潘波 劉麗娟 陳玉雙 鄭玉林

摘 要 目的：建立替硝唑原料藥中雜質(zhì)亞硝酸根的測(cè)定方法。方法：采用離子色譜法測(cè)定，Dionex IonPac AS19，3.5 mm×250 mm色譜柱，KOH溶液梯度洗脫。結(jié)果：亞硝酸根與替硝唑可達(dá)到基線分離。亞硝酸根在0.025～1.000 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢測(cè)限（LOD）為0.010 mg/ml，定量限（LOQ）為0.025 mg/ml。結(jié)論：該法操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以用于替硝唑原料藥中基因毒性雜質(zhì)亞硝酸根的測(cè)定。

關(guān)鍵詞 替硝唑 亞硝酸根 離子色譜法

中圖分類號(hào)：R978.19； R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2021）11-0078-03

Determination of impurity nitrite in tinidazole by ion chromatography

PAN Bo1*， LIU Lijuan2， CHEN Yushuang2， ZHENG Yulin2**

（1. Shanghai Sinopharm Holding Co.， Ltd.， Shanghai 200023， China； 2. Shanghai Fenglin Biological Technology Co.， Ltd.， Shanghai 201210， China）

ABSTRACT Objective： To establish a method for the determination of nitrite in tinidazole bulk drug. Methods： The ion chromatography （IC） was carried out on a Dionex IonPac AS19 column with KOH solution as gradient elution. Results： Nitrite could be completely separated from tinidazole and its stranded curve showed good linearization over the range of 0.025-1.000 mg/ml with detection limit 0.010 mg/ml and quantitation limit 0.025 mg/ml. Conclusion： This method is simple， reproducible and accurate and can be used for the determination of nitrite in tinidazole bulk drug.

KEy WORDS tinidazole； nitrite； ion chromatography

基因毒性雜質(zhì)或遺傳毒性雜質(zhì)（genotoxic impurity，GTI）可直接或間接損傷細(xì)胞中的DNA，誘發(fā)基因突變，具有致癌可能或者傾向。各國(guó)的法規(guī)機(jī)構(gòu)，如人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)（International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceutical for Human Use，ICH）[1]、美國(guó)衛(wèi)生與人類服務(wù)部 （U.S. Department of Health and Human Services，DHHS）[2]、歐洲藥品管理局（EMA）[3]等都對(duì)基因毒性雜質(zhì)進(jìn)行了明確要求，眾多制藥企業(yè)在新藥研發(fā)過(guò)程中也越來(lái)越關(guān)注基因毒性雜質(zhì)的控制和檢測(cè)。

替硝唑是一種硝基咪唑類抗菌藥，用于治療各種厭氧菌感染，如敗血癥、骨髓炎、腹腔感染、盆腔感染、肺支氣管感染、肺炎、鼻竇炎、皮膚蜂窩組織炎、牙周感染及術(shù)后傷口感染，也可作為結(jié)腸直腸手術(shù)、婦產(chǎn)科手術(shù)及口腔手術(shù)等的術(shù)前預(yù)防用藥及腸道外阿米巴病、陰道滴蟲(chóng)病、賈第蟲(chóng)病、加得納菌陰道炎等的治療[4-6]。替硝唑的合成過(guò)程中用到硝酸，因此在替硝唑原料藥生產(chǎn)貯存過(guò)程中有可能生成亞硝酸根，須嚴(yán)格控制其毒理學(xué)關(guān)注閾值 （threshold of toxicological concern，TTC）[1]。ICH發(fā)布基因毒性雜質(zhì)的最大攝取量為1.5 mg/d。

目前亞硝酸根的檢測(cè)方法通常有紫外分光光度法[7]，重氮偶聯(lián)反應(yīng)雙模式方法[8]，離子色譜法[9-10]等。這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，但大多不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，還會(huì)造成環(huán)境污染，如紫外分光光度法作為經(jīng)典方法需要鹽酸萘乙二胺衍生，會(huì)引入重金屬污染物鎘，對(duì)環(huán)境危害很大。重氮偶聯(lián)反應(yīng)雙模式方法，比色法專屬性差，會(huì)有離子干擾。離子色譜法[9]通過(guò)選擇高容量陰離子交換柱，增大進(jìn)樣體積，以檢測(cè)水中的亞硝酸鹽，但通過(guò)增大本底量，容易引入氯離子和其他離子干擾；而武倫瑋等[10]報(bào)道的離子色譜改進(jìn)方法，前處理復(fù)雜，需要加入乙酸鋅和亞鐵氰化鉀，會(huì)引入重金屬污染物。為了克服以上困難，本研究建立了簡(jiǎn)便準(zhǔn)確的離子色譜法，可準(zhǔn)確靈敏地測(cè)定原料藥中基因毒性雜質(zhì)亞硝酸根的含量。

