盧 烽，劉鳳嬌，胡小松，張 燕*

（1中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院 北京 100083 2國家果蔬加工工程技術(shù)研究中心 北京 100083）

葡萄皮渣作為葡萄加工副產(chǎn)物，約占總重的20%，其中包含了葡萄中絕大部分的多酚物質(zhì)，如葡萄皮中的主要多酚物質(zhì)花色苷和籽中主要多酚物質(zhì)原花青素等。眾多研究表明，葡萄多酚物質(zhì)具有改善心血管疾病，降血脂，抑制肝臟脂肪積累，緩解動脈粥樣硬化等多種重要的生理活性[1-3]。此外，前人研究表明葡萄籽多酚降低血漿膽固醇的機制可能是通過與膽汁酸結(jié)合，抑制胰腺膽固醇酯酶而抑制膽固醇的吸收，并促進糞膽汁酸分泌[1]。葡萄多酚的降血脂作用雖然在分子水平上得到一定的論證，但其作用機理仍沒有較為統(tǒng)一的答案，較多研究集中于對機體膽固醇和脂質(zhì)代謝的影響方面。

腸道微生物作為一個龐大的群體得到越來越多的關(guān)注。近幾年許多研究證實腸道微生物與機體代謝、疾病及炎癥反應(yīng)、免疫等密切相關(guān)，并且腸道微生物還能調(diào)節(jié)宿主膽固醇和脂質(zhì)代謝等生理過程[4-6]。多酚物質(zhì)的重要生理活性的發(fā)揮可能與其腸道微生物間的相互作用密切相關(guān)，一方面大量的體內(nèi)、外代謝實驗發(fā)現(xiàn)，人體攝入的多酚物質(zhì)有90%～95%不能被吸收，而是直接到達結(jié)腸，被結(jié)腸微生物代謝成酚酸、醛、內(nèi)酯等小分子物質(zhì)；另一方面，多酚及其代謝產(chǎn)物會影響腸道微生物的生長、組成結(jié)構(gòu)和功能性[7-10]。

多酚降血脂作用與其參與血脂相關(guān)合成、轉(zhuǎn)運及代謝等過程的關(guān)聯(lián)已有大量研究。然而，在多酚降血脂的過程中腸道微生物是否起作用，仍處于推測階段?；诖耍疚脑谇叭搜芯康幕A(chǔ)上，從腸道微生物的角度，對葡萄多酚的降血脂效果進行分析，探究其對膽固醇、脂質(zhì)代謝及腸道微生物的影響，研究腸道微生物對于葡萄皮渣多酚降血脂的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄籽多酚提取物（GSE），天津尖峰科技，原花青素含量91.00%，總酚含量86.33%。

葡萄皮渣多酚純化物（GPE），實驗室自制，原花青素含量63.47%，總酚含量80.60%。

使用沒食子酸當量計算總酚含量，使用兒茶酸當量計算原花青素含量。

高脂飼料：Research Diets D12492，251.15 kJ%，美國Research Diets 公司。

血清總膽固醇（TC）試劑盒（A111-1）、血清甘油三酯（TG）試劑盒（A110-1）、血清低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c）試劑盒（A113-1）、血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-c）試劑盒（A112-1）、總膽汁酸（TBA）試劑盒（微板法），南京建成生物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標儀（DR-200BS 型），無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司；高速冷凍離心機（CR21G Ⅲ型），日本日立公司；多功能粉碎機（LBH-400Y），永康科徠爾有限公司；真空冷凍干燥機（LGJ-12），北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 GPE 的制備 巨峰葡萄（Vitis vinifera‘Kyoho’）經(jīng)壓榨后，收集皮渣，烘干，磨粉。室溫下超聲提取得到皮渣多酚粗提液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，經(jīng)AB-8 大孔吸附樹脂柱層析純化并真空冷凍干燥后，得到葡萄皮渣多酚純化物（GPE），干燥密封保存待用。

1.3.2 實驗動物及處理 實驗動物：SPF 級雄性C57BL/6N 小鼠，6 周齡。所有實驗動物處于同一環(huán)境，自由采食、采水，室內(nèi)環(huán)境溫度為（23±2）℃，相對濕度為（50±5）%，12 h 明暗循環(huán)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后按體重將小鼠隨機分為5 組，其中包括空白 組（Gro1）、高脂模型組（Gro2）、高脂GPE 組（Gro3）、高脂GSE 組（Gro4）。

按上述分組情況，每天定時按劑量對小鼠灌胃受試物 GPE（200 mg/kg）、GSE（200 mg/kg），空白組與高脂模型組灌胃生理鹽水，連續(xù)8 周。每周稱量體重，調(diào)整灌胃劑量。

