蘭明先，白云梅，王志江，謝永輝，朱法亮，詹莜國(guó)，曾舒泉，吳國(guó)星*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明 650201；2.云南省煙草公司昆明市公司，昆明 650051）

在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，雜草比其他任何農(nóng)業(yè)害蟲都能造成更大的作物產(chǎn)量和質(zhì)量的下降[1]。在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中，農(nóng)作物保護(hù)很大程度上依賴于使用合成除草劑來控制雜草[1]。除草劑是作物保護(hù)類產(chǎn)品的重要組成部分，廣泛應(yīng)用于水稻、玉米和小麥等主要作物，對(duì)提高作物質(zhì)量和產(chǎn)量起著至關(guān)重要的作用[2]。在提倡生態(tài)文明的當(dāng)下，微生物除草劑越來越多的應(yīng)用于農(nóng)林牧業(yè)。紫莖澤蘭EupatoriumadenophorumSpreng，屬菊科澤蘭屬，是一種入侵性極強(qiáng)的多年生惡性雜草，是我國(guó)外來入侵物種中危害最為嚴(yán)重的植物之一[3]。目前利用澤蘭實(shí)蠅控制紫莖澤蘭是生物防治的一個(gè)重要措施，但紫莖澤蘭分蘗能力和繁殖能力較強(qiáng)，導(dǎo)致澤蘭實(shí)蠅的寄生速度趕不上紫莖澤蘭的擴(kuò)散速度，控制效果有限[4,5]。在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，從澤蘭實(shí)蠅幼蟲中分離純化得到的22株共生菌中，有6株菌（分別屬于芽胞桿菌屬、泛菌屬等）對(duì)紫莖澤蘭葉片有侵害作用[6]，其中菌株ZLSY5具有一定的除草活性，但該菌株的進(jìn)化關(guān)系及發(fā)酵條件尚未研究清楚。因此，通過對(duì)細(xì)菌的形態(tài)特征觀察以及系統(tǒng)進(jìn)化樹的建立，鑒定了菌株的種屬關(guān)系；采用兩因素有重復(fù)試驗(yàn)，對(duì)菌株ZLSY5的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，明確其最佳發(fā)酵條件，為利用該菌株防治紫莖澤蘭奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌種 保存于本實(shí)驗(yàn)室，菌株編號(hào)為ZLSY5。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）：牛肉膏 0.6 g，蛋白胨 2 g，NaCl 1 g，瓊脂 3 g，蒸餾水200 mL，121 ℃ 滅菌20 min；蛋白胨酵母培養(yǎng)基（LB）：蛋白胨 2 g，酵母浸粉 1 g，氯化鈉 2 g，瓊脂 3 g，蒸餾水200 mL，121 ℃滅菌20 min；細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基（CM）：葡萄糖 1 g，(NH4)2SO40.4 g，檸檬酸鈉0.2 g，MgSO4·7H2O 0.04 g，K2HPO40.8 g，KH2PO41.2 g，瓊脂 3 g，蒸餾水 200 mL，121 ℃滅菌 20 min；牛肉膏酵母葡萄糖培養(yǎng)基（NYBD）：牛肉浸膏1.6 g，酵母浸粉1 g，葡萄糖 2 g，瓊脂 3 g，蒸餾水200 mL，115 ℃滅菌30 min；蛋白胨酵母蔗糖培養(yǎng)基（YSP）：蛋白胨 2 g，酵母浸粉 1 g，蔗糖 4 g，瓊脂 3 g，蒸餾水200 mL，115 ℃滅菌30 min。

1.2 內(nèi)共生菌的鑒定

1.2.1 內(nèi)共生菌的分離 對(duì)采回的蟲癭整體消毒后在超凈工作臺(tái)內(nèi)解剖出幼蟲，將幼蟲體表消毒后解剖，獲得體內(nèi)各組織[7]。分別收集所獲得的各組織于離心管內(nèi)，研磨后梯度稀釋制備菌懸液。取 10-5、10-6、10-7稀釋度的菌懸液0.1 mL，分別接種在NA培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度做3個(gè)重復(fù)[8]。將接菌后的培養(yǎng)皿倒置，28 ℃培養(yǎng)2 d[9]。待長(zhǎng)出單菌落后，進(jìn)行純化培養(yǎng)。純化3～4次可得純化后的單菌落[10]。

