蘭明先,白云梅,王志江,謝永輝,朱法亮,詹莜國,曾舒泉,吳國星*
(1.云南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院,昆明 650201;2.云南省煙草公司昆明市公司,昆明 650051)
在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域,雜草比其他任何農(nóng)業(yè)害蟲都能造成更大的作物產(chǎn)量和質(zhì)量的下降[1]。在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中,農(nóng)作物保護很大程度上依賴于使用合成除草劑來控制雜草[1]。除草劑是作物保護類產(chǎn)品的重要組成部分,廣泛應用于水稻、玉米和小麥等主要作物,對提高作物質(zhì)量和產(chǎn)量起著至關(guān)重要的作用[2]。在提倡生態(tài)文明的當下,微生物除草劑越來越多的應用于農(nóng)林牧業(yè)。紫莖澤蘭EupatoriumadenophorumSpreng,屬菊科澤蘭屬,是一種入侵性極強的多年生惡性雜草,是我國外來入侵物種中危害最為嚴重的植物之一[3]。目前利用澤蘭實蠅控制紫莖澤蘭是生物防治的一個重要措施,但紫莖澤蘭分蘗能力和繁殖能力較強,導致澤蘭實蠅的寄生速度趕不上紫莖澤蘭的擴散速度,控制效果有限[4,5]。在之前的研究中發(fā)現(xiàn),從澤蘭實蠅幼蟲中分離純化得到的22株共生菌中,有6株菌(分別屬于芽胞桿菌屬、泛菌屬等)對紫莖澤蘭葉片有侵害作用[6],其中菌株ZLSY5具有一定的除草活性,但該菌株的進化關(guān)系及發(fā)酵條件尚未研究清楚。因此,通過對細菌的形態(tài)特征觀察以及系統(tǒng)進化樹的建立,鑒定了菌株的種屬關(guān)系;采用兩因素有重復試驗,對菌株ZLSY5的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行了優(yōu)化,明確其最佳發(fā)酵條件,為利用該菌株防治紫莖澤蘭奠定基礎(chǔ)。
1.1.1 供試菌種 保存于本實驗室,菌株編號為ZLSY5。
1.1.2 供試培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA):牛肉膏 0.6 g,蛋白胨 2 g,NaCl 1 g,瓊脂 3 g,蒸餾水200 mL,121 ℃ 滅菌20 min;蛋白胨酵母培養(yǎng)基(LB):蛋白胨 2 g,酵母浸粉 1 g,氯化鈉 2 g,瓊脂 3 g,蒸餾水200 mL,121 ℃滅菌20 min;細菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基(CM):葡萄糖 1 g,(NH4)2SO40.4 g,檸檬酸鈉0.2 g,MgSO4·7H2O 0.04 g,K2HPO40.8 g,KH2PO41.2 g,瓊脂 3 g,蒸餾水 200 mL,121 ℃滅菌 20 min;牛肉膏酵母葡萄糖培養(yǎng)基(NYBD):牛肉浸膏1.6 g,酵母浸粉1 g,葡萄糖 2 g,瓊脂 3 g,蒸餾水200 mL,115 ℃滅菌30 min;蛋白胨酵母蔗糖培養(yǎng)基(YSP):蛋白胨 2 g,酵母浸粉 1 g,蔗糖 4 g,瓊脂 3 g,蒸餾水200 mL,115 ℃滅菌30 min。
1.2.1 內(nèi)共生菌的分離 對采回的蟲癭整體消毒后在超凈工作臺內(nèi)解剖出幼蟲,將幼蟲體表消毒后解剖,獲得體內(nèi)各組織[7]。分別收集所獲得的各組織于離心管內(nèi),研磨后梯度稀釋制備菌懸液。取 10-5、10-6、10-7稀釋度的菌懸液0.1 mL,分別接種在NA培養(yǎng)基上,每個梯度做3個重復[8]。將接菌后的培養(yǎng)皿倒置,28 ℃培養(yǎng)2 d[9]。待長出單菌落后,進行純化培養(yǎng)。純化3~4次可得純化后的單菌落[10]。