1.3.3 血液采集 每2 周將小鼠禁食12 h 后斷尾采血，高速冷凍離心（3 000 r/min，10 min），分離血清，-80 ℃存放待測。實驗結(jié)束時，小鼠禁食12 h 后摘眼球采血，分離血清，-80 ℃分裝保存。

1.3.4 組織采集 動物麻醉處死后，迅速摘取肝臟組織，用含冰的生理鹽水快速漂洗組織樣品，拭干，稱重。取肝臟右葉部分制作肝冷凍切片，其余部分迅速進行液氮冷凍，于-80 ℃冰箱保存。

1.3.5 糞便收集 每2 周用代謝籠收集最后2 d喂食前的糞便，-80 ℃凍存，用于腸道微生物測序。

1.3.6 血清生化指標 血清指標血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、血清LDL-c、血清 HDL-c均按照試劑盒說明進行操作，采用酶標儀測定。

1.3.7 血脂相關(guān)指數(shù) 按公式（1）～（3）計算血脂相關(guān)指數(shù)。

1.3.8 肝臟脂質(zhì)測定 按試劑盒操作測定肝臟總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）。

1.3.9 肝臟組織病理學觀察 取肝臟右葉1 塊（1 cm×1 cm），立即置于10%的甲醛溶液中固定約24 h，經(jīng)脫水、透明化和浸蠟處理后，制作冰凍切片，油紅“O”染色，電子顯微鏡下觀察肝組織病理學變化，染色后觀察到的中性脂肪呈紅色，細胞核呈淡藍色。低倍鏡下脂肪變性累計1/3～1/2 小葉肝細胞者為輕度；脂肪變性累計1/2～2/3 小葉肝細胞者為中度；脂肪變性累及2/3 以上小葉肝細胞者為重度。

1.3.10 糞便中膽汁酸的測定 代謝籠收集小鼠48 h 糞便，真空冷凍干燥機凍干。取100 mg 干糞便，加1 mL 蒸餾水，浸泡、勻漿，再加8 mL 甲醇，超聲1 h，溫度自然降至室溫后，離心，取上清1 mL，用總膽汁酸試劑盒測定糞便中總膽汁酸濃度。

1.3.11 糞便微生物分析 選用德國QIAGEN 公司QIAamp?DNA Stool Mini Kit 試劑盒對樣本的基因組DNA 進行提取，而后進行16S rDNA 高通量測序。取2.5 ng 稀釋后的基因組DNA，以此作為模板，使用帶有Barcode 的16S V4 通用引物（515F-806R），使用美國Promega 公司的GoTaqRHot Start Colorless Master Mix 高效高保真酶進行PCR，確保擴增效率和準確性。

選用Miseq 平臺對樣本DNA 進行16S rDNA高通量測序；應(yīng)用Mothur 進行分類操作單元（OTU）劃分，將97%序列相似性作為標準，將這些序列劃分為OTU，并按照序列數(shù)量生成OTU 豐度譜?；贠TU 豐度譜進行樣本間的比較分析，研究不同分組樣本的菌群特點。

1.4 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 17 統(tǒng)計軟件進行處理，采用單因素方差分析ANOVA，以Duncans 進行多重比較檢驗（Duncans multiple range tests）。實驗分析結(jié)果以“平均值±標準差”（±s）表示，P<0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 體重變化情況

將各組間的體重進行比較，如表1所示。從第2 周開始，高脂模型組小鼠體重顯著高于正常組，模型建成。高脂飲食小鼠連續(xù)灌胃GSE 1 周后體重開始顯著降低，GPE 連續(xù)灌胃3 周后體重開始顯著降低（P<0.05），且從第5 周開始，高脂GPE 組小鼠體重低于高脂GSE 組體重?？梢?，GPE 和GSE 均能夠顯著抑制高脂飲食引起的小鼠體重增加。這與前人研究結(jié)果一致，即葡萄多酚物質(zhì)能降低體重，改善高脂飲食引起的肥胖[11]。

表1 GPE 和GSE 對高脂飲食小鼠體重的影響Table 1 Effects of GPE and GSE on the weight of high-fat diet mice

2.2 血清脂質(zhì)變化情況

由表2可知，在整個實驗過程中，高脂飲食小鼠的血清TG、TC、LDL-c 水平總體呈上升趨勢，而HDL-c 水平呈下降趨勢，即高脂飲食能夠引起小鼠血漿脂質(zhì)的紊亂。從第6 周開始，高脂模型組TG、TC、LDL-c 水平顯著高于正常組，高血脂癥模型建立。

