劉亞舉，胡 萌，石美森，李學博

1.河南省許昌市公安局刑事科學技術研究所，河南許昌 461000；2.鐵道警察學院公安技術系，河南鄭州 450053；3.中國政法大學刑事司法學院偵查學研究所，北京100192；4.山東省高校證據鑒識重點實驗室(山東政法學院)，山東濟南 250014

插入/缺失(InDel)多態(tài)性遺傳標記是指基因組中插入或缺失不同大小的DNA片段所形成的多態(tài)性遺傳標記。InDel在人類基因組中分布廣泛，一般平均每隔7.2 kb就會有一個InDel位點，即約20%的DNA多態(tài)性是InDel，在法醫(yī)學應用領域中，由于InDel具有突變率相對較低、擴增片段較小(通常<200 bp)的特點，適用于降解檢材的分析和親緣關系鑒定，同時InDel是二等位基因，不適合用于混合檢材的分析，但其兼具了短串聯(lián)重復序列(STR)和單核苷酸多態(tài)性(SNP)兩種遺傳標記的雙重優(yōu)點，且可以用法醫(yī)DNA實驗室的毛細管電泳平臺進行基因分型檢測，分型方法簡便、快速、準確，易于在法醫(yī)DNA實驗室進行推廣和應用。本研究針對貴州仡佬族和苗族人群常染色體上30個InDel位點的遺傳多態(tài)性進行分析，評估其在法醫(yī)學中的應用價值，同時為個體識別和親權鑒定、群體間遺傳分布等相關研究提供參考數據。

1 材料與方法

1.1材料來源 根據知情同意原則，從健康體檢人群中隨機采集貴州仡佬族(220例，其中男175例、女45例)和苗族(207例，其中男157例、女50例)無血緣關系個體外周血0.1 mL，滴入采血卡(武漢驥騰公司)，陰干后常溫保存。本研究得到相關道德倫理委員會批準。

通過中國知網(www.cnki.net)和NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)數據庫獲得5個漢族[北京漢族(210例)、河南漢族(293例)、上海漢族(565例)、成都漢族(129例)、廣東漢族(300例)]和13個少數民族[新疆維吾爾族(223例)、西藏藏族(226例)、福建畬族(119例)、四川彝族(54例)、廣西壯族(49例)、廣西侗族(50例)、廣西苗族(50例)、四川藏族(136例)、云南彝族(122例)、新疆錫伯族(223例)、湖北土家族(236例)、新疆哈薩克族(96例)、云南白族(125例)]等18個人群的30個InDel位點等位基因頻率作為群體遺傳關系比較的數據。

1.2儀器與試劑 Hamilton STAR-LET自動化工作站(AusBio公司，瑞士)；平板離心機(Eppendorf公司，德國)；9700型PCR擴增儀(AB公司，美國)；3500XL型遺傳分析儀和ID-X分析軟件(AB公司，美國)；GeneMarker?HID分析軟件(SoftGenetics公司，美國)；Investigator?DIPplex試劑盒(Qiagen公司，德國)。

1.3方法 采用5% Chelex-100快速提取法提取標本DNA。在Eppendorf Mastercycler pro S銀座熱循環(huán)儀上進行復合擴增，Investigator?DIPplex試劑盒反應體系為10 μL，其中Reaction Mix A 2.0 μL，Primer Mix 2.0 μL，Multi Taq2 DNA Polymerase 0.25 μL，純水4.75 μL，模板DNA 1.0 μL(0.5～1.0 ng/μL)。PCR擴增條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，61 ℃復性120 s，72 ℃延伸75 s，30個循環(huán)；最后68 ℃延伸60 min，10 ℃保溫。取1.0 μL擴增產物與DNA size standard 550(標記橙色熒光素BTO)0.5 μL和10.0 μL去離子甲酰胺混合，95 ℃變性3 min后，冰浴3 min，置3500XL型遺傳分析儀上進行全自動毛細管電泳，Data Collection軟件收集數據，用GeneMarker?HID分析軟件進行等位基因分型，并采用GeneMapper ID-X v1.5分析軟件復核。每批標本檢測均采用XX28和超純水分別作為陽性對照和陰性對照。

1.4統(tǒng)計學處理 用PowerStats v12.xls軟件統(tǒng)計分析30個InDel位點的等位基因頻率、個體識別率(DP)、累積個體識別率(TDP)、多態(tài)信息含量(PIC)和非父排除率(PE)等法醫(yī)學相關參數；采用Cervus 3.0軟件計算三聯(lián)體累積非父排除率(CPEtrio)和二聯(lián)體累積非父排除率(CPEduo)。采用Arlequin v3.5軟件計算30個InDel位點的觀察雜合度(Ho)和期望雜合度(He)，并進行各位點的Hardy-Weinberg平衡及連鎖不平衡檢驗；采用Haploview軟件分析Hardy-Weinberg平衡P值。采用GENEPOP v4.2軟件計算各群體間遺傳距離和遺傳分化系數(Fst)等參數。