1.2.2 菌落菌體特征觀察 挑取純化后的單菌落接種于LB培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)2 d,獲得單菌落。待長出單菌落后觀察其形態(tài)[11]。挑取單菌落涂布于載玻片上,做單染色,革蘭氏染色[12]。在顯微鏡下觀察菌體形態(tài),測定菌體大小,記錄革蘭氏染色結(jié)果。
1.2.3 16S rDNA的擴增和測序 將所純化分離的菌做16S rDNA基因序列鑒定。根據(jù)形態(tài)特征歸類的微生物類群,選用試劑盒提取代表單菌落DNA,方法根據(jù)試劑盒說明書。將提取的DNA用于細菌高變動區(qū)段V4區(qū)的體外擴增,引物為16S V4區(qū)通用引物[13]。PCR產(chǎn)物回收純化使用pJET載體鏈接,通過BJIⅡ 酶切鑒定并送生物公司測序(昆明擎科生物公司),測序結(jié)果在GenBank(http://www.ncbi.nih.gov)中進行BLAST 比對分析。
1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 測序結(jié)果通過 DNAstar和chromas 軟件校對,并在NCBI中blast比對下載已發(fā)表的最高相似序列,相關(guān)序列用MEGA 6.0軟件經(jīng)CLUSTALW比對,采用 Jukes-cantor模型構(gòu)建N-J樹[7]。
1.3.1 培養(yǎng)基對細菌菌液濃度的影響 挑取純化后的ZLSY5單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基,28 ℃搖床180 r/min培養(yǎng)16 h,OD值為0.8~1.2,獲得菌懸液。取50 μL ZLSY5的菌懸液分別接種于100 mL的YSP、NA、NYBD、CM和 LB培養(yǎng)基中。在25 ℃,220 r/min的搖床里振蕩培養(yǎng)24、48和72 h,采用分光光度法測定菌液在600 nm處的OD值,從而測定菌液濃度[14]。
1.3.2 氮源對細菌菌液濃度的影響 以上述試驗篩選出的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,用基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照,試驗組分別加入酵母膏(JMG)、甘氨酸(Gly)、蛋白胨(DBD)、硝酸銨(XSA)、丙氨酸(Ala)和谷氨酸(Glu)作氮源,發(fā)酵培養(yǎng)24、48和72 h后分別測定不同氮源培養(yǎng)基的OD值,以此明確氮源對細菌菌液濃度的影響[14]。
1.3.3 碳源對細菌菌液濃度的影響 將1.3.1中篩選出的適合ZLSY5生長的培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,以碳源為蔗糖時作為對照,葡萄糖(PPT)、蔗糖(ZT)、麥芽糖(MYT)、乳糖(RT)、淀粉(DF)作碳源,發(fā)酵培養(yǎng)24 h后測定第1次OD值,48 h后測第2次,72 h后測第3次,與對照比較不同碳源對細菌菌液濃度的影響[14]。
1.3.4 pH 對細菌菌液濃度的影響 制備優(yōu)化的培養(yǎng)基,調(diào)節(jié)pH分別為 4、5、6、7、8、9、10,將50 μL菌株ZLSY5菌懸液接種于不同pH的培養(yǎng)基中,放于搖床培養(yǎng)24、48、72 h后測定菌株在不同pH條件下的OD值,以此來判斷pH對細菌菌液濃度的影響[15]。
1.3.5 溫度對細菌菌液濃度的影響 在優(yōu)化培養(yǎng)基中接種50 μL的菌株ZLSY5菌懸液,在溫度16 ℃、20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃和40 ℃,轉(zhuǎn)速為220 r/min的搖床中培養(yǎng)24、48、72 h后,測定各溫度下的OD值,從而判斷溫度對細菌菌液濃度的影響[15]。
