蘭明先，白云梅，王志江，謝永輝，朱法亮，詹莜國，曾舒泉，吳國星*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，昆明 650201；2.云南省煙草公司昆明市公司，昆明 650051）

在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，雜草比其他任何農(nóng)業(yè)害蟲都能造成更大的作物產(chǎn)量和質(zhì)量的下降[1]。在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中，農(nóng)作物保護很大程度上依賴于使用合成除草劑來控制雜草[1]。除草劑是作物保護類產(chǎn)品的重要組成部分，廣泛應用于水稻、玉米和小麥等主要作物，對提高作物質(zhì)量和產(chǎn)量起著至關(guān)重要的作用[2]。在提倡生態(tài)文明的當下，微生物除草劑越來越多的應用于農(nóng)林牧業(yè)。紫莖澤蘭EupatoriumadenophorumSpreng，屬菊科澤蘭屬，是一種入侵性極強的多年生惡性雜草，是我國外來入侵物種中危害最為嚴重的植物之一[3]。目前利用澤蘭實蠅控制紫莖澤蘭是生物防治的一個重要措施，但紫莖澤蘭分蘗能力和繁殖能力較強，導致澤蘭實蠅的寄生速度趕不上紫莖澤蘭的擴散速度，控制效果有限[4,5]。在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，從澤蘭實蠅幼蟲中分離純化得到的22株共生菌中，有6株菌（分別屬于芽胞桿菌屬、泛菌屬等）對紫莖澤蘭葉片有侵害作用[6]，其中菌株ZLSY5具有一定的除草活性，但該菌株的進化關(guān)系及發(fā)酵條件尚未研究清楚。因此，通過對細菌的形態(tài)特征觀察以及系統(tǒng)進化樹的建立，鑒定了菌株的種屬關(guān)系；采用兩因素有重復試驗，對菌株ZLSY5的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，明確其最佳發(fā)酵條件，為利用該菌株防治紫莖澤蘭奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌種 保存于本實驗室，菌株編號為ZLSY5。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）：牛肉膏 0.6 g，蛋白胨 2 g，NaCl 1 g，瓊脂 3 g，蒸餾水200 mL，121 ℃ 滅菌20 min；蛋白胨酵母培養(yǎng)基（LB）：蛋白胨 2 g，酵母浸粉 1 g，氯化鈉 2 g，瓊脂 3 g，蒸餾水200 mL，121 ℃滅菌20 min；細菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基（CM）：葡萄糖 1 g，(NH4)2SO40.4 g，檸檬酸鈉0.2 g，MgSO4·7H2O 0.04 g，K2HPO40.8 g，KH2PO41.2 g，瓊脂 3 g，蒸餾水 200 mL，121 ℃滅菌 20 min；牛肉膏酵母葡萄糖培養(yǎng)基（NYBD）：牛肉浸膏1.6 g，酵母浸粉1 g，葡萄糖 2 g，瓊脂 3 g，蒸餾水200 mL，115 ℃滅菌30 min；蛋白胨酵母蔗糖培養(yǎng)基（YSP）：蛋白胨 2 g，酵母浸粉 1 g，蔗糖 4 g，瓊脂 3 g，蒸餾水200 mL，115 ℃滅菌30 min。

1.2 內(nèi)共生菌的鑒定

1.2.1 內(nèi)共生菌的分離 對采回的蟲癭整體消毒后在超凈工作臺內(nèi)解剖出幼蟲，將幼蟲體表消毒后解剖，獲得體內(nèi)各組織[7]。分別收集所獲得的各組織于離心管內(nèi)，研磨后梯度稀釋制備菌懸液。取 10-5、10-6、10-7稀釋度的菌懸液0.1 mL，分別接種在NA培養(yǎng)基上，每個梯度做3個重復[8]。將接菌后的培養(yǎng)皿倒置，28 ℃培養(yǎng)2 d[9]。待長出單菌落后，進行純化培養(yǎng)。純化3～4次可得純化后的單菌落[10]。

