王 晗，金 賀，王旭東，張順斌，夏詩寧，段玉璽，王 惠

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)a.生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，b.植物保護(hù)學(xué)院，沈陽110161）

大豆（Glycinemax）原產(chǎn)于中國[1]，在中國已有五千年的栽培歷史。因其種子富含豐富的植物蛋白質(zhì)，是中國乃至全球重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。大豆胞囊線蟲（Heterodera glycines Ichinohe）通過大豆根部侵入大豆植株而影響大豆正常的生長發(fā)育過程，進(jìn)而影響大豆產(chǎn)量。大豆胞囊線蟲病是一種傳播速度快、傳播范圍廣、傳染力強(qiáng)的土傳性病害，由于大豆胞囊線蟲分為多個生理小種，且休眠體存活時間長，同時寄主類型廣泛，所以防治較為困難。目前大豆胞囊線蟲病的防治方法主要為輪作、生物防治、化學(xué)防治以及培育抗性品種。

大豆胞囊線蟲侵入大豆根系需要破壞根部細(xì)胞壁建立合胞體，木質(zhì)素作為植物次生細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)材料，其沉積可加大細(xì)胞壁的厚度，進(jìn)而成為大豆根系抵抗線蟲攻擊的第一道屏障[2]。研究結(jié)果表明，木質(zhì)素及其代謝過程參與了大豆抗胞囊線蟲的抗性響應(yīng)[3]。木質(zhì)素合成途徑關(guān)鍵酶之一是肉桂酸-4-羥基化酶(C4H)。在大豆中C4H只有一個拷貝[4]，將其命名為GmC4H。C4H在細(xì)胞中本來就存在，但C4H的表達(dá)會受到內(nèi)外因素的共同誘導(dǎo)和調(diào)控作用，在遇到生物脅迫或者非生物脅迫時根據(jù)周圍環(huán)境適時上調(diào)表達(dá)或者下調(diào)表達(dá)[5]。在鹽堿條件下，實時定量PCR 結(jié)果表明，木質(zhì)素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)量上調(diào)，擬南芥根系細(xì)胞通過木質(zhì)素沉積導(dǎo)致的細(xì)胞壁增厚來適應(yīng)鹽脅迫[5]。敲除棉花GhUMC1基因會導(dǎo)致木質(zhì)素合成減少；過表達(dá)該基因會增強(qiáng)細(xì)胞壁的木質(zhì)化，使棉花對黃萎病產(chǎn)生抗性[6-8]。漆酶（Laccase）是木質(zhì)素合成途徑的終端酶，在不同物種中會表現(xiàn)出不一樣的催化特性和催化序列[9]。Lac基因在植物應(yīng)對各種脅迫方面同樣具有不可忽視的作用。在擬南芥漆酶基因家族中，AtLAC4、AtLAC11、AtLAC17對木質(zhì)素的聚合有重要作用[10-11]。同時，在梨中通過轉(zhuǎn)化證明了PbLAC1是參與木質(zhì)素的生物合成與次生細(xì)胞壁的發(fā)育的[12]。目前研究學(xué)者已經(jīng)從許多植物體內(nèi)克隆并分離出了Lac基因，比如模式植物擬南芥[13]、棉花[14]、水稻[15]、柑橘[16]、梨[17]等。2019 年大豆基因組中鑒定出93 個Gm-Lac基因[18]。其中有的基因僅在某一特定器官內(nèi)表達(dá)，如GmLac1和GmLac24在大豆根系內(nèi)表達(dá)；有的基因在組織中表達(dá)水平相對較高，研究結(jié)果表明11 個GmLac在多個組織中高度表達(dá)[18]，本實驗室通過前期篩選發(fā)現(xiàn)其中2個基因（GmLac55和GmLac85）在線蟲侵染前后發(fā)生了差異表達(dá)。

