寇先勇，徐肖迪，張成，汪印元，張子林，祝紅達(dá)

(湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 & 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 & 工業(yè)微生物湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430068)

茶葉中含有豐富的天然多酚，具有廣泛的生物活性如抗氧化，預(yù)防心血管疾病以及抗癌等，對預(yù)防人體齲齒也有重要的作用[1-2]. 齲齒作為一種常見的慢性疾病，尤其在兒童以及青少年人群中發(fā)病率較高，是由口腔細(xì)菌導(dǎo)致的多種復(fù)合因素作用下牙體硬組織的病變，其中變異鏈球菌(Streptococcusmutans,S.mutans)是常見的致齲菌[3]. 變異鏈球菌致齲的主要途徑為細(xì)菌在口腔中的積累，加速蔗糖代謝為乳酸及其他有機(jī)酸并對牙齒表面粘附，因此通過阻止細(xì)菌在牙齒表面的粘附和積累這一過程可以大大降低齲齒的發(fā)病率[4-5]. 研究表明茶葉有效成分茶多酚中含量最多且活性最強(qiáng)的多酚物質(zhì)表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)特有的酚羥基結(jié)構(gòu)使其具有高抗氧化能力，能抑制乳酸脫氫酶和致齲因子(GTF)的活性，降低致齲菌產(chǎn)酸能力、減少致齲菌在牙齒表面的粘附聚集從而抑制致齲菌的生長[6-7]. 由于EGCG結(jié)構(gòu)的特異性，其在人體生理環(huán)境中易發(fā)生氧化、異構(gòu)化和降解等,造成EGCG的活性降低，同時超強(qiáng)的極性使藥物分子不易穿透細(xì)胞膜導(dǎo)致其在體內(nèi)的生物利用度降低， 因此如何提高EGCG的穩(wěn)定性及其生物利用度成為其發(fā)揮預(yù)防齲齒作用需要解決的關(guān)鍵問題[8].

EGCG與磷脂通過相互作用可以形成較為穩(wěn)定的磷脂復(fù)合物，提高其穩(wěn)定性的同時可以改善親水性分子的脂溶性，增強(qiáng)跨生物膜的藥物吸收[8]. 近年來，納米包埋技術(shù)已成功地應(yīng)用于活性有效成分及藥品中，磷脂納米囊泡作為親水活性成分載體，對親水性活性成分具有較強(qiáng)的親和力，可以粘附在生物表面上提高活性成分的生物利用度[9-11]. 本文設(shè)計(jì)一種以EGCG磷脂復(fù)合物為基礎(chǔ)的EGCG磷脂納米囊泡，利用納米囊泡的載體性能和磷脂復(fù)合物解決EGCG穩(wěn)定性問題和吸收問題，延長活性成分在牙齒表面吸附時間，增強(qiáng)EGCG的防齲齒療效.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG，純度 >98%)、蛋黃卵磷脂(純度 ≥ 99%)(國藥集團(tuán))；吐溫-80 (德國Biofroxx Gmbh)；變異鏈球菌ATCC 25175(武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心)；胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、腦心浸液肉湯培養(yǎng)基(BHI)(青島海博生物)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

Pyris Diamond熱重分析儀(美國Perkin-Elmer)；UV-Lambda 35紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津)；Zetasizer Nano ZS 90激光粒度儀(英國Malvern)；Tecnai G220 S-TWIN透射電子顯微鏡(捷克FEI)；Scientz-IID超聲波細(xì)胞破碎儀(寧波新芝生物).

1.2 EGCG磷脂復(fù)合物及載EGCG納米囊泡的制備

首先選擇蛋黃卵磷脂與EGCG制備成磷脂復(fù)合物，然后采用乙醇注入法制備EGCG納米囊泡[12-13]. 具體制備過程如下：稱取處方量(表1)的蛋黃卵磷脂加入6 mL無水乙醇中，磁力攪拌至蛋黃卵磷脂充分溶解；加入處方量的EGCG，40 ℃恒溫水浴下攪拌冷凝回流4 h即得EGCG磷脂復(fù)合物；稱量0.2 g 吐溫-80溶于10 mL超純水，攪拌均勻成水相；在35 ℃水浴快速攪拌下，將上述EGCG磷脂復(fù)合物緩慢滴加至水相，攪拌過夜；將所得溶液置于細(xì)胞破碎儀中(4 s∶1 s，功率為60%)超聲3 min，得EGCG納米囊泡.

1.3 EGCG 磷脂復(fù)合物的表征

(1) EGCG磷脂復(fù)合物紫外光譜分析 將EGCG、卵磷脂、EGCG磷脂復(fù)合物分別溶于無水乙醇，其中復(fù)合物溶液中EGCG的濃度與EGCG溶液的濃度相同，復(fù)合物溶液中磷脂濃度與磷脂溶液的濃度相同，對3種溶液在200～400 nm波段進(jìn)行紫外掃描分析.

