陳桂平，付戴波，鐘志勇，劉蘭平，涂群，許翔，楊珍

（1.江西省養(yǎng)蜂研究所，江西南昌 330200；2.九江市畜牧獸醫(yī)局；3.江西省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心；4.南康區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局）

黃芩、黃連、金銀花、蒲公英都是清熱解毒的常用中藥，來源廣泛，價格低廉，但目前它們用于蜜蜂疾病防治方面的研究未見報道。

在前期研究中發(fā)現(xiàn)黃芩、黃連、金銀花、蒲公英4種單味藥材對蜂房球菌表現(xiàn)出一定的抑菌作用，為增強它們的抑菌效果，需對4味藥材進行組方研究，篩選出最優(yōu)組方，為后續(xù)開發(fā)新藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試藥材。黃芩、黃連、金銀花、蒲公英均由江西某生物工程公司提供，藥材經(jīng)檢定，均符合生藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基由蛋白胨1g、半胱氨酸0.02g、葡萄糖0.5g、果糖0.5g、可溶性淀粉1g組成，加純化水至100mL（用1mol/L KH2PO4調(diào)pH至6.6）；固體培養(yǎng)基由液體培養(yǎng)基加瓊脂2g組成，制法一致。

1.1.3 菌株。蜜蜂蜂房球菌（編號：181006），購于中國獸藥監(jiān)察所。

1.2 方法

1.2.1 中藥提取物的制備。水提取法[1]：分別稱取黃芩、黃連、金銀花、蒲公英各100g，加入蒸餾水至500 mL，浸泡30min，沸騰后用文火煎煮45min，用4層紗布過濾，藥渣加500mL蒸餾水再煎煮30min。合并3次濾液，減壓濃縮成膏狀，低溫干燥后，得提取物，計算得膏率，滅菌備用。臨用前，準(zhǔn)確稱取提取物加無菌蒸餾水配成生藥含量為2g/mL的藥液。醇提法[2]：將黃芩、黃連、金銀花、蒲公英粉碎成粗粉（過40目篩），各稱取粉末100g，用70%的乙醇400 mL浸泡3次，第1次浸泡30h，第2、3次各浸泡15h，過濾，合并3次濾液，減壓濃縮至膏狀，低溫干燥后，得提取物，計算得膏率，滅菌備用。臨用前，準(zhǔn)確稱取提取物加無菌蒸餾水配成生藥含量為2g/mL的藥液。

1.2.2 菌液的制備。將菌種復(fù)蘇后，接種至液體培養(yǎng)基，在加10%CO2的厭氧條件下，35℃培養(yǎng)24h～48h。測定菌數(shù)后，用無菌生理鹽水稀釋成菌懸液，使活菌數(shù)相當(dāng)于2×108CFU/mL，備用。

1.2.3 抑菌直徑測定。參照NCCLS紙片擴散法[3],取瓊脂固體培養(yǎng)基26mL倒入滅菌平皿內(nèi)，凝結(jié)后加入0.2mL菌液涂布均勻。取經(jīng)滅菌的標(biāo)準(zhǔn)濾紙片，每張滴加藥液20μL后貼于平板表面，設(shè)置兩個平行一個空白，于加10%CO2的厭氧條件35℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果，測量抑菌圈直徑（mm）。抑菌圈直徑大于或等于8mm為高度敏感、6～8mm為中度敏感、6mm以下為耐藥或不敏。每種藥材做3次重復(fù)。

1.2.4 最低抑菌濃度（MIC）的測定。參照NCCLS稀釋法[4]，取滅菌具塞試管13支，除第1管加入1.6mL液體培養(yǎng)基外，其余每管加入液體培養(yǎng)基1.0mL，在第1管加入受試藥液原液0.4mL混勻，然后吸取1.0mL至第2管，混勻后再吸取1.0mL至第3管，如此倍比稀釋至第11管，并從第11管中吸取1.0mL棄去，第12管為不加藥液的細菌生長管（陽性對照），第13管加藥液1.0mL,混勻后棄去1.0mL，作為藥液陰性對照；取細菌稀釋液0.1mL，分別加入上述1～12管中混勻，13號管加0.1mL滅菌生理鹽水，然后各管置于加10%CO2的厭氧條件35℃培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。若培養(yǎng)基混濁，表示有細菌生長，若培養(yǎng)基完全清亮，表示無細菌生長。以抑制試驗菌生長的最高稀釋度為MIC（最低抑菌濃度）。