結(jié)果表明，隨著飼喂時間的延長，高脂飲食小鼠血清TG 呈上升趨勢，通過葡萄多酚灌胃處理，TG 水平的升高得到一定抑制，其中GSE 干預(yù)6周后，TG 水平開始顯著低于高脂模型組，GPE 灌胃8 周后對TG 也有一定的抑制效果，然而不顯著，可能由于主要多酚物質(zhì)原花青素在GPE 中的含量低于GSE。前人研究表明，葡萄多酚能夠提高高脂飲食小鼠的脂蛋白脂酶（LPL）水平，促進TG水解，從而降低TG 水平[12]。葡萄籽多酚提取物通過活化法尼醇X 受體（FXR），提高小異二聚體伴侶受體（SHP）的表達，抑制脂肪酸和甘油三酯合成相關(guān)酶的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1C 的表達，降低餐后甘油三酯水平[13]。這與本文研究結(jié)果一致。

同樣地，由表2可知，通過灌胃GPE 和GSE，在一定程度上抑制了高脂飲食引起的小鼠血清TC 水平的增加，GSE 在第8 周對血清TC 水平有顯著降低效果，而GPE 灌胃8 周后血清TC 較高脂模型組無顯著變化。研究表明，霞多麗葡萄籽粉喂食小鼠3 周能顯著降低高脂飲食小鼠的血漿TC、LDL-c、VLDL-c 水平，而赤霞珠籽粉對血漿脂質(zhì)無顯著影響，表明葡萄籽粉的降血脂效果與其中含有的多酚物質(zhì)種類和含量有關(guān)[14]。

LDL-c 為促動脈硬化因子，是高脂血癥的重要判定依據(jù)之一。由表2可知，隨著飼喂時間的延長，高脂飲食引起小鼠血清LDL-c 水平增加，從第6 周開始高脂模型組血清LDL-c 水平顯著高于正常組。第8 周后GPE 和GSE 顯著降低了血清LDL-c 水平。有研究表明膳食葡萄多酚攝入能活化肝細胞表面低密度脂蛋白受體（LDLR），誘導肝臟對血漿LDL-c 的代謝清除，從而降低血漿LDL-c 濃度[15]，這與本研究結(jié)果一致。

由表2可知，隨著飼喂時間的延長，高脂模型組血清HDL-c 水平呈降低趨勢，經(jīng)灌胃GPE 和GSE 后，高脂飲食引起的血清HDL-c 降低得到一定程度的抑制，然而無顯著性差異，與Kim 等[14]的研究結(jié)果一致。

表2 GPE 和GSE 對高脂飲食小鼠血脂的改善作用Table 2 The improving effects of GPE and GSE on the serum lipid of high-fat diet mice

總的來說，高脂飲食條件下，GPE 灌胃8 周顯著降低了LDL-c 水平；GSE 灌胃8 周顯著降低了TG、TC、LDL-c 水平，均表現(xiàn)出一定的降血脂效果。

2.3 血脂相關(guān)指數(shù)變化情況

高脂血癥與動脈粥樣硬化（AS）和心血管疾?。–HD）具有重要關(guān)聯(lián)，通常為AS 與CHD 前期階段的重要特征。為了綜合比較AS 的發(fā)病傾向以及估計CHD 危險程度，常用AI、R-CHD、LCI 及HDL-c/TC 等血脂相關(guān)指數(shù)作為輔助診斷指標[16]。

由表3可知，實驗8 周后，高脂模型組AI、RCHD、LCI 均顯著高于正常組，而HGL-c/TC 顯著低于正常組，即證實了高脂飲食會誘發(fā)高脂血癥、AS 和CHD 的風險。GPE 和GSE 的干預(yù)顯著降低了AI、R-CHD、LCI 指數(shù)，且顯著提高了HDL-c/TC 指數(shù)，表明GPE 和GSE 能改善高脂飲食小鼠的脂質(zhì)紊亂，對于AS 和CHD 的預(yù)防有重要意義。

表3 GPE 和GSE 對高脂飲食小鼠血脂相關(guān)指數(shù)的影響Table 3 The effects of GPE and GSE on the blood lipid related indices of high-fat diet mice

