潘波 劉麗娟 陳玉雙 鄭玉林

摘 要 目的：建立替硝唑原料藥中雜質(zhì)亞硝酸根的測定方法。方法：采用離子色譜法測定，Dionex IonPac AS19，3.5 mm×250 mm色譜柱，KOH溶液梯度洗脫。結果：亞硝酸根與替硝唑可達到基線分離。亞硝酸根在0.025～1.000 mg/ml范圍內(nèi)線性關系良好，檢測限（LOD）為0.010 mg/ml，定量限（LOQ）為0.025 mg/ml。結論：該法操作簡便，重現(xiàn)性好，結果準確可靠，可以用于替硝唑原料藥中基因毒性雜質(zhì)亞硝酸根的測定。

關鍵詞 替硝唑 亞硝酸根 離子色譜法

中圖分類號：R978.19； R917 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2021）11-0078-03

Determination of impurity nitrite in tinidazole by ion chromatography

PAN Bo1*， LIU Lijuan2， CHEN Yushuang2， ZHENG Yulin2**

（1. Shanghai Sinopharm Holding Co.， Ltd.， Shanghai 200023， China； 2. Shanghai Fenglin Biological Technology Co.， Ltd.， Shanghai 201210， China）

ABSTRACT Objective： To establish a method for the determination of nitrite in tinidazole bulk drug. Methods： The ion chromatography （IC） was carried out on a Dionex IonPac AS19 column with KOH solution as gradient elution. Results： Nitrite could be completely separated from tinidazole and its stranded curve showed good linearization over the range of 0.025-1.000 mg/ml with detection limit 0.010 mg/ml and quantitation limit 0.025 mg/ml. Conclusion： This method is simple， reproducible and accurate and can be used for the determination of nitrite in tinidazole bulk drug.

KEy WORDS tinidazole； nitrite； ion chromatography

基因毒性雜質(zhì)或遺傳毒性雜質(zhì)（genotoxic impurity，GTI）可直接或間接損傷細胞中的DNA，誘發(fā)基因突變，具有致癌可能或者傾向。各國的法規(guī)機構，如人用藥品注冊技術要求國際協(xié)調(diào)會（International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceutical for Human Use，ICH）[1]、美國衛(wèi)生與人類服務部 （U.S. Department of Health and Human Services，DHHS）[2]、歐洲藥品管理局（EMA）[3]等都對基因毒性雜質(zhì)進行了明確要求，眾多制藥企業(yè)在新藥研發(fā)過程中也越來越關注基因毒性雜質(zhì)的控制和檢測。

替硝唑是一種硝基咪唑類抗菌藥，用于治療各種厭氧菌感染，如敗血癥、骨髓炎、腹腔感染、盆腔感染、肺支氣管感染、肺炎、鼻竇炎、皮膚蜂窩組織炎、牙周感染及術后傷口感染，也可作為結腸直腸手術、婦產(chǎn)科手術及口腔手術等的術前預防用藥及腸道外阿米巴病、陰道滴蟲病、賈第蟲病、加得納菌陰道炎等的治療[4-6]。替硝唑的合成過程中用到硝酸，因此在替硝唑原料藥生產(chǎn)貯存過程中有可能生成亞硝酸根，須嚴格控制其毒理學關注閾值 （threshold of toxicological concern，TTC）[1]。ICH發(fā)布基因毒性雜質(zhì)的最大攝取量為1.5 mg/d。

目前亞硝酸根的檢測方法通常有紫外分光光度法[7]，重氮偶聯(lián)反應雙模式方法[8]，離子色譜法[9-10]等。這些方法各有優(yōu)缺點，但大多不僅費時費力，還會造成環(huán)境污染，如紫外分光光度法作為經(jīng)典方法需要鹽酸萘乙二胺衍生，會引入重金屬污染物鎘，對環(huán)境危害很大。重氮偶聯(lián)反應雙模式方法，比色法專屬性差，會有離子干擾。離子色譜法[9]通過選擇高容量陰離子交換柱，增大進樣體積，以檢測水中的亞硝酸鹽，但通過增大本底量，容易引入氯離子和其他離子干擾；而武倫瑋等[10]報道的離子色譜改進方法，前處理復雜，需要加入乙酸鋅和亞鐵氰化鉀，會引入重金屬污染物。為了克服以上困難，本研究建立了簡便準確的離子色譜法，可準確靈敏地測定原料藥中基因毒性雜質(zhì)亞硝酸根的含量。