1.2.2 菌落菌體特征觀察 挑取純化后的單菌落接種于LB培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)2 d，獲得單菌落。待長出單菌落后觀察其形態(tài)[11]。挑取單菌落涂布于載玻片上，做單染色，革蘭氏染色[12]。在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，測定菌體大小，記錄革蘭氏染色結(jié)果。

1.2.3 16S rDNA的擴增和測序 將所純化分離的菌做16S rDNA基因序列鑒定。根據(jù)形態(tài)特征歸類的微生物類群，選用試劑盒提取代表單菌落DNA，方法根據(jù)試劑盒說明書。將提取的DNA用于細菌高變動區(qū)段V4區(qū)的體外擴增，引物為16S V4區(qū)通用引物[13]。PCR產(chǎn)物回收純化使用pJET載體鏈接，通過BJIⅡ 酶切鑒定并送生物公司測序（昆明擎科生物公司），測序結(jié)果在GenBank（http://www.ncbi.nih.gov）中進行BLAST 比對分析。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 測序結(jié)果通過 DNAstar和chromas 軟件校對，并在NCBI中blast比對下載已發(fā)表的最高相似序列，相關(guān)序列用MEGA 6.0軟件經(jīng)CLUSTALW比對，采用 Jukes-cantor模型構(gòu)建N-J樹[7]。

1.3 內(nèi)共生菌發(fā)酵條件篩選

1.3.1 培養(yǎng)基對細菌菌液濃度的影響 挑取純化后的ZLSY5單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，28 ℃搖床180 r/min培養(yǎng)16 h，OD值為0.8～1.2，獲得菌懸液。取50 μL ZLSY5的菌懸液分別接種于100 mL的YSP、NA、NYBD、CM和 LB培養(yǎng)基中。在25 ℃，220 r/min的搖床里振蕩培養(yǎng)24、48和72 h，采用分光光度法測定菌液在600 nm處的OD值，從而測定菌液濃度[14]。

1.3.2 氮源對細菌菌液濃度的影響 以上述試驗篩選出的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照，試驗組分別加入酵母膏（JMG）、甘氨酸（Gly）、蛋白胨（DBD）、硝酸銨（XSA）、丙氨酸（Ala）和谷氨酸（Glu）作氮源，發(fā)酵培養(yǎng)24、48和72 h后分別測定不同氮源培養(yǎng)基的OD值，以此明確氮源對細菌菌液濃度的影響[14]。

1.3.3 碳源對細菌菌液濃度的影響 將1.3.1中篩選出的適合ZLSY5生長的培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以碳源為蔗糖時作為對照，葡萄糖（PPT）、蔗糖（ZT）、麥芽糖（MYT）、乳糖（RT）、淀粉（DF）作碳源，發(fā)酵培養(yǎng)24 h后測定第1次OD值，48 h后測第2次，72 h后測第3次，與對照比較不同碳源對細菌菌液濃度的影響[14]。

1.3.4 pH 對細菌菌液濃度的影響 制備優(yōu)化的培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH分別為 4、5、6、7、8、9、10，將50 μL菌株ZLSY5菌懸液接種于不同pH的培養(yǎng)基中，放于搖床培養(yǎng)24、48、72 h后測定菌株在不同pH條件下的OD值，以此來判斷pH對細菌菌液濃度的影響[15]。

1.3.5 溫度對細菌菌液濃度的影響 在優(yōu)化培養(yǎng)基中接種50 μL的菌株ZLSY5菌懸液，在溫度16 ℃、20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃和40 ℃，轉(zhuǎn)速為220 r/min的搖床中培養(yǎng)24、48、72 h后，測定各溫度下的OD值，從而判斷溫度對細菌菌液濃度的影響[15]。

1.3.6 轉(zhuǎn)速對細菌菌液濃度的影響 將菌株接種到優(yōu)化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件采用上述優(yōu)化條件，設定搖床轉(zhuǎn)速分別為140、160、180、200、220、240 r/min，測定不同轉(zhuǎn)速下菌液的OD值[15]。

