王春生，智亞楠，陳利軍*，劉 銘，侯夢(mèng)圓

（1.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院農(nóng)學(xué)院，信陽(yáng) 464000；2.河南省豫南農(nóng)作物有害生物綠色防控院士工作站，信陽(yáng) 464000）

微生物的揮發(fā)性有機(jī)物（volatile organic compounds，VOCs）又稱微生物的揮發(fā)性物質(zhì)，是微生物代謝過(guò)程中產(chǎn)生的小分子化合物（＜300 Da），具有低極性和高蒸汽壓的特性[1]，能夠在空氣、土壤空隙中高效率的擴(kuò)散，是理想的信息化學(xué)物質(zhì)[2,3]。一些微生物揮發(fā)性物質(zhì)可以抑制植物病原微生物的生長(zhǎng)、繁殖[4,5]，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)和提高植物抗病性[6,7]，同時(shí)具有低毒、環(huán)保等特點(diǎn)，使其可以作為倉(cāng)儲(chǔ)、設(shè)施農(nóng)業(yè)、土壤等的熏蒸劑防控植物病害[8]。相對(duì)于植物，微生物具有繁殖快、生長(zhǎng)周期短、易培養(yǎng)、易改良、適應(yīng)性強(qiáng)、不受季節(jié)限制等優(yōu)點(diǎn)[9]。因此，微生物的揮發(fā)性物質(zhì)作為生物熏蒸劑在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域符合可持續(xù)發(fā)展策略，具有廣闊的發(fā)展前景，有替代傳統(tǒng)化學(xué)熏蒸劑的巨大潛力。

真菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)在植物病害防治中具有重要發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用價(jià)值而受到國(guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注[7,10-12]。在10萬(wàn)多種已描述的真菌中，已進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)研究的約100種，從這些真菌中鑒定超過(guò)300種揮發(fā)性物質(zhì)，主要有萜烯類、芳烴類、酯類、雜環(huán)、酸類、醇類、醛類、酮類、硫醇類等化合物[7,13]。頂空固相微萃取技術(shù)（HS?SPME）是一種集萃取、濃縮、解吸于一體的揮發(fā)性物質(zhì)樣品前處理技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、無(wú)需有機(jī)溶劑、樣品用量少、活體取樣、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，與氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC?MS）聯(lián)用實(shí)現(xiàn)對(duì)收集到的揮發(fā)性物質(zhì)的化學(xué)組分進(jìn)行分析和確定其相對(duì)含量，適合于多個(gè)領(lǐng)域測(cè)量樣品的前處理[14]，近年來(lái)在真菌揮發(fā)性物質(zhì)組分鑒定中得到了廣泛應(yīng)用[7,15,16]。

產(chǎn)香真菌GS?1為分離自構(gòu)樹(shù)枯枝的一株真菌，其有性型為叢赤殼Nectriacinnabarina，該菌株產(chǎn)生濃郁的香味，其揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)灰葡萄孢Botrytiscinerea、禾谷鐮刀菌Fusariumgraminearum、核盤(pán)菌Sclerotinia sclerotiorum等植物病原菌均有明顯的熏蒸抑制作用，初步光學(xué)顯微觀察發(fā)現(xiàn)其揮發(fā)性物質(zhì)可造成灰葡萄孢菌絲畸形、分支增多、原生質(zhì)外滲等，生測(cè)試驗(yàn)表明產(chǎn)香真菌GS?1揮發(fā)性物質(zhì)具有良好的植物病害生防潛能[10]。菌株GS?1對(duì)植物病原菌的熏蒸抑菌機(jī)制尚未深入研究，揮發(fā)性物質(zhì)化學(xué)組分及菌株生長(zhǎng)過(guò)程中揮發(fā)性物質(zhì)釋放量的動(dòng)態(tài)規(guī)律尚不清楚，這些因素均限制了菌株 GS?1的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。本研究擬在前期基礎(chǔ)上利用電鏡進(jìn)一步觀察GS?1菌株揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)灰葡萄孢的熏蒸抑菌作用，通過(guò)HS?SPME?GC?MS法分析GS?1菌株揮發(fā)性物質(zhì)的化學(xué)組分，進(jìn)而明確揮發(fā)性物質(zhì)釋放量的時(shí)間規(guī)律，以期為菌株GS?1揮發(fā)性物質(zhì)在植物病害防控中的合理開(kāi)發(fā)和高效利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