本研究利用qPCR 技術(shù)及間苯三酚染色技術(shù)研究接種SCN3 后大豆植株木質(zhì)素合成通路的GmC4H，Gm-Lac55和GmLac85基因在感病品種Williams82（W82）和抗病品種小粒黑豆（XLH）的根、莖、葉中的表達(dá)量變化，進(jìn)而明確木質(zhì)素合成通路關(guān)鍵酶基因?qū)CN的響應(yīng)，為抗線品種的培育奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

感病大豆品種為Williams 82；抗病大豆品種為小粒黑豆（ZDD1412）。大豆胞囊線蟲（SCN）3 號生理小種，由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)北方線蟲所后山胞囊繁殖基地提供。

供試超純RNA 提取試劑盒和試劑RNase free H2O 購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；供試反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Master Mix)、ddH2O、6×loading buffer、核酸染色劑（Golden View）、SYBR Green PCR master mix、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0購自TaKaRa大連寶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量PCR 以Tubulinmotif（Glyma.15G132200）為內(nèi)參基因，利用NCBI 在線設(shè)計GmC4H、Gm-Lac55和GmLac85的引物（表1），引物由上海生物工程有限公司合成。實時熒光定量PCR 程序為：95 ℃預(yù)變性30s；95℃變性10s，60℃/30s，循環(huán)40 次；95℃變性15s，60℃/60s，95℃/15s，進(jìn)行反應(yīng)繪制熔解曲線。并根據(jù)2-ΔΔCT計算根莖葉中基因相對表達(dá)水平，其中試驗組為接種SCN 的大豆植株，對照組為未接種SCN 的大豆植株。

表1 引物名稱及序列Table 1 Primer name and Primer sequences

1.2.2 木質(zhì)素染色 通過間苯三酚染色法[19]檢測木質(zhì)素在接種線蟲前后的變化。接種線蟲后第9 天，取形態(tài)相似的二級根系，用自來水清洗干凈后，用刀片將根系切下，將根系樣品迅速放入固定液[95%乙醇：冰醋酸（V/V）=1∶1]中浸泡24h。浸泡后用蒸餾水將根沖洗干凈，再放入飽和氯醛水溶液（100g水合氯醛用50mLddH2O溶解）中并使用真空抽濾泵真空處理10min，將樣品在室溫下放置到透明。用1% 的間苯三酚溶液（5g 間苯三酚，25mL 95%乙醇，用ddH2O定容到500mL）將根系浸泡5min后滴加適量濃鹽酸，然后在顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆胞囊線蟲侵染后根中GmC4H、GmLac55和GmLac85的基因表達(dá)分析

由圖1可知，在感病品種Williams82的根中，接種處理后GmC4H的表達(dá)量與對照相比差異不大。GmLac55表達(dá)量在接種后第1 天達(dá)到峰值，為對照的3.48 倍，第10 天為對照的2.76 倍，其余時間與對照相比無顯著差異。在抗病品種小粒黑豆根中，接種處理后GmC4H的表達(dá)量在第5天達(dá)到峰值，為對照的2.24倍，其余時間與對照無顯著差異。在抗病品種小粒黑豆根中，接種處理后GmLac55的表達(dá)量在第5天和第9天顯著高于對照，分別是對照的3.27倍和3.39倍，其余時間與對照相比無顯著差異。在感病品種Williams82的根中，接種處理后GmLac85的表達(dá)量在第9天達(dá)到峰值，為對照的2.12倍，其余時間與對照相比差異不顯著。在抗病品種小粒黑豆根中，接種處理后GmLac85的表達(dá)量雖有上調(diào)趨勢但與對照相比無顯著差異。

圖1 接種線蟲后Williams 82和小粒黑豆根中GmC4H、GmLac55和GmLac85的相對表達(dá)量Figure 1 Relative expression levels of GmC4H,GmLac55 and GmLac85 in Williams82 and Xiaoliheidou roots