2 結 果

2.1貴州仡佬族和苗族人群30個InDel位點的群體遺傳學參數 在貴州220例仡佬族和207例苗族無關個體血樣中，Investigator?DIPplex熒光檢測試劑盒中的30個InDel位點都得到了有效擴增，且各位點間擴增產物平衡。經Bonferroni校正，30個InDel位點的基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，各位點的群體遺傳學參數見表1。

表1 貴州仡佬族和苗族群體30個InDel位點的群體遺傳學參數

2.2貴州仡佬族和苗族人群30個InDel位點的連鎖不平衡檢驗 經Arlequin v3.5軟件分析后發(fā)現(xiàn)，貴州仡佬族和苗族人群的30個InDel位點之間相互獨立，各位點間均不存在連鎖不平衡現(xiàn)象(P>0.05)。采用乘積定律計算，TDP分別為0.999 999 999 34和0.999 999 996 86，CPEduo分別為0.951 2和0.952 8，CPEtrio分別為0.995 6和0.995 7。

續(xù)表1 貴州仡佬族和苗族群體30個InDel位點的群體遺傳學參數

2.3貴州仡佬族和苗族與其他群體的遺傳分化系數Fst及遺傳距離 應用本研究獲得的30個InDel位點基因頻率數據分析了貴州仡佬族和苗族人群與18個比較群體的Nei′s DA遺傳距離，見表2；通過缺失頻率進行計算的20個群體之間的遺傳分化系數Fst值，見表3。結果顯示，仡佬族和苗族與成都漢族的遺傳距離較近，分別與新疆維吾爾族和哈薩克族的遺傳距離較遠。

表2 貴州仡佬族、苗族群體與其他18個群體的遺傳距離

表3 30個InDel 遺傳標記在20個群體中的遺傳分化系數Fst值

續(xù)表3 30個InDel 遺傳標記在20個群體中的遺傳分化系數Fst值

續(xù)表3 30個InDel 遺傳標記在20個群體中的遺傳分化系數Fst值

位點廣西苗族云南彝族云南白族新疆錫伯族湖北土家族新疆哈薩克族FstHLD770.6500.6800.5600.4840.5360.5380.013 2HLD450.2500.3440.3920.3680.3470.2800.009 0HLD1310.6300.7130.5720.6860.6650.5490.014 8HLD700.4700.4840.3560.3830.4360.4120.007 4HLD60.6500.6230.5200.4570.5320.4180.012 7HLD1110.8700.9220.8880.8770.9090.7090.137 5HLD580.5300.6230.6160.7000.5970.5880.015 7HLD560.4900.5780.4360.4010.4490.4120.011 8HLD1180.0200.1110.1080.0850.0440.3460.091 1HLD920.6300.5820.5360.5180.5440.4450.007 9HLD930.4500.3070.4600.3790.4410.4070.009 6HLD990.2100.1600.2000.1570.1360.3900.037 4HLD880.4000.4260.4720.4220.4470.4120.012 9HLD1010.6300.5040.5520.5110.5340.4560.009 7HLD670.1900.2950.3280.2850.2460.4290.026 8HLD830.6400.4920.6200.5940.6190.6480.010 8HLD1140.8200.7540.8160.6790.7650.5710.016 8HLD480.6200.6310.6360.5920.5570.5550.003 9HLD1240.5500.4060.4640.4130.4170.4180.005 4HLD1220.8600.7540.7600.7260.7670.6370.023 9HLD1250.5100.5740.5480.5920.6480.5330.009 3HLD640.1000.1020.1320.2350.1400.3080.022 8HLD810.2000.1150.1400.1570.1690.3020.017 9HLD1360.7000.6480.4880.4570.4720.5110.019 7HLD1330.7100.6760.6120.5940.6380.5490.009 4HLD970.6400.6840.6840.6260.6610.6370.014 0HLD400.4200.4300.3840.3770.3260.4670.018 3HLD1280.7500.8520.7480.6390.6500.5930.019 3HLD390.8900.9060.8320.8480.8830.7750.037 2HLD840.1800.2090.3000.1970.2390.2970.020 5