1.3.6 轉(zhuǎn)速對細菌菌液濃度的影響 將菌株接種到優(yōu)化培養(yǎng)基中,培養(yǎng)條件采用上述優(yōu)化條件,設定搖床轉(zhuǎn)速分別為140、160、180、200、220、240 r/min,測定不同轉(zhuǎn)速下菌液的OD值[15]。
1.3.7 光照對細菌菌液濃度的影響 采用優(yōu)化培養(yǎng)基配方,培養(yǎng)條件采用上述優(yōu)化條件,設定光照為0 h/d、4 h/d、8 h/d、12 h/d、16 h/d、20 h/d、24 h/d,測定不同光照對細菌菌液濃度的影響。
1.3.8 通氣量對細菌菌液濃度的影響 在250 mL的三角瓶中分別加入優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基20、40、80、120和160 mL,在220 r/min的搖床培養(yǎng),測定不同通氣量下細菌的OD值[15]。
1.3.9 初始接菌量對細菌菌液濃度的影響 將菌株ZLSY5菌懸液按100 mL裝液量的0.5%、1%、5%、10%、20%、25%和30%分別接入到優(yōu)化培養(yǎng)基中,測定在不同接菌量條件下細菌OD值,從而判斷初始接菌量對細菌的菌液濃度有何影響[16]。
1.3.10 發(fā)酵時間對細菌菌液濃度的影響 采用優(yōu)化培養(yǎng)基,培養(yǎng)條件采用上述優(yōu)化的溫度、pH、初始接菌量、通氣量,分別發(fā)酵12、24、36、48、60、72、96、108、120、132和144 h,測定不同發(fā)酵時間對ZLSY5菌液濃度的影響[14]。
菌株ZLSY5對紫莖澤蘭葉片影響作用的測定采用葉圓片法。選取紫莖澤蘭植株固定部位大小一致的葉片,在清水里沖洗一段時間,取出葉片晾干,用30%過氧化氫對葉表面滅菌。將滅菌后的濾紙平鋪于無菌培養(yǎng)皿內(nèi),試驗組加入5 mL于搖床培養(yǎng)24 h的菌懸液,對照組加入5 mL的無菌水。設13個對照和12個處理。對照分別為無菌水對照、LB液體培養(yǎng)基的原液、2倍、4倍、8倍、16倍和32倍稀釋液,NYBD液體培養(yǎng)基的原液、2倍、4倍、8倍、16倍和32倍稀釋液,處理分別為LB培養(yǎng)基細菌發(fā)酵液原液、2倍、4倍、8倍、16倍和32倍稀釋液,NYBD培養(yǎng)基細菌發(fā)酵液原液、2倍、4倍、8倍、16倍和32倍稀釋液。用直徑為6 mm的打孔器打取紫莖澤蘭葉圓片,葉背面向上平放于放有濾紙的5 mL菌懸液的培養(yǎng)皿內(nèi),用保鮮膜封口后置于(25±2)℃,光周期 12L∶12D的培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng),3次重復,每隔24 h統(tǒng)計一次結(jié)果。采用分級統(tǒng)計方法記錄紫莖澤蘭葉圓片的受害情況。評價菌懸液對葉圓片侵害程度的標準如表 1[6]。侵害指數(shù)=Σ(該級別值×出現(xiàn)該級別的圓片數(shù))/(5×所有觀察的圓片數(shù))×100%。
表1 評價菌株ZLSY5菌懸液對紫莖澤蘭葉圓片侵害程度的標準Table 1 The standard of the violation severity of E.adenophorum leaf discs caused by the bacteria suspension of strain ZLSY5
用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析;Duncan氏新復極差法檢驗。
菌落直徑3~4 mm,表面粗糙,不透明,褶皺,卡其色,拱起狀,邊緣整齊。菌體桿狀,1.5~2.53 μm。芽胞橢圓形,(0.7~1.06)μm×(1.25~1.9)μm,革蘭氏陽性菌。由進化樹可得菌株ZLSY5為特基拉芽胞桿菌Bacillustequilensis10b(圖1)。