(2) EGCG磷脂復(fù)合物差式掃描量熱分析(DSC) 以空坩堝作為參比，設(shè)置升溫速率為10 ℃/min、掃描范圍為20～300 ℃、N2流速為30 mL/min，分別對磷脂、EGCG、EGCG磷脂復(fù)合物及EGCG與磷脂的物理混合物進(jìn)行DSC測定.

1.4 以納米特性為指標(biāo)的納米囊泡處方篩選

采用調(diào)整藥脂比對處方進(jìn)行優(yōu)化，固定總體系體積為15 mL, 卵磷脂的濃度為10 mg/mL，調(diào)整EGCG量探索磷脂復(fù)合物所能達(dá)到的最佳比例，以最終所得EGCG納米囊泡的粒徑以及納米囊泡分散系數(shù)(PDI)為評判標(biāo)準(zhǔn)，處方組成如表1.

表1 EGCG納米囊泡處方Tab.1 Formulation of EGCG nanovesicle

1.5 EGCG納米囊泡形貌表征

將EGCG納米囊泡溶液用超純水稀釋15倍，滴加至銅網(wǎng)上，晾干后用2%磷鎢酸進(jìn)行負(fù)染，再次晾干后經(jīng)透射電鏡觀察其形貌特征.

1.6 穩(wěn)定性評價(jià)

將EGCG納米囊泡分別置于室溫及4 ℃冰箱保存，觀察樣品形狀,同時測量其粒徑觀察粒徑變化及樣品的包封率.

1.7 EGCG的含量測定

1.7.1 EGCG標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

因EGCG與卵磷脂的紫外特征峰相互重疊，直接進(jìn)行測量會有較大誤差，所以選用酒石酸亞鐵比色法測定EGCG濃度. 取不同量的0.1 mg/mL EGCG標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入5 mL顯色劑(0.5 g酒石酸鉀鈉和0.1 g FeSO4·7H2O混合，去離子水溶解，100 mL容量瓶定容)，磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/mL，pH 7.5)定容至25 mL，配制成濃度為1、2.5、5、7.5、15、20 μg/mL的EGCG標(biāo)準(zhǔn)溶液；以磷酸鹽緩沖液作為空白，依次測定540 nm處不同濃度EGCG標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，并繪制吸光度與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.7.2 納米囊泡包封率(EE)的測定

取200 μL EGCG納米囊泡加入2 mL無水乙醇，超聲10 min破乳，取1 mL樣品，加入5 mL顯色劑，磷酸鹽緩沖液定容至25 mL，測量其在540 nm處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)濃度及質(zhì)量，平行實(shí)驗(yàn)3次. 包封率計(jì)算方式如下：

式中：EE表示納米囊泡包封率.

1.8 抗變異鏈球菌評價(jià)

在無菌操作臺上，將變異鏈球菌(ATCC 25175)接種至BHI肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，用無菌PBS將其稀釋至菌含量為5×106CFU/mL，備用.

采用牛津杯法評價(jià)EGCG納米囊泡的抗齲齒效果[14]. 使用BHI瓊脂培養(yǎng)基各20 mL制作平板，在平板中等距放置4個直徑為8 mm的牛津杯，分別加入200 μL無菌PBS，200 μL空白納米囊泡(不含EGCG)，200 μL EGCG溶液(1 mg/mL)和200 μL EGCG納米囊泡(1 mg/mL)，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，測量各組抑菌圈大小，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.9 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以X±SD表示，采用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，在所有統(tǒng)計(jì)分析中， **表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001.

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外光譜分析

EGCG、卵磷脂、EGCG磷脂復(fù)合物的紫外掃描圖見圖1，圖中EGCG、EGCG磷脂復(fù)合物在278 nm處有最強(qiáng)吸收峰，而磷脂溶液在此處的吸收較低. EGCG磷脂復(fù)合物的吸收值與EGCG溶液比較有降低，分析原因與磷脂包裹、吸附、偶聯(lián)等方式致使EGCG與磷脂的極性部分發(fā)生較強(qiáng)的相互作用有關(guān)[8].