2.4 肝臟TC、TG 水平變化情況

肝臟為內(nèi)源脂質(zhì)合成和脂質(zhì)代謝的主要場所。由表4可知，高脂飲食顯著提高了小鼠肝臟TC 和TG 水平，而GPE 和GSE 對肝臟TC 和TG水平均表現(xiàn)出顯著的降低效果，且以GSE 的影響最為明顯，表明GPE 和GSE 能顯著改善高脂飲食引起的小鼠肝臟脂質(zhì)堆積，同時提示GPE 和GSE可能參與機體脂質(zhì)代謝過程。有研究報道，葡萄皮多酚提取物可以降低肝臟脂肪積累，調(diào)節(jié)高脂飲食引起的小鼠肝臟脂代謝紊亂[17]。

表4 GPE 和GPE 對高脂飲食小鼠肝脂TC、TG 水平的影響Table 4 The effects of GPE and GSE on the liver TC and TG level of high-fat diet mice

2.5 肝臟脂肪沉積情況

電鏡觀察肝臟脂肪沉積情況如圖1所示。正常組小鼠，染色呈陰性，未見明顯的紅染脂肪滴；高脂組，可見彌漫性大小不等的密集的桔紅色圓形脂肪滴，呈“漁網(wǎng)”狀；高脂GPE 組和高脂GSE組，可見彌漫性大小不等的紅染脂肪滴，而相對于高脂組脂肪滴密度明顯降低，說明GPE、GSE 對脂肪肝的積累、形成有一定的抑制效果，這與前人研究結(jié)果一致[17]。

圖1 GPE 和GSE 對高脂飲食小鼠肝臟脂脂肪堆積的影響Fig.1 The effects of GPE and GSE on the hepatic lipid accumulation by oil red O（ORO） staining of high-fat diet mice

2.6 糞便總膽汁酸變化情況

膽汁酸與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)，95%的膽汁酸進行肝腸循環(huán)，余下部分通過糞膽汁酸形式排出。由表5可知，GPE 和GSE 對糞便總膽汁酸的分泌無顯著影響。推測GPE 和GSE 葡萄復合多酚對糞便中膽汁酸的影響主要體現(xiàn)在對初級、次級膽汁酸種類上的影響，這還需要進一步的實驗驗證。

表5 GPE 和GPE 對糞便總膽汁酸的影響Table 5 The effects of GPE and GSE on the liver total bile acid in feces of high-fat diet mice

2.7 葡萄多酚對腸道菌群的干預(yù)

采用動物腸道微生物模型進一步研究葡萄多酚對高脂飲食下腸道菌群的影響。由圖2a 可知，在門水平上，樣本菌群主要由厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、變形菌門（Proteobacteria）四大菌門構(gòu)成。高脂飲食能增加變形菌門的豐度，灌胃GPE則增加了疣微菌門的相對豐度。

腸道菌群屬水平的平均值如圖2b 所示，GPE明顯增加了未分類腸桿菌科菌屬（Unclassified Enterobacteriaceae）、艾克曼菌屬（Akkermansia）、副桿菌屬（Parabacteroides）等菌屬的相對豐度，降低了未分類瘤胃菌科菌屬（Unclassified Ruminococcaceae）、乳桿菌屬（Lactobacillus）等菌屬的相對豐度。GSE 明顯增加未分類瘤胃菌科菌屬（Unclassified Ruminococcaceae）、副桿菌屬（Parabacteroides）等菌屬的相對豐度，明顯降低了布勞特氏菌屬（Blautia）、乳桿菌屬（Lactobacillus）等菌屬的相對豐度。

圖2 腸道菌群門和屬的平均值Fig.2 Average value of phylum and genus of gut microbiota

應(yīng)用LEfSe 分析比較了不同組間的差異菌。圖1比較了空白組與高脂模型組的菌群差異物種。這2 組的菌群差異主要是由擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門中的菌屬所引起。具體而言，在空白組所有檢測到的12 種關(guān)鍵菌屬中，副桿菌屬（Parabacteroides）、普雷沃氏菌屬（Prevotellaceae）、普氏菌屬（Prevotella）、紫單胞菌屬（Porphyromonadaceae）等幾個擬桿菌門的菌屬以及厚壁菌門的布勞特氏菌屬（Blautia）占比較高。而高脂組檢測到了18 個關(guān)鍵菌屬，其中厚壁菌門梭菌綱的瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、朊細菌門的脫硫弧菌屬（desulfovibrionaceae）、厚壁菌門的乳球菌屬（Lactococcus）等菌屬所占比例較高。