1.2.2 菌落菌體特征觀察 挑取純化后的單菌落接種于LB培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)2 d，獲得單菌落。待長(zhǎng)出單菌落后觀察其形態(tài)[11]。挑取單菌落涂布于載玻片上，做單染色，革蘭氏染色[12]。在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，測(cè)定菌體大小，記錄革蘭氏染色結(jié)果。

1.2.3 16S rDNA的擴(kuò)增和測(cè)序 將所純化分離的菌做16S rDNA基因序列鑒定。根據(jù)形態(tài)特征歸類的微生物類群，選用試劑盒提取代表單菌落DNA，方法根據(jù)試劑盒說明書。將提取的DNA用于細(xì)菌高變動(dòng)區(qū)段V4區(qū)的體外擴(kuò)增，引物為16S V4區(qū)通用引物[13]。PCR產(chǎn)物回收純化使用pJET載體鏈接，通過BJIⅡ 酶切鑒定并送生物公司測(cè)序（昆明擎科生物公司），測(cè)序結(jié)果在GenBank（http://www.ncbi.nih.gov）中進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 測(cè)序結(jié)果通過 DNAstar和chromas 軟件校對(duì)，并在NCBI中blast比對(duì)下載已發(fā)表的最高相似序列，相關(guān)序列用MEGA 6.0軟件經(jīng)CLUSTALW比對(duì)，采用 Jukes-cantor模型構(gòu)建N-J樹[7]。

1.3 內(nèi)共生菌發(fā)酵條件篩選

1.3.1 培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌菌液濃度的影響 挑取純化后的ZLSY5單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，28 ℃搖床180 r/min培養(yǎng)16 h，OD值為0.8～1.2，獲得菌懸液。取50 μL ZLSY5的菌懸液分別接種于100 mL的YSP、NA、NYBD、CM和 LB培養(yǎng)基中。在25 ℃，220 r/min的搖床里振蕩培養(yǎng)24、48和72 h，采用分光光度法測(cè)定菌液在600 nm處的OD值，從而測(cè)定菌液濃度[14]。

1.3.2 氮源對(duì)細(xì)菌菌液濃度的影響 以上述試驗(yàn)篩選出的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照，試驗(yàn)組分別加入酵母膏（JMG）、甘氨酸（Gly）、蛋白胨（DBD）、硝酸銨（XSA）、丙氨酸（Ala）和谷氨酸（Glu）作氮源，發(fā)酵培養(yǎng)24、48和72 h后分別測(cè)定不同氮源培養(yǎng)基的OD值，以此明確氮源對(duì)細(xì)菌菌液濃度的影響[14]。

1.3.3 碳源對(duì)細(xì)菌菌液濃度的影響 將1.3.1中篩選出的適合ZLSY5生長(zhǎng)的培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以碳源為蔗糖時(shí)作為對(duì)照，葡萄糖（PPT）、蔗糖（ZT）、麥芽糖（MYT）、乳糖（RT）、淀粉（DF）作碳源，發(fā)酵培養(yǎng)24 h后測(cè)定第1次OD值，48 h后測(cè)第2次，72 h后測(cè)第3次，與對(duì)照比較不同碳源對(duì)細(xì)菌菌液濃度的影響[14]。

1.3.4 pH 對(duì)細(xì)菌菌液濃度的影響 制備優(yōu)化的培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH分別為 4、5、6、7、8、9、10，將50 μL菌株ZLSY5菌懸液接種于不同pH的培養(yǎng)基中，放于搖床培養(yǎng)24、48、72 h后測(cè)定菌株在不同pH條件下的OD值，以此來判斷pH對(duì)細(xì)菌菌液濃度的影響[15]。

1.3.5 溫度對(duì)細(xì)菌菌液濃度的影響 在優(yōu)化培養(yǎng)基中接種50 μL的菌株ZLSY5菌懸液，在溫度16 ℃、20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃和40 ℃，轉(zhuǎn)速為220 r/min的搖床中培養(yǎng)24、48、72 h后，測(cè)定各溫度下的OD值，從而判斷溫度對(duì)細(xì)菌菌液濃度的影響[15]。

1.3.6 轉(zhuǎn)速對(duì)細(xì)菌菌液濃度的影響 將菌株接種到優(yōu)化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件采用上述優(yōu)化條件，設(shè)定搖床轉(zhuǎn)速分別為140、160、180、200、220、240 r/min，測(cè)定不同轉(zhuǎn)速下菌液的OD值[15]。

