張小芳，王 欣，汪惠勤，柯李晶，高觀禎*，朱立穎*

（1浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 浙江金華 321004 2浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 310021 3浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所 杭州 310021 4 浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 杭州 310018）

人類胃、腸道內(nèi)存在大量的細(xì)菌，主要由擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）等組成，其總數(shù)達(dá)到1012～1013CFU/g 內(nèi)容物[1-2]。大量研究表明與消化、精神、免疫、內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)的多種疾病和腸道菌群失調(diào)有關(guān)[3-5]，因此，調(diào)控腸道菌群對預(yù)防慢性病發(fā)生具有重大意義。

環(huán)境因素特別是飲食模式是調(diào)節(jié)腸道菌群的關(guān)鍵因素。在正常飲食模式下，每天大約有20 g膳食纖維和2～10 g 蛋白質(zhì)能夠逃逸小腸吸收進(jìn)入結(jié)腸，成為結(jié)腸中細(xì)菌發(fā)酵的底物[6]。而細(xì)菌發(fā)酵食糜后的最主要代謝產(chǎn)物為短鏈脂肪酸（Short chain fat acid，SCFA），包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異戊酸和異丁酸[7]。其中乙酸、丙酸、丁酸是腸道細(xì)菌發(fā)酵碳水化合物的代謝產(chǎn)物[8]。異丁酸、戊酸和異戊酸是細(xì)菌發(fā)酵蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物。由于正常飲食狀態(tài)下進(jìn)入結(jié)腸的碳水化合物含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于蛋白質(zhì)，因此糞便中的異丁酸、戊酸和異戊酸含量相對較低。人類飲食模式的變化會(huì)顯著改變糞便中代謝碳水化合物和代謝蛋白質(zhì)產(chǎn)生的SCFA 的比例。比如高蛋白飲食顯著增加了糞便中異丁酸和異戊酸的含量[9]。目前對人體腸道中碳水化合物的代謝途徑研究較多，然而，對蛋白質(zhì)代謝的研究比較少。Zarling 等[10]在1987年通過氨基酸的體外發(fā)酵證明了異丁酸和異戊酸分別由腸道細(xì)菌發(fā)酵纈氨酸（Valine，Val）和亮氨酸（Leucine，Leu）后形成，奠定了支鏈氨基酸是產(chǎn)生2 種SCFA（異丁酸、異戊酸）的理論基礎(chǔ)。然而，對戊酸產(chǎn)生的底物研究相關(guān)報(bào)道較少。

目前發(fā)現(xiàn)SCFA 作為一種新型的信號(hào)分子，在維護(hù)人體健康、調(diào)節(jié)人體代謝過程中起到重要的作用[11]。乙酸進(jìn)入人體循環(huán)系統(tǒng)后作為能量來源參與機(jī)體代謝，影響人體食欲。丙酸吸收后影響膽固醇的合成與代謝。丁酸作為腸道上皮細(xì)胞線粒體呼吸的主要能量來源，在組蛋白去乙?；^程中起到重要作用，廣泛影響腸道上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞的繁殖和代謝[12]。前期研究表明，丙酸與丁酸能夠增加腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1 和組分閉合蛋白（Occludin）的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞之間的緊密連接，以及激活A(yù)MPK 介導(dǎo)緊密連接實(shí)現(xiàn)重新組裝，降低腸道通透性[13]。在炎癥性腸?。↖nflammatory bowel disease，IBD）、肥胖、2 型糖尿病和自身免疫性疾病患者中，腸道細(xì)菌降解碳水化合物產(chǎn)生丁酸的含量明顯偏低，產(chǎn)丁酸的細(xì)菌總數(shù)也異常降低，同時(shí)伴隨著腸道通透性的增加[14-17]。然而，目前SCFA 對腸道上皮細(xì)胞通透性的研究主要集中在碳水化合物發(fā)酵后產(chǎn)生的乙酸、丙酸和丁酸，對蛋白質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)生的戊酸、異丁酸和異戊酸的研究還是一片空白。

本文采用體外發(fā)酵方法研究比較人體腸道微生物對20 種氨基酸代謝的影響，通過細(xì)胞模型，研究氨基酸產(chǎn)生的SCFA 對細(xì)胞通透性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑與儀器