1.3 組方篩選

通過采用正交試驗來評價不同提取物組方對蜂房球菌的抑菌效果，篩選出最優(yōu)組方[5～6]。采用L9(34)正交表進行試驗，將紙片法測定的抑菌效果好的提取物作為評價因素，設(shè)置以提取物1、2、3倍MIC為水平，各因素和水平見表1。

表1 不同提取物L(fēng)9(34)正交試驗因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取物的抑菌敏感性

分別采用水提法和醇提法提取黃芩、黃連、金銀花、蒲公英，獲得8種不同提取物。由表2結(jié)果可知，8種不同提取物中，黃連醇提物和蒲公英水提物對蜂房球菌的敏感性較差，其他6種提取物均表現(xiàn)出一定的抑菌效果，以黃芩水提物的抑菌力為最強（D＞13mm），8種不同提取物抑菌力由大到小為：黃芩水提物＞金銀花醇提物＞黃芩醇提物＞黃連水提物＞蒲公英醇提物＞金銀花水提物＞黃連醇提物＞蒲公英水提物；黃芩水提物和醇提物、黃連水提物、金銀花醇提物為高度敏感，金銀花水提物和蒲公英醇提物為中度敏感，黃連醇提物、蒲公英水提物為耐藥或不敏感；黃芩和黃連水提物抑菌性＞醇提物、金銀花和蒲公英醇提物抑菌性＞水提物。

表2 不同提取物的抑菌敏感性 mm

2.2 不同提取物的最低抑菌濃度

采用二倍稀釋法分別測定8種不同提取物的最低抑菌濃度（MIC），從表3結(jié)果可知，8種不同提取物中，黃芩水提物的最低抑菌濃度為1.56mg/mL，蒲公英水提物的最低抑菌濃度超過400mg/mL，8種不同提取物抑菌力基本與紙片法測定結(jié)果一致，抑菌力由大到小為：黃芩水提物＞金銀花醇提物＞黃芩醇提物＞黃連水提物＞蒲公英醇提物＞金銀花水提物＞黃連醇提物＞蒲公英水提物。

表3 不同提取物的最低抑菌濃度 mg/mL

2.3 組方篩選結(jié)果

通過L9(34)正交試驗表安排4因素3水平試驗對不同提取物組合進行優(yōu)化。由表4結(jié)果可知，對蜂房球菌抑菌效果影響因素的排序為A＞D＞B＞C，因素A和D在復(fù)方中對蜂房球菌的抑制作用起著主要作用。綜合考慮各因素水平，確定抑制蜂房球菌的最優(yōu)組方為：A3B2C1D1。

表4 不同提取物L(fēng) 9(34)正交試驗結(jié)果 mg/mL、mm

3 討論

在8種不同提取物中，黃芩水提物抑菌力最強，抑菌圈直徑超過13mm，抑菌力由大到小是黃芩水提物＞金銀花醇提物＞黃芩醇提物＞黃連水提物＞蒲公英醇提物＞金銀花水提物＞黃連醇提物＞蒲公英水提物；確定的最優(yōu)組方是由黃芩水提物、黃連水提物、蒲公英醇提物、金銀花醇提物按4.68:12.5∶3.125∶3.125比例組成。

同一種藥材，提取方法不同，抑菌效果有明顯差異，如對同一種病原菌，黃芩和黃連水提物抑菌性＞醇提物、金銀花和蒲公英醇提物抑菌性＞水提物。差異產(chǎn)生的原因主要在于不同提取工藝，提取出的主要成分不同。水提法有利于水溶性成分的釋放，醇提法有利于脂溶性成分的釋放。在制劑生產(chǎn)時，必須充分考慮到這種提取工藝帶來的差異。