程玉婷

（廣東省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，廣東 廣州 510000）

豬丹毒病是一種在世界范圍內(nèi)均有發(fā)生且對養(yǎng)豬業(yè)有重要影響的疾病。豬丹毒病由豬丹毒絲菌引起。豬丹毒絲菌是一種革蘭氏陽性菌、菌體平直或稍彎曲的纖細小桿菌、兼性厭氧、耐酸、無芽孢[1]。豬丹毒絲菌一般感染豬，但同時也可以感染綿羊、火雞和人。豬丹毒絲菌感染人時，可以引起心內(nèi)膜炎癥、敗血癥[2]。豬丹毒絲菌作為一種條件致病菌，多達10%～50%的健康豬扁桃體中攜帶該菌，并且在健康豬及病豬的唾液、糞便中均可以分離到該病原體，該病最常見的感染途徑是通過攝入受污染的食物或水及皮膚傷口感染，3月齡到3歲豬均易感。豬丹毒菌感染的臨床癥狀有3種：急性、亞急性和慢性[3]。急性型又稱敗血型，發(fā)病豬只呈急性經(jīng)過，體溫突然升至42～43 ℃，食欲不振，糞便干結(jié)，后期下痢。病程急，死亡率高。亞急性型也稱疹塊型，豬只耳后、頸部、胸腹側(cè)等部位會有紅色形狀的不規(guī)則斑塊出現(xiàn)，界限明顯、觸之有熱感，指壓而褪色，俗稱“打火印”。而慢性型一般表現(xiàn)為慢性關節(jié)炎、慢性心內(nèi)膜炎和皮膚壞死等癥狀[4]。豬丹毒病一年四季均可以發(fā)病，但以潮濕、炎熱多雨的季節(jié)多發(fā)[5]。

1 材料與方法

1.1 病料

病料來自廣東省潮州市某大型豬場，采取新鮮病死豬的肝、脾等臟器進行病原菌分離鑒定。

1.2 細菌培養(yǎng)基和相關試劑

胰酶大豆瓊脂（TSA）和胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

新生牛血清購自蘭州民海生物工程有限公司，使用前56 ℃滅活30 min，保存于-20 ℃。

革蘭氏染色液采購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

引物序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3 引物合成設計

實驗中所用到的引物（見表1）。

表1 實驗中所用到的引物

1.4 豬丹毒絲菌的分離與鑒定

1）以燒紅的無菌剪刀燙烙病例臟器表面，用接種環(huán)自燙烙的部位插入組織中，在無菌的加入5%新生牛血清的TSA平板上涂拭，在超凈工作臺內(nèi)對平板進行劃線，目的是可以得到單菌落；

2）將劃線稀釋的平板置于生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h；

3）在平板上挑選單菌落，轉(zhuǎn)到新鮮的TSA平板（添加5%新生牛血清）上繼續(xù)劃線培養(yǎng)18～24 h進行純化；

4）革蘭氏染色鑒定；

5）16S rRNR PCR鑒定

PCR反應、條件體系如下：

TaKaRa Ex Taq（5 units/μL）0.25 μL

10×Ex Taq Buffer（Mg2+free）2 μL

dNTP Mixture（2.5 mM each）2 μL

25 mM MgCl21.5 μL

16SrRNA-F、16SrRNA-R各1.5 μL

dd H2O up to 25 μL

反應總體系為25μL，模板為挑選的3-5個單菌落。PCR反應條件為

1.5 藥物敏感性的測定

藥敏實驗采用Kirby-Baner（K-B）紙片擴散法，檢測分離得到的菌株對抗菌藥物的敏感性。

1）將復蘇好的菌株進行劃線培養(yǎng)，放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h；

2）取無菌棉簽蘸取平板上3～5個菌落，于3 mL生理鹽水中進行稀釋，調(diào)節(jié)菌液濃度至0.5麥氏比濁濃度；

3）另取一無菌棉簽伸入細菌瓶中，待無菌棉簽浸潤后，在細菌瓶管壁上擠壓掉多余的水分，用棉簽涂布TSA平板。為使平板上菌落分布均勻，應涂布完平板后將平板轉(zhuǎn)動60°，再次進行涂布，依次重復6次；

4）用鑷子夾取藥敏紙片，使藥敏紙片平貼于涂滿菌液的培養(yǎng)基表面，所有藥敏紙片應當在15 min內(nèi)貼到培養(yǎng)基上；

5）將平板翻轉(zhuǎn)，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)20～24 h后，將平板從恒溫培養(yǎng)箱中拿出，依據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）判定標準進行耐藥性的判定。

2 結(jié)果

2.1 革蘭氏染色結(jié)果

從病變組織中分離培養(yǎng)細菌后，制成細菌涂片，經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢，可觀察到該菌為纖細的小桿菌，成對或呈長絲狀。鏡檢結(jié)果見圖1。

圖1 革蘭氏染色鏡檢圖

2.2 16SrRNR PCR鑒定結(jié)果

從經(jīng)純化的培養(yǎng)物中挑取3～5個菌落，通過PCR擴增后，經(jīng)電泳檢驗，出現(xiàn)特異性條帶，目的條帶大小為472 bp，結(jié)果見圖2。

圖2 PCR鑒定結(jié)果

2.3 藥物敏感性的測定

藥物敏感性的測定結(jié)果（見表2）。藥敏測定結(jié)果顯示，該豬丹毒絲菌對阿莫西林、青霉素、氟苯尼考敏感，對多西環(huán)素中度敏感，對恩諾沙星、替米考星、四環(huán)素不敏感。

表2 藥敏測定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

1）以上結(jié)果符合豬丹毒絲菌的相應特性，確診為感染豬丹毒絲菌。

2）本株豬丹毒絲菌能引起豬的全身性敗血性死亡，說明毒力較強。經(jīng)了解，該豬場發(fā)病豬群發(fā)病時間為5月份，這段時間天氣出現(xiàn)連續(xù)性降雨，豬舍糞便清理不夠徹底，環(huán)境相對較差，這可能誘發(fā)了本次豬群的病因。

3）針對該次豬丹毒絲菌發(fā)病，可以選擇性采用阿莫西林、青霉素、氟苯尼考結(jié)合實際予以治療。

4）豬丹毒絲菌病不常發(fā)，但一旦發(fā)病，病程急，病程短，豬場養(yǎng)殖者往往措手不及，養(yǎng)殖者應加強防范。