劉 鈺, 惲丹玉, 姚小燕, 夏婷婷

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第904醫(yī)院常州醫(yī)療區(qū), 1. 內(nèi)科, 2. 特診科, 江蘇 常州, 213000; 3. 蘇州大學附屬第一醫(yī)院 消化內(nèi)科, 江蘇 蘇州, 215000)

據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)數(shù)據(jù)[1]顯示，胃癌的發(fā)病率居所有惡性腫瘤第5位，死亡率居第4位，其發(fā)病率和死亡率均居消化道惡性腫瘤首位。胃癌的早期臨床篩查仍有一定局限性，主要是腫瘤早期無明顯的臨床癥狀和體征，患者不易察覺，多因胃部疼痛、進食不佳等就診，確診時30%～75%患者明確診斷為腫瘤中晚期，不能進行一期手術(shù)根治, 5年總生存率低于65%[1]。隨著消化內(nèi)鏡在胃癌和食管癌的早期篩查和治療中的應用和發(fā)展，早期胃癌和食管癌的檢出率和根治率明顯提高，也顯著改善了患者的臨床預后[2]。消化內(nèi)鏡是應用最早和最廣泛的微創(chuàng)內(nèi)鏡技術(shù)，不僅可以用于疾病的早期檢查，還可在內(nèi)鏡下實時切除腫瘤組織，具有創(chuàng)傷小、出血少、切除視野可實時放大、并發(fā)癥少、恢復快等優(yōu)點[3]。腫瘤的發(fā)生與基因突變和特異性蛋白的表達密切相關(guān)，細胞骨架對于維持細胞形態(tài)和功能具有重要意義。微絲和中間絲是形成細胞骨架的基本蛋白，微絲主要由成束蛋白1(FSCN1)構(gòu)成，中間絲多由角蛋白14(KRT14)組成[4-5]。研究[6]證實，細胞骨架改變直接參與腫瘤的發(fā)生和進展, FSCN1和KRT14蛋白在胃癌和食管癌中表達上調(diào)，與臨床預后不佳有關(guān)。T1期胃癌包括原位癌，有0.5%～3.5%的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率，早期胃癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移往往預示更高的惡性程度，決定了不同的手術(shù)方式和臨床預后[7]。因此，準確評估T1期胃癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對評估疾病切除風險有極為重要的價值。本研究探討消化內(nèi)鏡檢測組織FSCN1、KRT14定性和定量表達與T1期胃癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年10月—2020年10月在本院確診T1期的胃癌患者。納入標準: ① 年齡18～75歲者; ② 經(jīng)手術(shù)切除病理或腹部增強CT證實胃癌者，TNM分期為T1期; ③ 完整切除腫瘤病灶和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)者; ④ 患者和家屬對研究知情同意，患者信息無丟失。排除標準: ①非T1期胃癌者，其他部位原發(fā)惡性腫瘤，如肺癌; ② 嚴重消化性潰瘍、嚴重肝硬化者; ③ 嚴重心、肺、腎功能障礙者; ④ 既往接受放化療者。共納入120例患者，其中伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例為觀察組，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移70例為對照組。觀察組男、女分別為28、22例，年齡43～75歲，平均(56.8±7.4)歲; 組織分化級別為低分化22例，中高分化28例。對照組男、女分別為36、34例，年齡40～72歲，平均(56.6±7.5)歲; 低分化32例，中高分化38例。2組患者的性別、年齡和組織分化級別比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2 研究方法

所有患者由同一手術(shù)和護理團隊進行治療，完善術(shù)前檢查，包括心電圖、血常規(guī)、傳染病、肝腎功能、腹部CT和超聲等，主要根據(jù)CT平掃和增強掃描圖像特征確定腫瘤位置、大小、最佳手術(shù)切除方案以及評估手術(shù)可能存在的風險等。結(jié)合術(shù)中內(nèi)鏡下實時觀察腫瘤分布特征，合理選擇微創(chuàng)術(shù)式，包括內(nèi)鏡下黏膜切除術(shù)(EMR)或內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)(ESD), 術(shù)中冰凍證實切緣均為陰性。