產(chǎn)香真菌叢赤殼GS?1分離自構(gòu)樹(shù)，植物病原真菌灰葡萄孢分離自番茄，由信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室保存。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖18 g，瓊脂粉17 g，水1000 mL。

試劑及儀器：正癸烷（98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），2.5%戊二醛固定液（福州飛凈生物科技有限公司），電鏡用鋨酸、Spurr包埋劑（SPI?CHEM公司）。

手動(dòng)SPME進(jìn)樣器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭、15 mL SPME專用頂空樣品采集瓶均為美國(guó)Supelco公司；氣相色譜（GC）/質(zhì)譜（MS）聯(lián)用儀為美國(guó)Agilent 7890B/7000D型和6850/5975型，NIST17譜圖庫(kù)；UC7型超薄切片機(jī)，德國(guó)Leica公司；SU?8010型掃描電鏡和H?7650型透射電鏡，均為日本Hitachi公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)香真菌GS?1對(duì)灰葡萄孢熏蒸抑制作用的觀察 抑菌作用的觀察參照陳利軍等[10]對(duì)扣法，略有修改。用接種針挑取菌株GS?1接種至PDA平板25 ℃條件下黑暗培養(yǎng)，7 d后在菌落邊緣打取直徑5 mm菌餅，取一塊菌餅接種到新PDA平板上25 ℃條件下黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)9 d后與培養(yǎng)灰葡萄孢的平板對(duì)扣，菌株GS?1在下，灰葡萄孢在上。灰葡萄孢的培養(yǎng)方法同菌株GS?1，分別在3 d后取菌餅，24 h后對(duì)扣。以空白PDA平板代替菌株GS?1與灰葡萄孢平板對(duì)扣為對(duì)照。對(duì)扣培養(yǎng)72 h后，掃描電鏡和透射電鏡制樣，觀察灰葡萄孢菌絲形態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化，樣品采集方法參照陳利軍等[17]。

1.2.2 HS?SPME法萃取產(chǎn)香真菌GS?1揮發(fā)性物質(zhì) 取5 mL融化后冷卻到（50～60）℃的PDA倒入15 mL頂空樣品瓶?jī)?nèi)滅菌并擺斜面，制成樣品瓶斜面培養(yǎng)基。用接種針挑取產(chǎn)香真菌GS?1接種到PDA平皿，25 ℃條件下黑暗培養(yǎng)7 d后，在菌落邊緣打取直徑5 mm菌餅，取一塊菌餅接種到樣品瓶斜面培養(yǎng)基上，并將瓶蓋內(nèi)墊換為16 mm已滅菌的濾紙片，然后置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 d后對(duì)GS?1菌株產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行萃取，萃取前24 h將濾紙片更換為原用的內(nèi)墊；萃取頭使用前在260 ℃的GC?MS進(jìn)樣口中活化30 min。25 ℃條件下頂空吸附2 h，然后進(jìn)行GC?MS分析，解吸附時(shí)間為5 min。

1.2.3 產(chǎn)香真菌GS?1揮發(fā)性物質(zhì)釋放時(shí)間規(guī)律的測(cè)定 正癸烷內(nèi)標(biāo)溶液的配置：用正己烷將正癸烷稀釋1000倍得到1 μL/mL正癸烷內(nèi)標(biāo)溶液，備用。揮發(fā)性物質(zhì)收集參考王靜等[18]方法，有修改。HS?SPME法收集產(chǎn)香真菌GS?1揮發(fā)性物質(zhì)：菌株GS?1的培養(yǎng)同1.2.2，0 h起利用SPME裝置對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行收集，1～15 d每天收集1次，之后每隔2 d收集1次，第21 d后截止，每次3個(gè)樣品。收集前，沿頂空瓶?jī)?nèi)側(cè)注入1 μL內(nèi)標(biāo)，平衡20 min后利用HS?SPME法對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行收集，將活化后的萃取頭置于距離樣品約5 mm，萃取的時(shí)間為1 h，萃取溫度為25 ℃。萃取完成后，將萃取頭插入GC?MS進(jìn)樣口解吸附5 min，用GC?MS對(duì)產(chǎn)香真菌GS?1的揮發(fā)性物質(zhì)組分進(jìn)行定量分析，按Vi＝V10×（Ai/A10）公式計(jì)算目標(biāo)代謝物的相對(duì)含量。式中 Vi為目標(biāo)代謝物含量（10?3μL），V10為加入內(nèi)標(biāo)的量（10?3μL），Ai為目標(biāo)代謝物總離子流圖峰面積，A10為內(nèi)標(biāo)總離子流圖峰面積。