副桿菌屬（Parabacteroides）的一些種類能顯著減輕由硫酸鈉葡聚糖（DSS）引起的急慢性結(jié)腸炎[18]。普氏菌屬（Prevotella）是腸道中發(fā)酵的重要細菌，能改善糖代謝，提升血糖控制[19-20]。布勞特氏菌屬（Blautia）產(chǎn)生短鏈脂肪酸，并與肥胖成負相關(guān)[21]。紫單胞菌屬與肝臟中TNF-α 的表達成負相關(guān)，并且紫單胞菌屬的減少也許會加重肝臟炎癥[22]。這些有益菌屬的相對豐度在高脂組中明顯低于空白組。此外，有文獻報道高脂誘導的肥胖小鼠中厚壁菌門/擬桿菌門高于正常小鼠[23]，這與本實驗結(jié)果一致，并且高脂組小鼠變形菌門相對豐度顯著高于空白組。變形菌門中包含多種致病菌，并且多為革蘭氏陰性菌，是產(chǎn)生脂多糖（LPS）的來源，脂多糖會導致內(nèi)毒素血癥，加重炎癥、肥胖和胰島素抵抗。

圖4結(jié)果顯示的是高脂模型組（Gro2）、高脂GPE 組（Gro3）、高脂GSE 組（Gro4）之間有差異的物種。這3 組的菌群差異主要是由擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門中的菌屬所引起。具體而言，在高脂組所有檢測到的21 種關(guān)鍵菌屬中，厚壁菌門的乳桿菌屬（Lactobacillus）、放線菌門的土壤球菌屬（Agrococcus）、朊細菌門的脫硫弧菌屬（Desulfovibrionaceae）的相對豐度較大。而GPE 組檢測到了26 個關(guān)鍵菌屬，其中丹毒絲菌屬（Erysipelotrichaceae）、乳球菌屬（Lactococcus）等幾個屬于厚壁菌門的菌屬所占比例較大。GSE 組檢測到了37 個關(guān)鍵菌屬，其中厚壁菌門的瘤胃菌科（Ruminococcaceae）作用最大，并且GSE 的關(guān)鍵菌種以梭菌、擬桿菌居多。

圖4 LEfSe 分析高脂模型組（Gro2）、高脂GPE 組（Gro3）、高脂GSE 組（Gro4）之間腸道菌群差異Fig.4 LEfSe analysis the differences among the gut microbiota of high-fat diet model group（Gro2）,GPE high-fat diet group（Gro3）and GSE high-fat diet group（Gro4）

GPE 干預(yù)組中艾克曼菌屬（Akkermansia）顯著高于其它組。有研究報道艾克曼菌屬與肥胖呈負相關(guān)，可抑制高脂飲食引起的脂代謝紊亂[23]。實驗結(jié)果指出高脂組顫螺旋菌屬（Oscillibacter）豐度顯著高于GPE 組。有研究指出該菌豐度同肥胖呈正相關(guān)，且高脂飲食會誘導它的豐度增加[24]。GSE組的未分類瘤胃菌科菌屬（Unclassified Ruminococcaceae）和瘤胃菌科（Ruminococcaceae）明顯高于高脂組。未分類瘤胃菌科菌屬（Unclassified Ruminococcaceae）與體重降低、增加能量代謝呈正相關(guān)，并且會促進纖維素的代謝[25]。此外有文獻報道瘤胃菌科（Ruminococcaceae）與體重降低、能量代謝增加呈正相關(guān)，且對纖維素的代謝有明顯促進作用[26-27]。GSE 組中嗜膽菌屬（Bilophila）顯著高于高脂組，它能減少肝臟脂肪的滲透，并且與糖尿病的減輕呈正相關(guān)[28-29]。

圖3 LEfSe 分析正常組（Gro1）與高脂組（Gro2）小鼠腸道菌群差異Fig.3 LEfSe analysis the differences between the gut microbiota of control group（Gro1）and high-fat diet model group（Gro2）

3 結(jié)論

本研究通過動物實驗探究了葡萄多酚降血脂的效果，并探討了葡萄多酚降血脂功能與腸道菌群相關(guān)的作用機制。發(fā)現(xiàn)葡萄皮渣多酚提取物（GPE）和葡萄籽多酚提取物（GSE）均能顯著抑制高脂飲食下小鼠的體重增加。并且GPE 能顯著降低LDL-c 水平；GSE 則可顯著降低TG、TC、LDL-c水平。因此，GPE 和GSE 有抑制高血脂的作用。此外，本實驗應(yīng)用腸道菌群測序進一步分析了葡萄多酚對高脂飲食小鼠腸道微生物的改善作用，發(fā)現(xiàn)GPE 和GSE 可以增加一些有利于降血脂的腸道菌的相對豐度。

然而，GPE 與GSE 的調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂與腸道菌群效果并不完全一致，而且腸道菌群在葡萄多酚降血脂過程中的具體作用尚不清楚，還需要繼續(xù)深入研究。