2.2 大豆胞囊線蟲侵染后莖中GmC4H、GmLac55和GmLac85的基因表達(dá)分析

由圖2可知，在感病品種Williams82的莖中，接種處理后GmC4H和GmLac85的相對表達(dá)水平均未達(dá)到顯著水平。接種后大豆莖中GmLac55的表達(dá)量變化較顯著，在接種后第7 天和第20 天的表達(dá)量是對照的2倍以上，差異分別達(dá)到顯著和極顯著水平。在抗病品種小粒黑豆的莖中，接種處理后GmC4H的表達(dá)量與對照相比差異不大。接種后大豆莖中GmLac55的表達(dá)量先升高后降低，在接種后第10 天表達(dá)量達(dá)到最高，為對照的11.63倍，接種后第15天開始與對照無顯著差異。接種線蟲后GmLac85的表達(dá)量先急劇升高后迅速下降，在第7天表達(dá)量達(dá)到峰值，為對照的32.48倍，接種后第15天開始與對照無顯著差異。

圖2 接種線蟲后Williams 82和小粒黑豆莖中GmC4H,GmLac55和GmLac85的相對表達(dá)量Figure 2 Relative expression levels of GmC4H,GmLac55 and GmLac85 in Williams82 and Xiaoliheidou stems

2.3 大豆胞囊線蟲侵染后葉中GmC4H、GmLac55和GmLac85的基因表達(dá)分析

由圖3 可知，在感病品種Williams82 的葉中，接種處理后GmC4H和GmLac55的表達(dá)量與對照組相比差異不顯著；GmLac85的表達(dá)量在接種后第1 天最高，為對照的1.81 倍，之后與對照相比無顯著差異。在抗病品種小粒黑豆葉中，接種處理后GmC4H的表達(dá)量與對照相比無顯著差異；GmLac85的表達(dá)量在接種后第1天升至最高，為對照的6.73 倍，其他時間與對照無顯著差異；GmLac55的表達(dá)量在接種后的第1 天達(dá)到最高，為對照的7.61倍，其他時間與對照無顯著差異。

圖3 接種線蟲后Williams 82和小粒黑豆葉中GmC4H、GmLac55和GmLac85的相對表達(dá)量Figure 3 Relative expression levels of GmC4H,GmLac55 and GmLac85 in Williams82 and Xiaoliheidou leaves

2.4 抗感品種大豆根部的木質(zhì)素染色

由圖4可知，在接種大豆胞囊線蟲第9天，Williams82和小粒黑豆根系經(jīng)間苯三酚染色后顯微照片顯示，木質(zhì)部呈紫紅色，與對照相比接種處理的根系木質(zhì)部寬度明顯增加。由表2 可知，除Williams82 接種處理第5 天外，接種線蟲處理大豆根系中木質(zhì)素含量均高于對照。隨著接種線蟲處理時間的延長，Williams82和小粒黑豆根系中的木質(zhì)素含量大體呈逐漸增加的趨勢。Williams82的根系中木質(zhì)素含量在處理后第1天、第3天、第7天和第9天均高于小粒黑豆。

表2 木質(zhì)素染色寬度Table 2 The depth of lignin staining

圖4 大豆胞囊線蟲侵染后根系的間苯三酚染色Figure 4 Phloroglucinol staining of soybean roots infected by SCN

3 討論與結(jié)論

肉桂酸-4-羥基化酶和漆酶是木質(zhì)素合成途徑的關(guān)鍵酶和終端酶，對木質(zhì)素的合成有重要作用。同時木質(zhì)素是植物次生細(xì)胞壁的重要組成成分，在植物抵御逆境脅迫方面有重要作用[20]。楊慧芹等研究表明，在干旱和低溫等非生物脅迫下，煙草中C4H的活性與木質(zhì)素含量的變化趨勢一致[21]；在煙草C4H表達(dá)受到干擾時，煙草中木質(zhì)素的含量就會明顯降低[22]。還有類似研究表明，根結(jié)線蟲侵染水稻后，OsC4H 表達(dá)量上調(diào)時木質(zhì)素含量也會增加，抗性增強(qiáng)[23]；當(dāng)施用外源硫胺素和硅元素處理水稻后，OsC4H基因上調(diào)表達(dá)增加了木質(zhì)素沉積、增強(qiáng)了抗性[24-25]。在對香蕉的漆酶基因家族的研究中發(fā)現(xiàn)，在低溫處理時，部分漆酶基因表達(dá)量上調(diào)以此應(yīng)對低溫脅迫[26]。而大豆中在胞囊線蟲脅迫下GmC4H和GmLac表達(dá)水平的具體變化尚未見詳細(xì)報道。