1.2.4 產(chǎn)香真菌GS?1揮發(fā)性物質(zhì)化學(xué)組分分析 菌株GS?1培養(yǎng)12 d后通過(guò)HS?SPME?GC?MS法分析揮發(fā)性物質(zhì)化學(xué)組分，菌株培養(yǎng)和揮發(fā)性物質(zhì)測(cè)定的方法同1.2.3，GC?MS為7890B/7000D型。

1.2.5 GC?MS分析條件 GC條件：色譜柱為HP?5ms毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度260 ℃；程序升溫，初始柱溫為60 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升溫速率升至230 ℃，保持1 min；載氣為高純氦氣，流速為 1.0 mL/min；進(jìn)樣量為1.0 μL；不分流模式。MS條件：EI離子源，電子轟擊源為70 eV，離子阱溫度220 ℃，傳輸線溫度280 ℃，無(wú)溶劑延遲，全掃描方式，掃描范圍33～350 amu。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)香真菌GS-1抑菌作用的觀察

掃描電鏡觀察，對(duì)照組灰葡萄孢菌絲質(zhì)地均勻、表面光滑、體態(tài)飽滿、伸展流暢（圖1A）；產(chǎn)香真菌GS?1揮發(fā)性物質(zhì)處理組菌絲表面出現(xiàn)皺縮、菌絲體畸形、頂端尖細(xì)、菌絲變薄等現(xiàn)象（圖1B，C）。

圖1 掃描電鏡觀察產(chǎn)香真菌GS-1揮發(fā)性物質(zhì)處理的灰葡萄孢菌絲Fig.1 Observations of B.cinerea hyphae treated with VOCs from aroma-producing fungus GS-1 strain by scanning electron microscope

透射電鏡觀察，對(duì)照組灰葡萄孢菌絲細(xì)胞的細(xì)胞壁及細(xì)胞膜連續(xù)且較為完整，細(xì)胞質(zhì)質(zhì)地較均勻，空洞較少（圖2A），經(jīng)產(chǎn)香真菌GS?1揮發(fā)性物質(zhì)處理后的灰葡萄孢菌絲細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)疏散、紊亂，細(xì)胞質(zhì)含量大量減少且出現(xiàn)較多空腔（圖2B，C）。

圖2 透射電鏡觀察產(chǎn)香真菌GS-1揮發(fā)性物質(zhì)處理的灰葡萄孢菌絲Fig.2 Observations of B.cinerea hyphae treated with VOCs from aroma-producing fungus GS-1 strain by transmission electron microscope

2.2 產(chǎn)香真菌GS-1揮發(fā)性物質(zhì)釋放的時(shí)間規(guī)律

以正癸烷作為內(nèi)標(biāo)物，通過(guò)HS?SPME?GC?MS測(cè)得產(chǎn)香真菌GS?1揮發(fā)性物質(zhì)釋放時(shí)間規(guī)律曲線圖如圖3所示。揮發(fā)性物質(zhì)釋放量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)總體呈先升高后略降低逐漸趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。在第12 d達(dá)到最大峰值，日釋放量為36.121×10?3μL，之后逐步降低并趨于平穩(wěn)，從第14～21 d維持在21.792×10?3～25.077×10?3μL。

圖3 產(chǎn)香真菌GS-1揮發(fā)性物質(zhì)釋放量時(shí)間動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Temporal dynamics change of releasing amount of VOCs from aroma-producing fungus GS-1