3 討 論

貴州是個多民族省份，現(xiàn)有少數民族49個，世居17個。仡佬族是貴州最古老的民族之一，且貴州是仡佬族的發(fā)源地。貴州仡佬族和苗族人口分別占全國同一民族總人口的97%和50%以上，分屬于漢藏語系的壯侗語族和苗瑤語族。目前，國內外學者對仡佬族和苗族白細胞抗原(HLA-G)、線粒體DNA和STR等遺傳標記的多態(tài)性進行了研究[1-8]，而本研究對427例仡佬族和苗族健康無關個體的30個InDel位點的遺傳多態(tài)性進行分析，同時探討其與其他群體之間的遺傳學關系，有助于分析InDel遺傳標記在不同民族或同一民族不同群體間的遺傳、進化的相互關系，為科學應用InDel遺傳標記提供理論基礎。

Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗結果一方面可以反映基因分型的質量，另一方面也反映研究對象的代表性是否較好。本研究結果顯示，經過Bonferroni法校正，30個InDel位點的基因型頻率分布在貴州仡佬族和苗族群體中符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，說明貴州仡佬族和苗族群體在符合隨機采樣的情況下，群體中個體的基因頻率可從一代傳到另一代且維持不變，保持遺傳的平衡穩(wěn)定性，本次標本隨機性和采集數目符合統(tǒng)計學要求。連鎖不平衡檢驗結果表明，30個InDel位點在貴州仡佬族和苗族群體中不存在連鎖不平衡現(xiàn)象(P>0.05)，提示這些位點是相互獨立的遺傳標記，可以應用于法醫(yī)學鑒定。

本研究根據30個InDel位點的等位基因頻率進行了貴州仡佬族和苗族與其他群體的遺傳距離分析，結果顯示，貴州仡佬族和苗族與成都漢族的遺傳距離較近，分別與新疆維吾爾族和哈薩克族的遺傳距離較遠。劉亞舉等[7-8]基于常染色體STR和Y-STR遺傳標記研究了仡佬族和苗族的遺傳結構及與其他群體的遺傳關系，發(fā)現(xiàn)仡佬族和苗族與湖北、湖南、重慶漢族有較近的遺傳距離，與西藏藏族、甘肅裕固族、青海藏族有較遠的遺傳距離。李彬彬等[3]和姚永剛等[9]調查線粒體DNA 9bp缺失頻率，結果發(fā)現(xiàn)仡佬族為25%、苗族為32.4%，與目前認為南方民族人群的缺失頻率高于北方民族人群的觀點是一致的[9]。何燕等[5]基于貴州苗族等人群的線粒體DNA多態(tài)性研究表明，組成“南方譜系”的B、M7、N9、R9等在貴州苗族等3個民族中頻率為51.22%，同時構建了20個人群mtDNA單倍群頻率主成分，分析結果表明貴州苗族是南方民族。劉烜等[10]研究了貴州仡佬族等貴州境內多個民族個體外周血標本Y染色體單核苷酸多態(tài)(Y-SNP)，其中仡佬族H8單倍型(M134)和苗族H8(M134)、H11(M95)、H12(M88)頻率較高，也表明仡佬族和苗族均是南方民族。這些研究表明，InDel作為遺傳標記物，以等位基因頻率計算遺傳距離可用于群體遺傳學的研究，和地域實際的物理距離區(qū)分度相似，與民族的起源、進化、遷徙的研究數據結果一致[11-12]。

遺傳分化系數Fst值是進行群體間遺傳分化概括分析最常用的方法之一，是評價基因座等位基因頻率在群體間的分布差異程度。WRIGHT認為群體間Fst值在0.00～<0.05表示群體間不存在分化，F(xiàn)st值在0.05～<0.15則為中度分化，F(xiàn)st值在0.15～0.25則為高度分化，F(xiàn)st值>0.25則分化度極大。WEI等[13]對中國漢族、藏族、維吾爾族和哈薩克族群體30個InDel位點的Fst分析結果顯示，HLD111和HLD118位點遺傳分化貢獻率相對較高。LARUE等[14]對北美地區(qū)的非洲裔、高加索人、亞裔和西南部西班牙裔的Fst分析結果也證實，HLD111和HLD118等位點遺傳分化貢獻率相對較高。本研究中，HLD111和HLD118位點Fst值分別為0.137 5、0.091 1，在20個群體中遺傳分化貢獻率相對較高，提示這兩個位點在不同民族，尤其是不同人種中基因型分布有很大的差異，反映群體差異性大，在群體遺傳學和種群識別方面有重要的應用價值。

綜上所述，由于貴州仡佬族和苗族大多在偏遠地區(qū)聚族而居，生活環(huán)境相對封閉，各民族之間隔離程度較高，民族特異性保存較好，這些遺傳特性成為人類遺傳多樣性的重要組分，可作為遺傳學上很好的研究材料。這些民族的遺傳物質是全人類遺傳多樣性的重要組成部分，研究這些民族的起源和進化對于探索中華民族乃至東亞人群的起源也具有重要意義。