抗性品種的培育是應(yīng)對傳播范圍廣、傳染力強(qiáng)的土傳性病害——大豆胞囊線蟲病的一種最經(jīng)濟(jì)有效的方法。本研究以感病品種Williams 82 和抗病品種小粒黑豆為材料，在侵染大豆胞囊線蟲后，利用實時熒光定量PCR 技術(shù)對GmC4H，GmLac55和GmLac85基因的表達(dá)量進(jìn)行了分析，結(jié)果表明：在大豆胞囊線蟲侵染大豆根部以后，GmC4H，GmLac55和GmLac85基因均被誘導(dǎo)表達(dá)。在抗病品種小粒黑豆根中，GmC4H基因的表達(dá)量在接種線蟲后的第5天達(dá)到最高且顯著高于其他時間點，是對照組的2.24倍，而在感病品種中表達(dá)量變化并不明顯，甚至略低于對照組。同GmC4H相比，GmLac55和GmLac85在抗病品種和感病品種中的表達(dá)量變化都較為顯著。GmLac55在感病品種接種線蟲后第1天表達(dá)量最高，在抗病品種接種線蟲后第5天顯著上調(diào)并在第9天達(dá)到最高；而GmLac85在抗感兩個品種中均在接種線蟲后第9天達(dá)到最高。從整體來看，GmC4H、GmLac55和GmLac85在抗病品種中的表達(dá)量要高于感病品種，且在不同時期有上調(diào)表達(dá)和下調(diào)表達(dá)。結(jié)合線蟲的侵入過程、生活史[27]及基因高表達(dá)的時間點，推測GmLac55可能在抵御線蟲入侵大豆根部方面起作用，而GmC4H在接種線蟲后第5天表達(dá)量上調(diào)最為顯著，推測GmC4H在限制線蟲在大豆根部細(xì)胞內(nèi)的移動有不可忽視的作用，但是具體功能有待于下一步試驗揭示。劉大偉[28]曾指出，線蟲在侵染大豆植株后的第10 天會在體內(nèi)形成合胞體以提供線蟲發(fā)育所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，本研究中GmLac85在第9 天表達(dá)量明顯上調(diào)，推測GmLac85基因在限制線蟲在大豆根部內(nèi)的發(fā)育有重要作用。

與此同時，在大豆胞囊線蟲侵染抗感品種大豆根系后，在莖和葉中GmC4H、GmLac55和GmLac85在不同時間點也出現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)；且通過對比GmC4H、GmLac55和GmLac85在根、莖、葉中的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)：三個基因在根、莖、葉中顯著高表達(dá)的時間點是相同的或者相近的?？梢?，在大豆胞囊線蟲侵染大豆根系后，在植株內(nèi)發(fā)生信號傳遞，植株整體均產(chǎn)生脅迫響應(yīng)，但是具體信號傳遞機(jī)制有待于后續(xù)試驗揭示。

試驗結(jié)果表明，大豆胞囊線蟲侵染后GmC4H、GmLac55和GmLac85的表達(dá)量發(fā)生變化，木質(zhì)素染色結(jié)果表明，大豆根系內(nèi)的木質(zhì)素含量也具有增加趨勢，進(jìn)一步說明了GmC4H、GmLac55和GmLac85基因表達(dá)水平的變化影響木質(zhì)素含量，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞壁厚度影響線蟲侵染或定殖。