2.3 產(chǎn)香真菌GS-1揮發(fā)性物質(zhì)化學(xué)組分分析

產(chǎn)香真菌 GS?1菌株揮發(fā)性物質(zhì)經(jīng)HS?SPME?GC?MS法吸附收集、分析化學(xué)組分，其總離子流圖如圖4所示。各組分相對(duì)含量通過(guò)色譜峰面積歸一法測(cè)定，質(zhì)譜圖經(jīng)NIST17質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，并與標(biāo)準(zhǔn)圖譜核對(duì)，結(jié)合CAS號(hào)分析鑒定各組分。結(jié)果顯示，從菌株GS?1揮發(fā)性物質(zhì)中分離到34個(gè)化學(xué)組分，鑒定其中 18個(gè)組分，占揮發(fā)性物質(zhì)總量的 72.78%，其中[3S?(3α,3aβ,5α)]?1,2,3,3a,4,5,6,7?八氫?α,α,3,8?四甲基?5?薁甲醇相對(duì)含量最高，占揮發(fā)性物質(zhì)總量的 34.222%，其次是表蓽澄茄油烯醇和α?廣藿香烯，分別占揮發(fā)性物質(zhì)總量10.701%和5.597%等（表1）。18種已鑒定的化合物種，薁類化合物7種，相對(duì)含量達(dá)49.57%。

圖4 產(chǎn)香真菌GS-1揮發(fā)性物質(zhì)總離子流圖Fig.4 Total ion chromatogram of VOCs from aroma-producing fungus GS-1 by GC-MS

表1 產(chǎn)香真菌GS-1揮發(fā)性物質(zhì)組分Table 1 Chemical components of VOCs from aroma-producing fungus GS-1 strain

3 討論

植物揮發(fā)性物質(zhì)抑菌作用機(jī)理主要包括作用于細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、核酸、蛋白質(zhì)等造成不可逆的損失，作用于能量系統(tǒng)或代謝系統(tǒng)誘導(dǎo)活性氧積累介導(dǎo)細(xì)胞凋亡等[17,19]。植物揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的破壞會(huì)首先作用于細(xì)胞膜、破壞通透性，進(jìn)而侵入細(xì)胞內(nèi)部引起細(xì)胞器損傷，從而影響細(xì)胞的生理功能[17]。相比植物揮發(fā)性物質(zhì)，微生物揮發(fā)性物質(zhì)抑菌作用機(jī)理研究較少，但表現(xiàn)出類似的作用過(guò)程。微生物揮發(fā)性物質(zhì)中的部分化合物，如萜烯類化合物，能夠破壞細(xì)胞膜的完整性和穩(wěn)定性，增加細(xì)胞膜通透性，從而導(dǎo)致細(xì)菌和真菌死亡[20,21]。透射電鏡觀察核盤(pán)菌S.sclerotiorum菌絲細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)被根圍細(xì)菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)處理后，細(xì)胞膜與細(xì)胞壁分離，細(xì)胞質(zhì)中空腔增大，數(shù)量增多，細(xì)胞質(zhì)堆積物增多，線粒體數(shù)量增加，線粒體的嵴過(guò)度增大[22]。植物內(nèi)生真菌Nodulisporiumsp.和Hypoxylonanthochroum產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)處理尖孢鐮刀菌F.oxysporum菌絲后，菌絲呼吸作用受到抑制，細(xì)胞膜滲透性增強(qiáng)，同時(shí)顯微觀察到菌絲形態(tài)和結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)胞質(zhì)中空腔增大，數(shù)量增多[23]。利用產(chǎn)香真菌 GS?1與灰葡萄孢對(duì)扣試驗(yàn)，通過(guò)顯微觀察菌絲形態(tài)及菌絲細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)菌株 GS?1揮發(fā)性物質(zhì)也主要通過(guò)使菌絲畸形、細(xì)胞質(zhì)外滲、細(xì)胞質(zhì)中空腔增多等表現(xiàn)其抑菌作用，而細(xì)胞膜系統(tǒng)也可能是其靶標(biāo)之一。