主要手術(shù)步驟: 術(shù)前腸道準備完善后置入內(nèi)鏡，全面評估腫瘤的位置、直徑、浸潤深度等，進行實時臨床分期，并與術(shù)前分期進行對照; 確定病變后，根據(jù)手術(shù)標準流程進行黏膜下注射抬舉病灶，染色區(qū)分病灶并進行電凝標記，采用多點注射法直至病灶明顯隆起。根據(jù)病灶大小和浸潤特征采用透明帽法、套扎器法或聯(lián)合應用，從活檢孔道伸入一次性圈套器，完全套入圈套器內(nèi)，接通電源圈套切除。針對不能一次整塊切除的較大直徑病灶，采用ESD法，即切開病灶周圍黏膜，剝離病變，針對剝離困難者分塊進行，及時電凝止血，情況嚴重者及時終止手術(shù)。切除病灶后使用電熱止血鉗對血管進行凝固止血，必要時使用金屬夾將創(chuàng)面縫合。病變組織送快速冰凍行病理確診，證實腫瘤完全切除，切緣陰性后退出內(nèi)鏡。術(shù)后常規(guī)抗感染、補液、止血等，排氣后進食。若術(shù)中出現(xiàn)穿孔或需要金屬縫合創(chuàng)面的患者，可以適當延遲進食時間。

1.3 免疫組化染色

采用免疫組化染色檢測組織FSCN1和KRT14陽性表達，分析FSCN1和KRT14陽性表達與患者性別、年齡和組織分化級別的關(guān)系。主要步驟: ① 制作切片，厚度5 μm, 并進行前期常規(guī)處理，保證成功率; ② 染色，依次滴加小鼠抗人FSCN1和KRT14一抗(江蘇碧云天科技有限公司提供，稀釋比例為1∶2 000, 產(chǎn)品批號為20200216), 于濕盒內(nèi) 4 ℃孵育過夜; 滴加兔抗小鼠二抗(江蘇碧云天科技有限公司提供，稀釋比例為1∶500, 產(chǎn)品批號為20201546), 于濕盒中27 ℃孵育 20 min; ③ 觀察，滴加DAB顯色劑于濕盒中27 ℃孵育 20 min, 光學顯微鏡下觀察; ④ 半定量法計算，染色強度(-)、(+)、()、()分別賦值0～3分，陽性細胞率≤5%計0分, >5%～25%計1分, >25%～50%計2分, >50%～75%計3分, >75%計4分，兩項乘積0～3分為陰性, 4～12分為陽性。

1.4 Western-blot法

Western-blot法檢測組織FSCN1和KRT14相對表達量。主要步驟: 加入蛋白裂解液于離心機中, 2 000 轉(zhuǎn)/min離心20 min, 取上清，根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒(美國Sigma公司提供)測定; 配置4%上層膠和10%下層膠，將蛋白樣本與上樣緩沖液進行高溫變性; 依次滴加兔抗人FSCN1、KRT14和內(nèi)參蛋白GAPDH一抗(美國Sigma公司提供，稀釋比例為1∶1 500, 產(chǎn)品批號為20204528)過夜孵育，然后滴加羊抗兔對應二抗(美國Sigma公司提供，稀釋比例為1∶500, 產(chǎn)品批號為20203312)常溫孵育4 h; ECL顯色。掃描條帶灰度值計算蛋白相對表達量。采用SPSS 20.0軟件進行t或χ2檢驗; 取雙側(cè)α=0.05, 以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 FSCN1和KRT14蛋白陽性表達率

根據(jù)免疫組化染色結(jié)果計算發(fā)現(xiàn)，觀察組腫瘤組織FSCN1和KRT14蛋白的陽性表達率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 FSCN1和KRT14蛋白陽性表達率[n(%)]

A: FSCN1表達陽性;

B: FSCN1表達陰性;

C: KRT14表達陽性;