1.3.7 光照對(duì)細(xì)菌菌液濃度的影響 采用優(yōu)化培養(yǎng)基配方，培養(yǎng)條件采用上述優(yōu)化條件，設(shè)定光照為0 h/d、4 h/d、8 h/d、12 h/d、16 h/d、20 h/d、24 h/d，測(cè)定不同光照對(duì)細(xì)菌菌液濃度的影響。

1.3.8 通氣量對(duì)細(xì)菌菌液濃度的影響 在250 mL的三角瓶中分別加入優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基20、40、80、120和160 mL，在220 r/min的搖床培養(yǎng)，測(cè)定不同通氣量下細(xì)菌的OD值[15]。

1.3.9 初始接菌量對(duì)細(xì)菌菌液濃度的影響 將菌株ZLSY5菌懸液按100 mL裝液量的0.5%、1%、5%、10%、20%、25%和30%分別接入到優(yōu)化培養(yǎng)基中，測(cè)定在不同接菌量條件下細(xì)菌OD值，從而判斷初始接菌量對(duì)細(xì)菌的菌液濃度有何影響[16]。

1.3.10 發(fā)酵時(shí)間對(duì)細(xì)菌菌液濃度的影響 采用優(yōu)化培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件采用上述優(yōu)化的溫度、pH、初始接菌量、通氣量，分別發(fā)酵12、24、36、48、60、72、96、108、120、132和144 h，測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)ZLSY5菌液濃度的影響[14]。

1.4 除草活性比較

菌株ZLSY5對(duì)紫莖澤蘭葉片影響作用的測(cè)定采用葉圓片法。選取紫莖澤蘭植株固定部位大小一致的葉片，在清水里沖洗一段時(shí)間，取出葉片晾干，用30%過氧化氫對(duì)葉表面滅菌。將滅菌后的濾紙平鋪于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，試驗(yàn)組加入5 mL于搖床培養(yǎng)24 h的菌懸液，對(duì)照組加入5 mL的無菌水。設(shè)13個(gè)對(duì)照和12個(gè)處理。對(duì)照分別為無菌水對(duì)照、LB液體培養(yǎng)基的原液、2倍、4倍、8倍、16倍和32倍稀釋液，NYBD液體培養(yǎng)基的原液、2倍、4倍、8倍、16倍和32倍稀釋液，處理分別為L(zhǎng)B培養(yǎng)基細(xì)菌發(fā)酵液原液、2倍、4倍、8倍、16倍和32倍稀釋液，NYBD培養(yǎng)基細(xì)菌發(fā)酵液原液、2倍、4倍、8倍、16倍和32倍稀釋液。用直徑為6 mm的打孔器打取紫莖澤蘭葉圓片，葉背面向上平放于放有濾紙的5 mL菌懸液的培養(yǎng)皿內(nèi)，用保鮮膜封口后置于（25±2）℃，光周期 12L∶12D的培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)，3次重復(fù)，每隔24 h統(tǒng)計(jì)一次結(jié)果。采用分級(jí)統(tǒng)計(jì)方法記錄紫莖澤蘭葉圓片的受害情況。評(píng)價(jià)菌懸液對(duì)葉圓片侵害程度的標(biāo)準(zhǔn)如表 1[6]。侵害指數(shù)＝Σ（該級(jí)別值×出現(xiàn)該級(jí)別的圓片數(shù)）/（5×所有觀察的圓片數(shù)）×100%。

表1 評(píng)價(jià)菌株ZLSY5菌懸液對(duì)紫莖澤蘭葉圓片侵害程度的標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The standard of the violation severity of E.adenophorum leaf discs caused by the bacteria suspension of strain ZLSY5

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析；Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)共生菌鑒定結(jié)果

菌落直徑3～4 mm，表面粗糙，不透明，褶皺，卡其色，拱起狀，邊緣整齊。菌體桿狀，1.5～2.53 μm。芽胞橢圓形，（0.7～1.06）μm×（1.25～1.9）μm，革蘭氏陽性菌。由進(jìn)化樹可得菌株ZLSY5為特基拉芽胞桿菌Bacillustequilensis10b（圖1）。

圖1 菌株ZLSY5 N-J進(jìn)化樹Fig.1 N-J evolutionary tree of strain ZLSY5

2.2 發(fā)酵條件篩選

2.2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果 菌株ZLSY5在不同培養(yǎng)基上的菌液濃度在各個(gè)時(shí)間段內(nèi)均有顯著差異（F＝77307.835，df＝8，P＝0.0001）。在24～72 h，菌株ZLSY5在NYBD培養(yǎng)基上菌液濃度呈穩(wěn)定趨勢(shì)上升，72 h后菌液濃度高達(dá)2.236。從整體上看，細(xì)菌在NYBD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，YSP培養(yǎng)基在48 h后菌液濃度增長(zhǎng)趨勢(shì)減緩（圖2）。