圖1 EGCG、卵磷脂、EGCG磷脂復(fù)合物的紫外掃描圖譜Fig.1 The UV spectra of EGCG, phospholipid and EGCG-phospholipid complex

2.2 差式掃描熱量分析

固體活性成分的無定型狀態(tài)是活性分子排列的無序狀態(tài)，這種狀態(tài)可能增加活性物質(zhì)的生物利用度，促進(jìn)活性分子的快速吸收[8,13]. 通過差式掃描熱量分析考察磷脂復(fù)合物中EGCG晶型的變化. DSC結(jié)果顯示(圖2)：卵磷脂和EGCG均存在單一的熔點(diǎn)峰；在EGCG與卵磷脂的物理混合物中，EGCG和磷脂的熔點(diǎn)峰均存在，只是受物理混合的影響峰位置有所偏移；在EGCG磷脂復(fù)合物中，EGCG的熔點(diǎn)峰完全消失，表明EGCG的晶型和狀態(tài)受到影響發(fā)生了變化，即 EGCG分子中的極性基團(tuán)與卵磷脂分子中的極性基團(tuán)發(fā)生了相互作用，進(jìn)而改變了EGCG的相變溫度，特征吸收峰也隨之發(fā)生了變化. EGCG在卵磷脂的脂肪酸鏈的包裹下，形成了新物相即EGCG磷脂復(fù)合物[13, 15].

圖2 EGCG、磷脂、物理混合物和EGCG磷脂復(fù)合物的DSC圖譜Fig.2 DSC thermograms of EGCG , phospholipids, physical mixture of EGCG and phospholipid and EGCG-phospholipid complex

2.3 納米囊泡處方篩選及形貌表征

通過處方篩選發(fā)現(xiàn)隨著EGCG含量增加，所得EGCG納米囊泡的粒徑以及PDI也隨之增長，樣品穩(wěn)定性變差. 根據(jù)表1數(shù)據(jù)優(yōu)選處方3所制備的EGCG納米囊泡，粒徑為119.36 nm，PDI為0.098，穩(wěn)定性較好. 選擇該樣品進(jìn)行形貌表征，采用透射電鏡觀察所制得EGCG納米囊泡成均一球狀，粒徑在100 nm左右，與粒度儀測定結(jié)果一致，分散良好，無聚集(圖3).

圖3 EGCG納米囊泡的透射電鏡圖Fig.3 TEM image of EGCG nanovesicles

2.4 穩(wěn)定性考察

通過相隔固定時間監(jiān)測EGCG磷脂納米囊泡的粒徑變化，其結(jié)果如圖4所示，在連續(xù)14 d內(nèi)其粒徑基本無變化，說明EGCG納米囊泡能夠保持良好的穩(wěn)定性. 根據(jù)1.7方法，測得EGCG含量與吸光度在1 μg/mL到20 μg/mL 范圍內(nèi)線性良好，得到線性回歸方程為A=0.01119×C+0.00335，R2=0.9996.在穩(wěn)定性考察中樣品初始包封率為(81.24±0.18)%，2周后包封率略微下降至(77.16±0.34)%，說明EGCG納米囊泡整體穩(wěn)定性良好.

圖4 EGCG磷脂復(fù)合物納米囊泡的粒徑變化Fig.4 Particle size changes of EGCG phospholipidcomplex nanovesicles

2.5 抑菌實(shí)驗(yàn)分析

采用牛津杯法評價(jià)EGCG納米囊泡的抗齲齒效果. 根據(jù)圖5所示，PBS組以及空白納米囊泡組均未產(chǎn)生明顯抑菌圈，而EGCG溶液的抑菌圈直徑為(17.3±0.71) mm，說明了EGCG本身對于變異鏈球菌具有良好的抑制作用. 同時，EGCG納米囊泡溶液的抑菌圈直徑達(dá)到(19.2±0.40) mm，與EGCG溶液比較，抗齲齒效果顯著性提高(P<0.01)，可能是由于EGGC在模擬生理下因穩(wěn)定性問題隨時間產(chǎn)生一定的降解，導(dǎo)致了抗菌活性的下降[16]. 采用EGCG磷脂復(fù)合物制備納米囊泡進(jìn)行負(fù)載保護(hù)，提高了其生理環(huán)境中的穩(wěn)定性，從而獲得更好的抑菌效果.

圖5 抑菌圈直徑Fig.5 Diameter of inhibition zone

3 結(jié)語

通過將EGCG與卵磷脂制備為磷脂復(fù)合物增強(qiáng)其穩(wěn)定性與脂溶性，增強(qiáng)跨生物膜的活性成分吸收. 采用簡單、易操作的乙醇注入法，將磷脂復(fù)合物制備為納米囊泡，增強(qiáng)其在口腔的粘附性及跨生物膜能力. EGCG磷脂復(fù)合物的紫外光譜、差式掃描熱量圖驗(yàn)證了EGCG磷脂復(fù)合物的形成；通過單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，探索合適的藥脂比，優(yōu)選EGCG與卵磷脂的質(zhì)量比為1∶10，所得EGCG納米囊泡的粒徑為119.36 nm，粒徑分散均勻，包封率較高[(81.24±0.18)%].根據(jù)抗變異鏈球菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EGCG納米囊泡的抑菌圈可達(dá)到(19.2±0.40) mm，顯著高于EGCG溶液，說明了EGCG納米囊泡抑菌效果良好，在預(yù)防青少年齲齒方面具有一定應(yīng)用前景.