1.3.7 光照對細菌菌液濃度的影響 采用優(yōu)化培養(yǎng)基配方，培養(yǎng)條件采用上述優(yōu)化條件，設定光照為0 h/d、4 h/d、8 h/d、12 h/d、16 h/d、20 h/d、24 h/d，測定不同光照對細菌菌液濃度的影響。

1.3.8 通氣量對細菌菌液濃度的影響 在250 mL的三角瓶中分別加入優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基20、40、80、120和160 mL，在220 r/min的搖床培養(yǎng)，測定不同通氣量下細菌的OD值[15]。

1.3.9 初始接菌量對細菌菌液濃度的影響 將菌株ZLSY5菌懸液按100 mL裝液量的0.5%、1%、5%、10%、20%、25%和30%分別接入到優(yōu)化培養(yǎng)基中，測定在不同接菌量條件下細菌OD值，從而判斷初始接菌量對細菌的菌液濃度有何影響[16]。

1.3.10 發(fā)酵時間對細菌菌液濃度的影響 采用優(yōu)化培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件采用上述優(yōu)化的溫度、pH、初始接菌量、通氣量，分別發(fā)酵12、24、36、48、60、72、96、108、120、132和144 h，測定不同發(fā)酵時間對ZLSY5菌液濃度的影響[14]。

1.4 除草活性比較

菌株ZLSY5對紫莖澤蘭葉片影響作用的測定采用葉圓片法。選取紫莖澤蘭植株固定部位大小一致的葉片，在清水里沖洗一段時間，取出葉片晾干，用30%過氧化氫對葉表面滅菌。將滅菌后的濾紙平鋪于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，試驗組加入5 mL于搖床培養(yǎng)24 h的菌懸液，對照組加入5 mL的無菌水。設13個對照和12個處理。對照分別為無菌水對照、LB液體培養(yǎng)基的原液、2倍、4倍、8倍、16倍和32倍稀釋液，NYBD液體培養(yǎng)基的原液、2倍、4倍、8倍、16倍和32倍稀釋液，處理分別為LB培養(yǎng)基細菌發(fā)酵液原液、2倍、4倍、8倍、16倍和32倍稀釋液，NYBD培養(yǎng)基細菌發(fā)酵液原液、2倍、4倍、8倍、16倍和32倍稀釋液。用直徑為6 mm的打孔器打取紫莖澤蘭葉圓片，葉背面向上平放于放有濾紙的5 mL菌懸液的培養(yǎng)皿內(nèi)，用保鮮膜封口后置于（25±2）℃，光周期 12L∶12D的培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)，3次重復，每隔24 h統(tǒng)計一次結(jié)果。采用分級統(tǒng)計方法記錄紫莖澤蘭葉圓片的受害情況。評價菌懸液對葉圓片侵害程度的標準如表 1[6]。侵害指數(shù)＝Σ（該級別值×出現(xiàn)該級別的圓片數(shù)）/（5×所有觀察的圓片數(shù)）×100%。

表1 評價菌株ZLSY5菌懸液對紫莖澤蘭葉圓片侵害程度的標準Table 1 The standard of the violation severity of E.adenophorum leaf discs caused by the bacteria suspension of strain ZLSY5

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析；Duncan氏新復極差法檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)共生菌鑒定結(jié)果

菌落直徑3～4 mm，表面粗糙，不透明，褶皺，卡其色，拱起狀，邊緣整齊。菌體桿狀，1.5～2.53 μm。芽胞橢圓形，（0.7～1.06）μm×（1.25～1.9）μm，革蘭氏陽性菌。由進化樹可得菌株ZLSY5為特基拉芽胞桿菌Bacillustequilensis10b（圖1）。