圖2 培養(yǎng)基對(duì)菌株ZLSY5生長(zhǎng)速度的影響Fig.2 Effect of medium on the growth rate of strain ZLSY5

2.2.2 氮源篩選結(jié)果 菌株ZLSY5在各個(gè)時(shí)間段內(nèi)不同氮源對(duì)ZLSY5菌液濃度的影響有顯著差異（F＝1085.185，df＝10，P＝0.0001）。酵母膏作氮源時(shí)最適合菌株ZLSY5生長(zhǎng)，其次為蛋白胨，而甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸和硝酸銨不適合作菌株ZLSY5的氮源（圖3）。

圖3 氮源對(duì)菌株ZLSY5生長(zhǎng)速度的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on the growth rate of strain ZLSY5

2.2.3 碳源篩選結(jié)果 菌株ZLSY5在葡萄糖（PPT）、蔗糖（ZT）、麥芽糖（MYT）和乳糖（RT）、淀粉（DF）等碳源上均能生長(zhǎng)。而且在各個(gè)時(shí)間段內(nèi)，5種碳源對(duì)菌株 ZLSY5的生長(zhǎng)均有顯著影響（F＝70269.76，df＝8，P＝0.0001）。這5種碳源均可作為菌株ZLSY5的碳源來利用，相較而言，葡萄糖、麥芽糖和蔗糖作為碳源要優(yōu)于淀粉和乳糖（圖4）。

圖4 碳源對(duì)菌株ZLSY5生長(zhǎng)速度的影響Fig.4 Effects of carbon source on the growth rate of strain ZLSY5

2.2.4 pH優(yōu)化結(jié)果 菌株 ZLSY5在各個(gè)時(shí)間段內(nèi)不同 pH對(duì) ZLSY5菌液濃度的影響有顯著差異（F＝164.521，df＝12，P＝0.0001）。pH 4～10時(shí)，菌株ZLSY5的菌液濃度沒有隨著時(shí)間增加而增加，而pH在5～9時(shí)，在24～48 h內(nèi)菌液濃度均隨著時(shí)間的增加而不斷增大，表明在pH 5～9范圍內(nèi)菌株ZLSY5均可生長(zhǎng)（圖5）。

圖5 pH對(duì)菌株ZLSY5生長(zhǎng)速度的影響Fig.5 Effect of pH on the growth rate of strain ZLSY5

2.2.5 溫度篩選結(jié)果 菌株ZLSY5在各個(gè)時(shí)間段內(nèi)不同溫度對(duì)ZLSY5菌液濃度的影響有顯著差異（F＝41.305，df＝12，P＝0.0001）。在72 h時(shí)，除40 ℃以外，各溫度下菌液濃度有差異，但是差異較小。由此表明，菌株ZLSY5在溫度16 ℃～36 ℃均能生長(zhǎng)，而最適合其生長(zhǎng)的溫度是28 ℃（圖6）。

圖6 溫度對(duì)菌株ZLSY5生長(zhǎng)速度的影響Fig.6 The influence of temperature on the growth rate of strain ZLSY5

2.2.6 轉(zhuǎn)速篩選結(jié)果 不同的轉(zhuǎn)速下 ZLSY5菌液濃度有顯著的差異（F＝7.274，df＝10，P＝0.0001）。不同轉(zhuǎn)速下測(cè)得的OD值結(jié)果顯示，當(dāng)轉(zhuǎn)速為200、220和240 r/min時(shí)，菌株ZLSY5的菌液濃度增長(zhǎng)較快。轉(zhuǎn)速為240 r/min時(shí)，菌株ZLSY5生長(zhǎng)速度最快（圖7）。

圖7 轉(zhuǎn)速對(duì)菌株ZLSY5生長(zhǎng)的影響Fig.7 The influence of rotating speed on the growth of the strain ZLSY5

2.2.7 光照篩選結(jié)果 不同的光照時(shí)間下菌株 ZLSY5菌液濃度有顯著的差異（F＝5.847，df＝12，P＝0.0001）。當(dāng)光照時(shí)間為20 h/d時(shí)，菌株ZLSY5的菌液濃度最大。光照時(shí)間為0 h/d時(shí)菌液濃度最小，且菌液增長(zhǎng)速度最小（圖8）。