圖1 菌株ZLSY5 N-J進化樹Fig.1 N-J evolutionary tree of strain ZLSY5
2.2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果 菌株ZLSY5在不同培養(yǎng)基上的菌液濃度在各個時間段內(nèi)均有顯著差異(F=77307.835,df=8,P=0.0001)。在24~72 h,菌株ZLSY5在NYBD培養(yǎng)基上菌液濃度呈穩(wěn)定趨勢上升,72 h后菌液濃度高達2.236。從整體上看,細菌在NYBD培養(yǎng)基上生長最快,YSP培養(yǎng)基在48 h后菌液濃度增長趨勢減緩(圖2)。
圖2 培養(yǎng)基對菌株ZLSY5生長速度的影響Fig.2 Effect of medium on the growth rate of strain ZLSY5
2.2.2 氮源篩選結(jié)果 菌株ZLSY5在各個時間段內(nèi)不同氮源對ZLSY5菌液濃度的影響有顯著差異(F=1085.185,df=10,P=0.0001)。酵母膏作氮源時最適合菌株ZLSY5生長,其次為蛋白胨,而甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸和硝酸銨不適合作菌株ZLSY5的氮源(圖3)。
圖3 氮源對菌株ZLSY5生長速度的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on the growth rate of strain ZLSY5
2.2.3 碳源篩選結(jié)果 菌株ZLSY5在葡萄糖(PPT)、蔗糖(ZT)、麥芽糖(MYT)和乳糖(RT)、淀粉(DF)等碳源上均能生長。而且在各個時間段內(nèi),5種碳源對菌株 ZLSY5的生長均有顯著影響(F=70269.76,df=8,P=0.0001)。這5種碳源均可作為菌株ZLSY5的碳源來利用,相較而言,葡萄糖、麥芽糖和蔗糖作為碳源要優(yōu)于淀粉和乳糖(圖4)。
圖4 碳源對菌株ZLSY5生長速度的影響Fig.4 Effects of carbon source on the growth rate of strain ZLSY5
2.2.4 pH優(yōu)化結(jié)果 菌株 ZLSY5在各個時間段內(nèi)不同 pH對 ZLSY5菌液濃度的影響有顯著差異(F=164.521,df=12,P=0.0001)。pH 4~10時,菌株ZLSY5的菌液濃度沒有隨著時間增加而增加,而pH在5~9時,在24~48 h內(nèi)菌液濃度均隨著時間的增加而不斷增大,表明在pH 5~9范圍內(nèi)菌株ZLSY5均可生長(圖5)。
圖5 pH對菌株ZLSY5生長速度的影響Fig.5 Effect of pH on the growth rate of strain ZLSY5
2.2.5 溫度篩選結(jié)果 菌株ZLSY5在各個時間段內(nèi)不同溫度對ZLSY5菌液濃度的影響有顯著差異(F=41.305,df=12,P=0.0001)。在72 h時,除40 ℃以外,各溫度下菌液濃度有差異,但是差異較小。由此表明,菌株ZLSY5在溫度16 ℃~36 ℃均能生長,而最適合其生長的溫度是28 ℃(圖6)。
圖6 溫度對菌株ZLSY5生長速度的影響Fig.6 The influence of temperature on the growth rate of strain ZLSY5
2.2.6 轉(zhuǎn)速篩選結(jié)果 不同的轉(zhuǎn)速下 ZLSY5菌液濃度有顯著的差異(F=7.274,df=10,P=0.0001)。不同轉(zhuǎn)速下測得的OD值結(jié)果顯示,當轉(zhuǎn)速為200、220和240 r/min時,菌株ZLSY5的菌液濃度增長較快。轉(zhuǎn)速為240 r/min時,菌株ZLSY5生長速度最快(圖7)。