圖1 菌株ZLSY5 N-J進化樹Fig.1 N-J evolutionary tree of strain ZLSY5

2.2 發(fā)酵條件篩選

2.2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果 菌株ZLSY5在不同培養(yǎng)基上的菌液濃度在各個時間段內(nèi)均有顯著差異（F＝77307.835，df＝8，P＝0.0001）。在24～72 h，菌株ZLSY5在NYBD培養(yǎng)基上菌液濃度呈穩(wěn)定趨勢上升，72 h后菌液濃度高達2.236。從整體上看，細菌在NYBD培養(yǎng)基上生長最快，YSP培養(yǎng)基在48 h后菌液濃度增長趨勢減緩（圖2）。

圖2 培養(yǎng)基對菌株ZLSY5生長速度的影響Fig.2 Effect of medium on the growth rate of strain ZLSY5

2.2.2 氮源篩選結(jié)果 菌株ZLSY5在各個時間段內(nèi)不同氮源對ZLSY5菌液濃度的影響有顯著差異（F＝1085.185，df＝10，P＝0.0001）。酵母膏作氮源時最適合菌株ZLSY5生長，其次為蛋白胨，而甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸和硝酸銨不適合作菌株ZLSY5的氮源（圖3）。

圖3 氮源對菌株ZLSY5生長速度的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on the growth rate of strain ZLSY5

2.2.3 碳源篩選結(jié)果 菌株ZLSY5在葡萄糖（PPT）、蔗糖（ZT）、麥芽糖（MYT）和乳糖（RT）、淀粉（DF）等碳源上均能生長。而且在各個時間段內(nèi)，5種碳源對菌株 ZLSY5的生長均有顯著影響（F＝70269.76，df＝8，P＝0.0001）。這5種碳源均可作為菌株ZLSY5的碳源來利用，相較而言，葡萄糖、麥芽糖和蔗糖作為碳源要優(yōu)于淀粉和乳糖（圖4）。

圖4 碳源對菌株ZLSY5生長速度的影響Fig.4 Effects of carbon source on the growth rate of strain ZLSY5

2.2.4 pH優(yōu)化結(jié)果 菌株 ZLSY5在各個時間段內(nèi)不同 pH對 ZLSY5菌液濃度的影響有顯著差異（F＝164.521，df＝12，P＝0.0001）。pH 4～10時，菌株ZLSY5的菌液濃度沒有隨著時間增加而增加，而pH在5～9時，在24～48 h內(nèi)菌液濃度均隨著時間的增加而不斷增大，表明在pH 5～9范圍內(nèi)菌株ZLSY5均可生長（圖5）。

圖5 pH對菌株ZLSY5生長速度的影響Fig.5 Effect of pH on the growth rate of strain ZLSY5

2.2.5 溫度篩選結(jié)果 菌株ZLSY5在各個時間段內(nèi)不同溫度對ZLSY5菌液濃度的影響有顯著差異（F＝41.305，df＝12，P＝0.0001）。在72 h時，除40 ℃以外，各溫度下菌液濃度有差異，但是差異較小。由此表明，菌株ZLSY5在溫度16 ℃～36 ℃均能生長，而最適合其生長的溫度是28 ℃（圖6）。

圖6 溫度對菌株ZLSY5生長速度的影響Fig.6 The influence of temperature on the growth rate of strain ZLSY5

2.2.6 轉(zhuǎn)速篩選結(jié)果 不同的轉(zhuǎn)速下 ZLSY5菌液濃度有顯著的差異（F＝7.274，df＝10，P＝0.0001）。不同轉(zhuǎn)速下測得的OD值結(jié)果顯示，當轉(zhuǎn)速為200、220和240 r/min時，菌株ZLSY5的菌液濃度增長較快。轉(zhuǎn)速為240 r/min時，菌株ZLSY5生長速度最快（圖7）。

圖7 轉(zhuǎn)速對菌株ZLSY5生長的影響Fig.7 The influence of rotating speed on the growth of the strain ZLSY5

2.2.7 光照篩選結(jié)果 不同的光照時間下菌株 ZLSY5菌液濃度有顯著的差異（F＝5.847，df＝12，P＝0.0001）。當光照時間為20 h/d時，菌株ZLSY5的菌液濃度最大。光照時間為0 h/d時菌液濃度最小，且菌液增長速度最小（圖8）。