圖8 光照時(shí)間對(duì)菌株ZLSY5生長(zhǎng)的影響Fig.8 The influence of lighting time on the growth of the strain ZLSY5

2.2.8 通氣量篩選結(jié)果 不同的通氣量下ZLSY5菌液濃度有顯著的差異（F＝12.357，df＝8，P＝0.0001）。當(dāng)搖瓶中所裝培養(yǎng)液為40 mL時(shí)細(xì)菌生長(zhǎng)最快，培養(yǎng)24 h后基本趨于穩(wěn)定，其次是20和80 mL。裝液量為160 mL時(shí)細(xì)菌產(chǎn)生量較少（圖9）。

圖9 通氣量對(duì)菌株ZLSY5生長(zhǎng)的影響Fig.9 The influence ventilation quantity on the growth of the strain ZLSY5

2.2.9 初始接菌量篩選結(jié)果 不同的初始接菌量下菌液濃度有顯著的差異（F＝16.611，df＝12，P＝0.0001）。當(dāng)接菌量為2.00%時(shí)菌液濃度增長(zhǎng)最快，細(xì)菌產(chǎn)生量最多，OD值為1.908，其次是2.50%和0.10%。在24 h時(shí)，菌液濃度受到初始接菌量的影響，但是隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，初始接菌量的影響越來越?。▓D10）。

圖10 初始接菌量對(duì)菌株ZLSY5生長(zhǎng)的影響Fig.10 The influence of initial inoculation quantity on the growth of the strain ZLSY5

2.2.10 發(fā)酵時(shí)間對(duì)細(xì)菌菌液濃度的影響 在4 h之前，菌液濃度基本沒有增長(zhǎng)，此時(shí)處于細(xì)菌生長(zhǎng)的遲緩期；在4 h之后，ZLSY5隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加其菌液濃度也隨之增加，在36 h時(shí)達(dá)到最大值，此階段是菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；在36～60 h，菌液濃度處于一個(gè)較為平穩(wěn)的OD值內(nèi)，此時(shí)是細(xì)菌生長(zhǎng)的平穩(wěn)期；在60 h之后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，菌株的OD值開始緩慢下降，此時(shí)處于細(xì)菌生長(zhǎng)的衰亡期（圖11）。

圖11 菌株ZLSY5的生長(zhǎng)曲線圖Fig.11 The growth curve of strain ZLSY5

2.3 優(yōu)化培養(yǎng)基后菌株ZLSY5除草活性比較

優(yōu)化后的培養(yǎng)基NYBD培養(yǎng)的菌株ZLSY5對(duì)葉片的侵害效果更好。由于所得數(shù)據(jù)是消除培養(yǎng)基對(duì)葉片的影響后的數(shù)據(jù)，而LB培養(yǎng)基在原濃度和稀釋2倍濃度下對(duì)葉片有侵害作用，因此在這兩個(gè)濃度下LB培養(yǎng)基對(duì)葉片的侵害作用不明顯。而優(yōu)化后的NYBD培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌株ZLSY5對(duì)葉片的影響較小，消除后隨著濃度的減小，侵害作用也在相應(yīng)地減小，但作用均好于LB培養(yǎng)基所培養(yǎng)的菌的侵害作用。優(yōu)化后在原濃度即濃度為1時(shí)，侵害作用最大，接近90%（圖12）。

圖12 菌株ZLSY5優(yōu)化后對(duì)紫莖澤蘭葉片的侵害程度Fig.12 The degree of damage to the leaves of E.adenophorum after strain ZLSY5 optimization

3 討論

芽胞桿菌屬的細(xì)菌在分類上存在著不同的分類法。傳統(tǒng)的芽胞桿菌分類主要依據(jù)其形態(tài)學(xué)特征，現(xiàn)在則大多采用多相分類法，即將形態(tài)、生理生化、化學(xué)（脂肪酸分析）、分子（DNA 堿基分析、DNA 同源性分析，16S rRNA 測(cè)序）等分類方法相結(jié)合，并根據(jù)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，得出的結(jié)果相對(duì)比較準(zhǔn)確。利用分子技術(shù)可以根據(jù)菌的基因進(jìn)行鑒定，將芽胞桿菌的分類地位劃分的更確切。多相分類是傳統(tǒng)的表型分類、數(shù)值分類和分子分類等方法的綜合應(yīng)用，因而可以更客觀地反映生物間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系[17]。