圖7 轉(zhuǎn)速對菌株ZLSY5生長的影響Fig.7 The influence of rotating speed on the growth of the strain ZLSY5
2.2.7 光照篩選結(jié)果 不同的光照時間下菌株 ZLSY5菌液濃度有顯著的差異(F=5.847,df=12,P=0.0001)。當光照時間為20 h/d時,菌株ZLSY5的菌液濃度最大。光照時間為0 h/d時菌液濃度最小,且菌液增長速度最小(圖8)。
圖8 光照時間對菌株ZLSY5生長的影響Fig.8 The influence of lighting time on the growth of the strain ZLSY5
2.2.8 通氣量篩選結(jié)果 不同的通氣量下ZLSY5菌液濃度有顯著的差異(F=12.357,df=8,P=0.0001)。當搖瓶中所裝培養(yǎng)液為40 mL時細菌生長最快,培養(yǎng)24 h后基本趨于穩(wěn)定,其次是20和80 mL。裝液量為160 mL時細菌產(chǎn)生量較少(圖9)。
圖9 通氣量對菌株ZLSY5生長的影響Fig.9 The influence ventilation quantity on the growth of the strain ZLSY5
2.2.9 初始接菌量篩選結(jié)果 不同的初始接菌量下菌液濃度有顯著的差異(F=16.611,df=12,P=0.0001)。當接菌量為2.00%時菌液濃度增長最快,細菌產(chǎn)生量最多,OD值為1.908,其次是2.50%和0.10%。在24 h時,菌液濃度受到初始接菌量的影響,但是隨著培養(yǎng)時間的增加,初始接菌量的影響越來越?。▓D10)。
圖10 初始接菌量對菌株ZLSY5生長的影響Fig.10 The influence of initial inoculation quantity on the growth of the strain ZLSY5
2.2.10 發(fā)酵時間對細菌菌液濃度的影響 在4 h之前,菌液濃度基本沒有增長,此時處于細菌生長的遲緩期;在4 h之后,ZLSY5隨著培養(yǎng)時間的增加其菌液濃度也隨之增加,在36 h時達到最大值,此階段是菌株的對數(shù)生長期;在36~60 h,菌液濃度處于一個較為平穩(wěn)的OD值內(nèi),此時是細菌生長的平穩(wěn)期;在60 h之后,隨著培養(yǎng)時間的增加,菌株的OD值開始緩慢下降,此時處于細菌生長的衰亡期(圖11)。
圖11 菌株ZLSY5的生長曲線圖Fig.11 The growth curve of strain ZLSY5
優(yōu)化后的培養(yǎng)基NYBD培養(yǎng)的菌株ZLSY5對葉片的侵害效果更好。由于所得數(shù)據(jù)是消除培養(yǎng)基對葉片的影響后的數(shù)據(jù),而LB培養(yǎng)基在原濃度和稀釋2倍濃度下對葉片有侵害作用,因此在這兩個濃度下LB培養(yǎng)基對葉片的侵害作用不明顯。而優(yōu)化后的NYBD培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌株ZLSY5對葉片的影響較小,消除后隨著濃度的減小,侵害作用也在相應地減小,但作用均好于LB培養(yǎng)基所培養(yǎng)的菌的侵害作用。優(yōu)化后在原濃度即濃度為1時,侵害作用最大,接近90%(圖12)。
圖12 菌株ZLSY5優(yōu)化后對紫莖澤蘭葉片的侵害程度Fig.12 The degree of damage to the leaves of E.adenophorum after strain ZLSY5 optimization