1 材料和方法

1.1 儀器與試藥

AQ1200離子色譜儀、Dionex IonPac AS19色譜柱（3.5 mm×250 mm，4 μm）（賽默飛公司）。

原料藥（X制藥有限公司，含量99.9%、99.9%和100.1%，批號(hào)F-20190801、F-20190802和F-20190803）；國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品GSB 04-2839-2011、亞硝酸根單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 mg/ml），購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心網(wǎng)。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

1）工作標(biāo)準(zhǔn)液 精密移取亞硝酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 ml或0.1 ml置10 ml容量瓶中，加超純水至刻度，搖勻，配制成亞硝酸根質(zhì)量濃度為50 mg/ml或10 mg/ml的工作標(biāo)準(zhǔn)液1和2。

2）供試品溶液 精密稱量供試品0.25 g置于50 ml量瓶中，加入40 ml超純水，超聲（500 W，400 kHz）15 min并放冷至室溫，重復(fù)超聲操作5次后用超純水稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液（2.5 mg/ml）。

3）線性溶液 精密量取工作標(biāo)準(zhǔn)液，用超純水配制成質(zhì)量濃度分別為0.025、0.050、0.100、0.250、0.500、1.000 mg/ml的溶液，分別作為10%（定量限濃度）～ 400%限度水平檢測(cè)用對(duì)照品溶液。

4）準(zhǔn)確度溶液 精密稱定供試品0.25 g 3份，分別置50 ml量瓶中，加入0.20、0.25、0.30 ml工作標(biāo)準(zhǔn)液1溶液，加入40 ml超純水，超聲15 min并放冷至室溫，重復(fù)超聲操作5次，用超純水稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液分別作為80%、100%、120%限度水平檢測(cè)用準(zhǔn)確度溶液。

5）穩(wěn)定性溶液 精密稱定供試品0.25 g，置50 ml量瓶中，加入0.25 ml工作標(biāo)準(zhǔn)液1溶液，加入40 ml超純水，超聲15 min并放冷至室溫，重復(fù)超聲操作5次，用超純水稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，作為穩(wěn)定性檢測(cè)用溶液。

1.2.2 色譜條件

淋洗液：KOH溶液；梯度程序見(jiàn)表1。流速1.0 ml/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量25 μl。

2 結(jié)果

2.1 線性

以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，按最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=0.885 2x-0.006 5，相關(guān)系數(shù)r為0.999 9。結(jié)果表明，亞硝酸根在0.025～1.000 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，亞硝酸根檢測(cè)限（LOD）為0.010 mg/ml，定量限（LOQ）為0.025 mg/ml。

2.2 專屬性試驗(yàn)

色譜圖顯示，空白溶液中亞硝酸根出峰處無(wú)干擾；供試品溶液中亞硝酸根出峰處無(wú)雜質(zhì)干擾；0.250 mg/ml線性標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)6針進(jìn)樣，峰面積RSD為0.2%。系統(tǒng)適用性（峰面積RSD≤2.0%）和專屬性均符合要求。

2.3 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

按準(zhǔn)確度試驗(yàn)要求，對(duì)3個(gè)限度水平的準(zhǔn)確度溶液進(jìn)行離子色譜測(cè)定，計(jì)算得平均回收率（n=9）為97%，RSD為4.9%。符合回收率90%～110%、RSD<15%的要求。

2.4 精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)

按精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)要求，各制備6份供試品溶液進(jìn)行離子色譜測(cè)定，其中精密度和重復(fù)性測(cè)試的RSD分別為4.8%和5.2%，符合<15.0%的要求。工作標(biāo)準(zhǔn)液2（10 mg/ml）及穩(wěn)定性溶液于室溫放置8 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.5 樣品測(cè)定

從3批原料藥中取樣測(cè)定，計(jì)算得3批樣品中亞硝酸根檢出量分別為0.027、0.032 和0.036 mg/ml。

3 討論

亞硝酸根限度值：按亞硝酸鈉CPDB（潛在致癌物數(shù)據(jù)庫(kù)）毒性數(shù)據(jù)計(jì)算（TD50線性外推法）[9]，取大鼠的限度值167 mg/（kg·d），計(jì)算亞硝酸根限度，則替硝唑中亞硝酸根限度為55.68 mg/ml。按此標(biāo)準(zhǔn)判斷，所選用的原料中亞硝酸根檢出量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于限度。

本研究建立的方法與傳統(tǒng)的亞硝酸根測(cè)定方法（比色法、紫外分光光度法）比較，靈敏度更高，測(cè)試更準(zhǔn)確。與已報(bào)道的離子色譜法相比，前處理簡(jiǎn)單，環(huán)保，準(zhǔn)確度和靈敏度更適用于藥物中的基因毒性雜質(zhì)研究；本研究只對(duì)一種替硝唑的基因毒性雜質(zhì)進(jìn)行了研究，今后會(huì)根據(jù)合成路線，對(duì)多種基因毒性雜質(zhì)開(kāi)展研究。

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