圖8 光照時間對菌株ZLSY5生長的影響Fig.8 The influence of lighting time on the growth of the strain ZLSY5

2.2.8 通氣量篩選結(jié)果 不同的通氣量下ZLSY5菌液濃度有顯著的差異（F＝12.357，df＝8，P＝0.0001）。當搖瓶中所裝培養(yǎng)液為40 mL時細菌生長最快，培養(yǎng)24 h后基本趨于穩(wěn)定，其次是20和80 mL。裝液量為160 mL時細菌產(chǎn)生量較少（圖9）。

圖9 通氣量對菌株ZLSY5生長的影響Fig.9 The influence ventilation quantity on the growth of the strain ZLSY5

2.2.9 初始接菌量篩選結(jié)果 不同的初始接菌量下菌液濃度有顯著的差異（F＝16.611，df＝12，P＝0.0001）。當接菌量為2.00%時菌液濃度增長最快，細菌產(chǎn)生量最多，OD值為1.908，其次是2.50%和0.10%。在24 h時，菌液濃度受到初始接菌量的影響，但是隨著培養(yǎng)時間的增加，初始接菌量的影響越來越?。▓D10）。

圖10 初始接菌量對菌株ZLSY5生長的影響Fig.10 The influence of initial inoculation quantity on the growth of the strain ZLSY5

2.2.10 發(fā)酵時間對細菌菌液濃度的影響 在4 h之前，菌液濃度基本沒有增長，此時處于細菌生長的遲緩期；在4 h之后，ZLSY5隨著培養(yǎng)時間的增加其菌液濃度也隨之增加，在36 h時達到最大值，此階段是菌株的對數(shù)生長期；在36～60 h，菌液濃度處于一個較為平穩(wěn)的OD值內(nèi)，此時是細菌生長的平穩(wěn)期；在60 h之后，隨著培養(yǎng)時間的增加，菌株的OD值開始緩慢下降，此時處于細菌生長的衰亡期（圖11）。

圖11 菌株ZLSY5的生長曲線圖Fig.11 The growth curve of strain ZLSY5

2.3 優(yōu)化培養(yǎng)基后菌株ZLSY5除草活性比較

優(yōu)化后的培養(yǎng)基NYBD培養(yǎng)的菌株ZLSY5對葉片的侵害效果更好。由于所得數(shù)據(jù)是消除培養(yǎng)基對葉片的影響后的數(shù)據(jù)，而LB培養(yǎng)基在原濃度和稀釋2倍濃度下對葉片有侵害作用，因此在這兩個濃度下LB培養(yǎng)基對葉片的侵害作用不明顯。而優(yōu)化后的NYBD培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌株ZLSY5對葉片的影響較小，消除后隨著濃度的減小，侵害作用也在相應地減小，但作用均好于LB培養(yǎng)基所培養(yǎng)的菌的侵害作用。優(yōu)化后在原濃度即濃度為1時，侵害作用最大，接近90%（圖12）。

圖12 菌株ZLSY5優(yōu)化后對紫莖澤蘭葉片的侵害程度Fig.12 The degree of damage to the leaves of E.adenophorum after strain ZLSY5 optimization

3 討論

芽胞桿菌屬的細菌在分類上存在著不同的分類法。傳統(tǒng)的芽胞桿菌分類主要依據(jù)其形態(tài)學特征，現(xiàn)在則大多采用多相分類法，即將形態(tài)、生理生化、化學（脂肪酸分析）、分子（DNA 堿基分析、DNA 同源性分析，16S rRNA 測序）等分類方法相結(jié)合，并根據(jù)所得數(shù)據(jù)進行聚類分析，得出的結(jié)果相對比較準確。利用分子技術(shù)可以根據(jù)菌的基因進行鑒定，將芽胞桿菌的分類地位劃分的更確切。多相分類是傳統(tǒng)的表型分類、數(shù)值分類和分子分類等方法的綜合應用，因而可以更客觀地反映生物間的系統(tǒng)進化關(guān)系[17]。