芽胞桿菌屬的細菌在分類上存在著不同的分類法。傳統(tǒng)的芽胞桿菌分類主要依據(jù)其形態(tài)學特征,現(xiàn)在則大多采用多相分類法,即將形態(tài)、生理生化、化學(脂肪酸分析)、分子(DNA 堿基分析、DNA 同源性分析,16S rRNA 測序)等分類方法相結(jié)合,并根據(jù)所得數(shù)據(jù)進行聚類分析,得出的結(jié)果相對比較準確。利用分子技術(shù)可以根據(jù)菌的基因進行鑒定,將芽胞桿菌的分類地位劃分的更確切。多相分類是傳統(tǒng)的表型分類、數(shù)值分類和分子分類等方法的綜合應用,因而可以更客觀地反映生物間的系統(tǒng)進化關(guān)系[17]。
影響微生物發(fā)酵的因子有很多,主要包括碳源、氮源、溫度、初始pH值等,但不同的微生物對碳源、氮源、溫度等條件的選擇又有差異[18,19]。從本試驗研究結(jié)果來看,各個碳源對菌株 ZLSY5生長速度的影響是有差異的,但是均能生長,說明菌株 ZLSY5的發(fā)酵培養(yǎng)基對碳源的選擇范圍較廣,其中對麥芽糖、蔗糖和葡萄糖利用效果較好。對于篩選最佳氮源,發(fā)現(xiàn)蛋白胨、酵母膏有利于菌體生長;而銨態(tài)氮源硝酸銨難以被利用,且銨態(tài)氮作氮源時在一定程度上抑制了菌株 ZLSY5的生長;用氨基酸類作為氮源,菌株的菌液濃度較低,說明氨基酸類也不適合作為氮源。
目前,大部分細菌通常用LB培養(yǎng),因為在LB上生長的細菌類群相對單一,有單一類群優(yōu)勢或抑制其他類群生長的現(xiàn)象[20,21]。但本試驗分別采用YSP、NB、NYBD、CM和LB培養(yǎng)基對菌株ZLSY5進行搖床培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)該菌在24 h內(nèi)在NYBD生長最好,其次才是LB。與侯佳佳等[22]研究報道凝結(jié)芽胞桿菌高產(chǎn)活菌的最佳培養(yǎng)基和秦艷等[23]優(yōu)化的枯草芽胞桿菌的培養(yǎng)基不同??赡苁遣煌赀m合不同的營養(yǎng)物質(zhì),這可能與不同菌株的遺傳特征和生理特性不同有關(guān),也與所獲取菌株的特定生境有關(guān)。
在發(fā)酵條件篩選方面,培養(yǎng)基的初始pH直接影響菌體細胞膜所帶的電荷,影響其對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收,進而影響細菌的生長和繁殖[23]。選擇最適合的初始pH有利于菌體的生長繁殖與生物量的提高。菌株ZLSY5最適pH為5~9,說明其適合弱酸性至弱堿性的環(huán)境,過酸或者過堿都不適合生長。在一定溫度范圍內(nèi),隨著溫度的升高,細胞中蛋白質(zhì)和酶活性增強,使其生長和繁殖速率大大提高;如溫度過高,細菌細胞中對溫度敏感的組成成分(蛋白質(zhì)、核酸)會受到不可逆的破壞,抑制菌體生長和繁殖[24]。該菌在溫度為16 ℃~36 ℃內(nèi)均能正常生長,說明其對環(huán)境溫度的適應能力較強,但在24 ℃以下生長很慢,則表明低溫不適合用于該菌的發(fā)酵培養(yǎng)。而轉(zhuǎn)速和通氣量都與培養(yǎng)液中的氧氣溶解量有關(guān),試驗結(jié)果表明裝液量為40 mL/250 mL、轉(zhuǎn)速為240 r/min時菌株ZLSY5的菌液濃度最大;針對接菌量的研究,則與細菌的養(yǎng)分利用和生長空間有關(guān),接種量為2.0%時,細菌生長得最好,菌株ZLSY5能充分利用養(yǎng)分和空間,接菌量過多則因養(yǎng)分和空間有限,細菌生長會受到抑制。光照時長對菌株ZLSY5生長的影響表現(xiàn)為光照20 h/d最適其生長,說明該菌為感光型細菌。
本試驗對菌株 ZLSY5的發(fā)酵條件進行優(yōu)化并確定了最佳條件,提高其發(fā)酵產(chǎn)量,有望從中分離得到有益的活性物質(zhì),這為利用細菌防治紫莖澤蘭奠定了一定的基礎(chǔ)。但對于發(fā)酵液的活性成分尚未清楚,后續(xù)會對菌株的除草活性成分進行研究。