影響微生物發(fā)酵的因子有很多，主要包括碳源、氮源、溫度、初始pH值等，但不同的微生物對(duì)碳源、氮源、溫度等條件的選擇又有差異[18,19]。從本試驗(yàn)研究結(jié)果來看，各個(gè)碳源對(duì)菌株 ZLSY5生長(zhǎng)速度的影響是有差異的，但是均能生長(zhǎng)，說明菌株 ZLSY5的發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)碳源的選擇范圍較廣，其中對(duì)麥芽糖、蔗糖和葡萄糖利用效果較好。對(duì)于篩選最佳氮源，發(fā)現(xiàn)蛋白胨、酵母膏有利于菌體生長(zhǎng)；而銨態(tài)氮源硝酸銨難以被利用，且銨態(tài)氮作氮源時(shí)在一定程度上抑制了菌株 ZLSY5的生長(zhǎng)；用氨基酸類作為氮源，菌株的菌液濃度較低，說明氨基酸類也不適合作為氮源。

目前，大部分細(xì)菌通常用LB培養(yǎng)，因?yàn)樵贚B上生長(zhǎng)的細(xì)菌類群相對(duì)單一，有單一類群優(yōu)勢(shì)或抑制其他類群生長(zhǎng)的現(xiàn)象[20,21]。但本試驗(yàn)分別采用YSP、NB、NYBD、CM和LB培養(yǎng)基對(duì)菌株ZLSY5進(jìn)行搖床培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該菌在24 h內(nèi)在NYBD生長(zhǎng)最好，其次才是LB。與侯佳佳等[22]研究報(bào)道凝結(jié)芽胞桿菌高產(chǎn)活菌的最佳培養(yǎng)基和秦艷等[23]優(yōu)化的枯草芽胞桿菌的培養(yǎng)基不同。可能是不同菌株適合不同的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這可能與不同菌株的遺傳特征和生理特性不同有關(guān)，也與所獲取菌株的特定生境有關(guān)。

在發(fā)酵條件篩選方面，培養(yǎng)基的初始pH直接影響菌體細(xì)胞膜所帶的電荷，影響其對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，進(jìn)而影響細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖[23]。選擇最適合的初始pH有利于菌體的生長(zhǎng)繁殖與生物量的提高。菌株ZLSY5最適pH為5～9，說明其適合弱酸性至弱堿性的環(huán)境，過酸或者過堿都不適合生長(zhǎng)。在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，細(xì)胞中蛋白質(zhì)和酶活性增強(qiáng)，使其生長(zhǎng)和繁殖速率大大提高；如溫度過高，細(xì)菌細(xì)胞中對(duì)溫度敏感的組成成分（蛋白質(zhì)、核酸）會(huì)受到不可逆的破壞，抑制菌體生長(zhǎng)和繁殖[24]。該菌在溫度為16 ℃～36 ℃內(nèi)均能正常生長(zhǎng)，說明其對(duì)環(huán)境溫度的適應(yīng)能力較強(qiáng)，但在24 ℃以下生長(zhǎng)很慢，則表明低溫不適合用于該菌的發(fā)酵培養(yǎng)。而轉(zhuǎn)速和通氣量都與培養(yǎng)液中的氧氣溶解量有關(guān)，試驗(yàn)結(jié)果表明裝液量為40 mL/250 mL、轉(zhuǎn)速為240 r/min時(shí)菌株ZLSY5的菌液濃度最大；針對(duì)接菌量的研究，則與細(xì)菌的養(yǎng)分利用和生長(zhǎng)空間有關(guān)，接種量為2.0%時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)得最好，菌株ZLSY5能充分利用養(yǎng)分和空間，接菌量過多則因養(yǎng)分和空間有限，細(xì)菌生長(zhǎng)會(huì)受到抑制。光照時(shí)長(zhǎng)對(duì)菌株ZLSY5生長(zhǎng)的影響表現(xiàn)為光照20 h/d最適其生長(zhǎng)，說明該菌為感光型細(xì)菌。

本試驗(yàn)對(duì)菌株 ZLSY5的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化并確定了最佳條件，提高其發(fā)酵產(chǎn)量，有望從中分離得到有益的活性物質(zhì)，這為利用細(xì)菌防治紫莖澤蘭奠定了一定的基礎(chǔ)。但對(duì)于發(fā)酵液的活性成分尚未清楚，后續(xù)會(huì)對(duì)菌株的除草活性成分進(jìn)行研究。