影響微生物發(fā)酵的因子有很多，主要包括碳源、氮源、溫度、初始pH值等，但不同的微生物對碳源、氮源、溫度等條件的選擇又有差異[18,19]。從本試驗研究結(jié)果來看，各個碳源對菌株 ZLSY5生長速度的影響是有差異的，但是均能生長，說明菌株 ZLSY5的發(fā)酵培養(yǎng)基對碳源的選擇范圍較廣，其中對麥芽糖、蔗糖和葡萄糖利用效果較好。對于篩選最佳氮源，發(fā)現(xiàn)蛋白胨、酵母膏有利于菌體生長；而銨態(tài)氮源硝酸銨難以被利用，且銨態(tài)氮作氮源時在一定程度上抑制了菌株 ZLSY5的生長；用氨基酸類作為氮源，菌株的菌液濃度較低，說明氨基酸類也不適合作為氮源。

目前，大部分細菌通常用LB培養(yǎng)，因為在LB上生長的細菌類群相對單一，有單一類群優(yōu)勢或抑制其他類群生長的現(xiàn)象[20,21]。但本試驗分別采用YSP、NB、NYBD、CM和LB培養(yǎng)基對菌株ZLSY5進行搖床培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該菌在24 h內(nèi)在NYBD生長最好，其次才是LB。與侯佳佳等[22]研究報道凝結(jié)芽胞桿菌高產(chǎn)活菌的最佳培養(yǎng)基和秦艷等[23]優(yōu)化的枯草芽胞桿菌的培養(yǎng)基不同?？赡苁遣煌赀m合不同的營養(yǎng)物質(zhì)，這可能與不同菌株的遺傳特征和生理特性不同有關(guān)，也與所獲取菌株的特定生境有關(guān)。

在發(fā)酵條件篩選方面，培養(yǎng)基的初始pH直接影響菌體細胞膜所帶的電荷，影響其對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，進而影響細菌的生長和繁殖[23]。選擇最適合的初始pH有利于菌體的生長繁殖與生物量的提高。菌株ZLSY5最適pH為5～9，說明其適合弱酸性至弱堿性的環(huán)境，過酸或者過堿都不適合生長。在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，細胞中蛋白質(zhì)和酶活性增強，使其生長和繁殖速率大大提高；如溫度過高，細菌細胞中對溫度敏感的組成成分（蛋白質(zhì)、核酸）會受到不可逆的破壞，抑制菌體生長和繁殖[24]。該菌在溫度為16 ℃～36 ℃內(nèi)均能正常生長，說明其對環(huán)境溫度的適應能力較強，但在24 ℃以下生長很慢，則表明低溫不適合用于該菌的發(fā)酵培養(yǎng)。而轉(zhuǎn)速和通氣量都與培養(yǎng)液中的氧氣溶解量有關(guān)，試驗結(jié)果表明裝液量為40 mL/250 mL、轉(zhuǎn)速為240 r/min時菌株ZLSY5的菌液濃度最大；針對接菌量的研究，則與細菌的養(yǎng)分利用和生長空間有關(guān)，接種量為2.0%時，細菌生長得最好，菌株ZLSY5能充分利用養(yǎng)分和空間，接菌量過多則因養(yǎng)分和空間有限，細菌生長會受到抑制。光照時長對菌株ZLSY5生長的影響表現(xiàn)為光照20 h/d最適其生長，說明該菌為感光型細菌。

本試驗對菌株 ZLSY5的發(fā)酵條件進行優(yōu)化并確定了最佳條件，提高其發(fā)酵產(chǎn)量，有望從中分離得到有益的活性物質(zhì)，這為利用細菌防治紫莖澤蘭奠定了一定的基礎(chǔ)。但對于發(fā)酵液的活性成分尚未清楚，后續(xù)會對菌株的除草活性成分進行研究。