1 材料和方法

1.1 儀器與試藥

AQ1200離子色譜儀、Dionex IonPac AS19色譜柱（3.5 mm×250 mm，4 μm）（賽默飛公司）。

原料藥（X制藥有限公司，含量99.9%、99.9%和100.1%，批號F-20190801、F-20190802和F-20190803）；國家標準樣品GSB 04-2839-2011、亞硝酸根單元素標準溶液（1 000 mg/ml），購自國家標準物質(zhì)中心網(wǎng)。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

1）工作標準液 精密移取亞硝酸根標準溶液0.5 ml或0.1 ml置10 ml容量瓶中，加超純水至刻度，搖勻，配制成亞硝酸根質(zhì)量濃度為50 mg/ml或10 mg/ml的工作標準液1和2。

2）供試品溶液 精密稱量供試品0.25 g置于50 ml量瓶中，加入40 ml超純水，超聲（500 W，400 kHz）15 min并放冷至室溫，重復超聲操作5次后用超純水稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液（2.5 mg/ml）。

3）線性溶液 精密量取工作標準液，用超純水配制成質(zhì)量濃度分別為0.025、0.050、0.100、0.250、0.500、1.000 mg/ml的溶液，分別作為10%（定量限濃度）～ 400%限度水平檢測用對照品溶液。

4）準確度溶液 精密稱定供試品0.25 g 3份，分別置50 ml量瓶中，加入0.20、0.25、0.30 ml工作標準液1溶液，加入40 ml超純水，超聲15 min并放冷至室溫，重復超聲操作5次，用超純水稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液分別作為80%、100%、120%限度水平檢測用準確度溶液。

5）穩(wěn)定性溶液 精密稱定供試品0.25 g，置50 ml量瓶中，加入0.25 ml工作標準液1溶液，加入40 ml超純水，超聲15 min并放冷至室溫，重復超聲操作5次，用超純水稀釋至刻度，搖勻，過濾，作為穩(wěn)定性檢測用溶液。

1.2.2 色譜條件

淋洗液：KOH溶液；梯度程序見表1。流速1.0 ml/min，柱溫30 ℃，進樣量25 μl。

2 結果

2.1 線性

以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，按最小二乘法進行線性回歸，得回歸方程為y=0.885 2x-0.006 5，相關系數(shù)r為0.999 9。結果表明，亞硝酸根在0.025～1.000 mg/ml范圍內(nèi)線性關系良好，亞硝酸根檢測限（LOD）為0.010 mg/ml，定量限（LOQ）為0.025 mg/ml。

2.2 專屬性試驗

色譜圖顯示，空白溶液中亞硝酸根出峰處無干擾；供試品溶液中亞硝酸根出峰處無雜質(zhì)干擾；0.250 mg/ml線性標準溶液連續(xù)6針進樣，峰面積RSD為0.2%。系統(tǒng)適用性（峰面積RSD≤2.0%）和專屬性均符合要求。

2.3 準確度試驗

按準確度試驗要求，對3個限度水平的準確度溶液進行離子色譜測定，計算得平均回收率（n=9）為97%，RSD為4.9%。符合回收率90%～110%、RSD<15%的要求。

2.4 精密度、重復性和穩(wěn)定性試驗

按精密度、重復性和穩(wěn)定性試驗要求，各制備6份供試品溶液進行離子色譜測定，其中精密度和重復性測試的RSD分別為4.8%和5.2%，符合<15.0%的要求。工作標準液2（10 mg/ml）及穩(wěn)定性溶液于室溫放置8 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.5 樣品測定

從3批原料藥中取樣測定，計算得3批樣品中亞硝酸根檢出量分別為0.027、0.032 和0.036 mg/ml。

3 討論

亞硝酸根限度值：按亞硝酸鈉CPDB（潛在致癌物數(shù)據(jù)庫）毒性數(shù)據(jù)計算（TD50線性外推法）[9]，取大鼠的限度值167 mg/（kg·d），計算亞硝酸根限度，則替硝唑中亞硝酸根限度為55.68 mg/ml。按此標準判斷，所選用的原料中亞硝酸根檢出量遠遠小于限度。

本研究建立的方法與傳統(tǒng)的亞硝酸根測定方法（比色法、紫外分光光度法）比較，靈敏度更高，測試更準確。與已報道的離子色譜法相比，前處理簡單，環(huán)保，準確度和靈敏度更適用于藥物中的基因毒性雜質(zhì)研究；本研究只對一種替硝唑的基因毒性雜質(zhì)進行了研究，今后會根據(jù)合成路線，對多種基因毒性雜質(zhì)開展研究。

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