shè)置兩個(gè)復(fù)孔，一個(gè)復(fù)孔收集1 h細(xì)胞懸液，0.1% 曲拉通-X裂解細(xì)胞釋放細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌，平板計(jì)數(shù)計(jì)算1 h菌落數(shù)；另一個(gè)復(fù)孔繼續(xù)培養(yǎng)1 h，收集2 h細(xì)胞懸液，0.1% 曲拉通-X裂解細(xì)胞釋放細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌，平板計(jì)數(shù)計(jì)算2 h菌落數(shù)。細(xì)菌清除率=(1 h菌落數(shù)-2 h菌落數(shù))/1 h菌落數(shù)×100%。

2 結(jié) 果

2.1β-catenin促進(jìn)銅綠假單胞菌的清除 銅綠假單胞菌感染過表達(dá)β-catenin的RAW264.7細(xì)胞和骨髓來源巨噬細(xì)胞后，細(xì)菌平板計(jì)數(shù)檢測細(xì)菌清除情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在RAW264.7細(xì)胞(圖 1A)和骨髓來源巨噬細(xì)胞(圖 1B)中，β-catenin促進(jìn)細(xì)菌的清除，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2銅綠假單胞菌感染時(shí)，β-catenin促進(jìn)LL-37基因的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在RAW264.7細(xì)胞中細(xì)菌感染12 h后，β-catenin促進(jìn)抗菌肽LL-37的表達(dá)(圖 2A)；同樣發(fā)現(xiàn)，在骨髓來源巨噬細(xì)胞細(xì)菌感染12 h后，β-catenin促進(jìn)抗菌肽LL-37的表達(dá)(圖2B)。

2.3β-catenin調(diào)控LL-37促進(jìn)銅綠假單胞菌的清除 在過表達(dá)β-catenin的RAW264.7細(xì)胞和骨髓來源巨噬細(xì)胞中，銅綠假單胞菌感染后，采用平板計(jì)數(shù)的方法檢測細(xì)菌清除率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)β-catenin可在RAW264.7細(xì)胞(圖3A)和骨髓來源巨噬細(xì)胞(圖3B)中促進(jìn)細(xì)菌清除；實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示，LL-37可在RAW264.7細(xì)胞(圖3A)和骨髓來源巨噬細(xì)胞(圖3B)中回復(fù)β-catenin的殺菌作用。

注：*P<0.05，**P<0.01;A為RAW264.7細(xì)胞；B為骨髓來源巨噬細(xì)胞。

注：*P<0.05，**P<0.01;0 h和12 h分別表示銅綠假單胞菌未感染及感染后12 h;A為RAW264.7細(xì)胞；B為骨髓來源巨噬細(xì)胞。

注：*P<0.05，**P<0.01；A為RAW264.7細(xì)胞；B為骨髓來源巨噬細(xì)胞。

3 討 論

β-catenin是進(jìn)化高度保守的Wnt/β-catenin通路中的核心分子，不僅在生理狀態(tài)下發(fā)揮重要作用[3-4]，還可在病理?xiàng)l件下如多種病原體感染中發(fā)揮調(diào)控作用，且因病原體不同發(fā)揮的作用不盡相同[5-8]。本研究發(fā)現(xiàn)，在銅綠假單胞菌感染時(shí)，β-catenin促進(jìn)銅綠假單胞菌的清除。

β-catenin促進(jìn)銅綠假單胞菌清除的機(jī)制如何，還有待于進(jìn)一步研究。研究報(bào)道，在不同病原體感染中β-catenin促進(jìn)病原體清除的機(jī)制不盡相同。據(jù)報(bào)道，在傷寒沙門菌感染時(shí)，β-catenin可通過上調(diào)小腸上皮細(xì)胞的核心巖藻糖基化而上調(diào)腸道菌群來對抗細(xì)菌感染[7]；在HIV感染時(shí)，β-catenin可在膠質(zhì)細(xì)胞中抑制HIV長末端重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄，抑制病毒的感染[5]；在DNA病毒感染時(shí)，β-catenin可協(xié)調(diào)環(huán)磷酸鳥苷-腺苷酸合成酶(cGAS)/干擾素基因刺激因子(STING)介導(dǎo)的干擾素信號通路，抑制感染[6]；在豬生殖和呼吸系統(tǒng)綜合征病毒感染時(shí)，β-catenin可通過增強(qiáng)核因子活化B細(xì)胞κ輕鏈增強(qiáng)子(NF-κB)介導(dǎo)的自身免疫應(yīng)答抑制病毒的復(fù)制[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-catenin可上調(diào)抗菌肽LL-37的表達(dá)。

LL-37是具有廣譜殺菌作用的抗菌肽。研究報(bào)道，LL-37可抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成，可促進(jìn)中性粒細(xì)胞釋放活性氧自由基，促進(jìn)中性粒細(xì)胞體外誘捕網(wǎng)的形成，從而達(dá)到促進(jìn)銅綠假單胞菌清除的作用[10-11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在銅綠假單胞菌感染的巨噬細(xì)胞中，β-catenin通過調(diào)控LL-37促進(jìn)銅綠假單胞菌的清除，然而本研究未涉及LL-37促進(jìn)細(xì)菌清除的機(jī)制。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)β-catenin在巨噬細(xì)胞中通過調(diào)控LL-37促進(jìn)銅綠假單胞菌的清除，揭示了β-catenin促進(jìn)銅綠假單胞菌清除的機(jī)制，為銅綠假單胞菌感染的治療提供備選方案。