D: KRT14表達陰性。

2.2 FSCN1和KRT14蛋白表達量

根據(jù)Western blot法定量檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組腫瘤組織FSCN1和KRT14蛋白的相對表達量高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 FSCN1和KRT14蛋白表達量

2.3 FSCN1和KRT14蛋白與臨床特征的關(guān)系

FSCN1和KRT14表達與性別和年齡無關(guān)，但與腫瘤的分化級別顯著相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 FSCN1和KRT14蛋白與臨床特征的關(guān)系[n(%)]

3 討 論

EMR、ESD和黏膜下隧道切除術(shù)(STD)是目前臨床治療早期胃癌和食管癌的常用微創(chuàng)術(shù)式，利用鏡像放大手術(shù)野、提高操作精細度，可避免開胸手術(shù)引起的腹壁損傷，提高手術(shù)安全性[8-9]。EMR借助內(nèi)鏡放大和染色技術(shù)，可同時完成胃癌病灶活檢，實現(xiàn)早期診斷和治療，具有創(chuàng)傷小、并發(fā)癥少、恢復快、病變完全切除率高等優(yōu)點。針對腫瘤直徑>20 mm而不易一次性整塊切除的病灶，可聯(lián)合ESD實現(xiàn)分塊切除[10]。

消化內(nèi)鏡下可同時完成腫瘤的早期篩查和治療，明顯提高了早期胃癌的檢出率。T1期胃癌仍有一定的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率，預示腫瘤的惡性程度較高，可能需要擴大手術(shù)切除范圍[11]。目前臨床上關(guān)于早期胃癌的標準術(shù)式以及臨床預后尚無統(tǒng)一意見。有研究[12]提示，胃癌根治術(shù)結(jié)合化療是標準方案，即使早期胃癌無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，仍主張采用腹腔鏡減輕手術(shù)創(chuàng)傷，促進術(shù)后快速康復。也有研究[13]認為，有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對臨床預后影響不大。因此，早期通過消化內(nèi)鏡準確預測T1期胃癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對確定恰當?shù)氖中g(shù)切除范圍和評估預后風險具有重要意義。

本研究結(jié)果顯示，觀察組腫瘤組織FSCN1和KRT14陽性表達率和表達量均高于對照組, FSCN1和KRT14表達僅與腫瘤的分化級別有關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 提示組織FSCN1和KRT14表達上調(diào)可能參與了胃癌的早期發(fā)生和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，分化級別越低提示腫瘤惡性程度越高，組織FSCN1和KRT14的表達水平越高。研究[14-15]證實, FSCN1過表達可導致細胞膜突起及細胞運動，與腫瘤發(fā)生相關(guān)，在結(jié)腸癌、肝癌、肺癌等惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)FSCN1高表達，推測與晚期腫瘤的病灶轉(zhuǎn)移相關(guān)，是預后不良的重要標志。對食管鱗癌組織中FSCN1的表達研究[16]發(fā)現(xiàn)，免疫組化染色陽性顯著強于正常食管上皮組織，隨著染色強度、陽性細胞比率增高，食管癌預后不佳。細胞角蛋白屬于中間絲蛋白家族，多表達于上皮細胞中，包括KRT1～20, 是上皮性腫瘤的標志物[17-18]。KRT14在任何來源的鱗癌中均有表達，是鱗癌診斷的重要標志物[19]。

綜上所述, FSCN1和KRT14可能參與了早期胃癌的發(fā)生和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，消化內(nèi)鏡可同時進行疾病早期診斷和根治性切除，評估淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風險。本研究針對T1期胃癌患者采用微創(chuàng)內(nèi)鏡下治療，并檢測腫瘤組織FSCN1和KRT14蛋白定性和定量表達，對預測早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有較好的價值。本研究無法直接說明組織FSCN1和KRT14蛋白表達異常與生存預后的關(guān)系，也無法得出組織FSCN1和KRT14蛋白表達水平診斷早期胃癌和評估預后的準確性，仍需要進一步的研究論證。