從菌株GS?1揮發(fā)性物質(zhì)中分離到34個(gè)化學(xué)組分，本研究鑒定了其中18個(gè)組分?，F(xiàn)有的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)中包含真菌產(chǎn)生的化合物較少[7]，也即真菌揮發(fā)性物質(zhì)中有較多的新化合物，因此菌株 GS?1揮發(fā)性物質(zhì)中尚有16種化合物未鑒定，包括3種相對(duì)含量大于3%的組分。揮發(fā)性物質(zhì)表現(xiàn)出的抑菌效果是由混合物中的多種化學(xué)組分協(xié)同作用[24]，其中主要化學(xué)組分一般都具有抑菌活性。在已有較深入研究的麝香霉Muscodorspp.產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)中，很多化合物都具有抑菌活性，如β?石竹烯及其氧化物、3?甲基?1?丁醇乙酯等[24,25]。[3S?(3α,3aβ,5α)]?1,2,3,3a,4,5,6,7?八氫?α,α,3,8?四甲基?5?薁甲醇在真菌揮發(fā)性物質(zhì)中被鑒定出的頻率較少，抑菌活性研究鮮有報(bào)道。在哈茨木霉Trichodermaharzianum的揮發(fā)性物質(zhì)中鑒定出[3S?(3α,3aβ,5α)]?1,2,3,3a,4,5,6,7?八氫?α,α,3,8?四甲基?5?薁甲醇，但相對(duì)含量較少（1.11%）[26]。廣藿香烯極性小、類似物多、結(jié)構(gòu)差異小、分離難度大，雖然在真菌揮發(fā)性物質(zhì)中被鑒定出的頻率較多，但同分異構(gòu)體抑菌活性研究受限。在婁地青霉Penicilliumroqueforti的揮發(fā)性物質(zhì)中鑒定出較多的β?廣藿香烯、γ?廣藿香烯以及同分異構(gòu)體[27]。在腐皮殼屬Diaporthespp.具有抑菌活性的揮發(fā)性物質(zhì)中也鑒定出少量廣藿香烯（0.45%）[28]。[3S?(3α,3aβ,5α)]?1,2,3,3a,4,5,6,7?八氫?α,α,3,8?四甲基?5?薁甲醇和α?廣藿香烯均為薁類化合物，且在已鑒定的組分中薁類化合物多達(dá)7種，相對(duì)含量達(dá)49.57%，已知薁類化合物都具有較強(qiáng)的消炎、抑菌、抗腫瘤等生物活性[29]。表蓽澄茄油烯醇在擔(dān)子菌Pleurotuscystidiosus、P.eryngii、Piptoporus betulinus、Fomitopsispinicola等中鑒定出的較多[30,31]。作為廢棄清酒雪松木桶揮發(fā)性物質(zhì)主要組分，表蓽澄茄油烯醇對(duì)紅色毛癬菌Trichophytonrubrum具有很強(qiáng)的抑菌活性，能夠抑制菌絲生長(zhǎng)和細(xì)胞DNA聚合酶的活性[32]。

微生物揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌效果除與其活性物質(zhì)有關(guān)外，也受其揮發(fā)性物質(zhì)總量的影響[10]。微生物揮發(fā)性物質(zhì)的釋放是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，揮發(fā)性物質(zhì)的成分、種類、含量等因溫度、pH、碳源、培養(yǎng)時(shí)間等不同而變化[2]。本研究以正癸烷作為內(nèi)標(biāo)，利用HS?SPME?GC?MS對(duì)產(chǎn)香真菌GS?1揮發(fā)性物質(zhì)定量分析，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的推移，揮發(fā)性物質(zhì)總量呈先升高后略降低逐漸趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，第12 d達(dá)到最大值，這種趨勢(shì)可能與該菌生長(zhǎng)、產(chǎn)孢到其生長(zhǎng)衰退的整個(gè)過(guò)程相對(duì)應(yīng)。在揮發(fā)性物質(zhì)總量達(dá)到最大時(shí)，可明顯觀察到大量分生孢子的產(chǎn)生，且在12 d后，由于相當(dāng)數(shù)量的分生孢子存在，其揮發(fā)性物質(zhì)的釋放量仍維持在較高水平。菌株GS?1揮發(fā)性物質(zhì)釋放量與其生物學(xué)特性的關(guān)系有待進(jìn)一步研究，以便優(yōu)化菌株GS?1揮發(fā)性物質(zhì)產(chǎn)生和收集的方法體系。