試驗(yàn)中使用的20 種氨基酸，包括Val、Leu、異亮氨酸（Isoleucine，Ile）、脯氨酸（Proline，Pro）、丙氨酸（Alanine，Ala）、甲硫氨酸（Methionine，Met）、甘氨酸（Glycine，Gly）、蘇氨酸（Threonine，Thr）、組氨酸（Histidine，His）、天冬氨酸（Aspartate，Asp）、酪氨酸（Tyrosine，Tyr）、谷氨酸（Glutamic acid，Glu）、賴氨酸（Lysine，Lys）、谷氨酰胺（Glutamine，Gln）、天冬酰胺（Asparagine，Asn）、色氨酸（Tryptophan，Trp）、苯丙氨酸（Phenylalanine，Phe）、精氨酸（Arginine，Arg）、半胱氨酸（Cysteine，Cys）、絲氨酸（Serine，Ser）均為色譜純級(jí)，美國Sigma 公司；4 種SCFA：丁酸、戊酸、異戊酸、異丁酸均為色譜純級(jí)，美國Sigma 公司；磷酸鹽緩沖液，生工生物股份有限公司；人結(jié)腸腺癌細(xì)胞（Caco-2），中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫；0.25%胰酶-EDTA 消化液、青霉素-鏈霉素混合液，美國Gibco 公司；DMEM培養(yǎng)基、PBS 緩沖液、HBSS 緩沖液，美國HyClone公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96 孔板、Transwell 培養(yǎng)板，美國Corning 公司；胎牛血清（FBS），以色列Biological Industries 公司。

高壓蒸汽滅菌鍋，上海博迅醫(yī)療生物儀器有限公司；分析天平，瑞士Mettler Toledo 公司；厭氧工作站，英國依萊泰科；GC2010 plus 氣相色譜儀，日本島津公司；DB-FFAP 型氣相色譜柱（0.32 mm×30 m×0.5 μm），美國Agilent 公司；MX-307 高速離心機(jī)，日本TOMY 公司；超純水儀、細(xì)胞電阻儀，美國Millipore 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 糞便樣品采集與預(yù)處理 27 例健康志愿者來自浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，男16 人，女11 人，年齡在20～55 歲。所有志愿者有近3 個(gè)月的正常飲食，在這3 個(gè)月內(nèi)沒有服用抗生素或其它藥物，也沒有接受過益生菌治療。研究人員向受試者進(jìn)行全面解釋，并給予受試者書面知情同意。

收集志愿者的糞便樣本均在6 h 內(nèi)處理結(jié)束。取3 g 糞便樣本裝入取樣管中，加入30 mL 厭氧磷酸緩沖液（PBS）配制成體積分?jǐn)?shù)10%的糞便懸液。用渦旋震蕩器（Vortex）充分振蕩使其混勻后，再用糞便處理器過濾除去糞便中未消化的大顆粒食物殘?jiān)?/p>

1.2.2 培養(yǎng)基的配制 20 種溶于水的培養(yǎng)基配制 方 法：100 mg Val、Leu、Ile、Pro、Ala、Met、Gly、Thr、His、Asp、Tyr、Glu、Lys、Gln、Asn、Trp、Phe、Arg、Cys、Ser 分別溶解于10 mL 超純水中，配制成10 g/L 的氨基酸培養(yǎng)基，500 mg 小牛血清蛋白BSA、NaCl 分別溶于10 mL 超純水中，配制成50 g/L 的對照組溶液；2 種微溶于水的氨基酸（Tyr、Asp）培養(yǎng)基配制方法：5 mg Asp 溶于1 mL 超純水中，配制成5 mg/mL Asp 培養(yǎng)基；1.25 mg Tyr 溶于5 mL PBS 溶液中，配制0.25 mg/mL Tyr 培養(yǎng)基。

1.2.3 體外發(fā)酵 參照Zarling 等[10]報(bào)道的體外發(fā)酵方法，使用前期報(bào)道過的批式發(fā)酵系統(tǒng)[18]。在厭氧工作站中，將滅菌的10 mL 西林瓶身上貼好22種培養(yǎng)基標(biāo)簽。20 種溶于水的培養(yǎng)基發(fā)酵方法：將100 μL 溶于水的20 種培養(yǎng)基分裝到對應(yīng)培養(yǎng)基標(biāo)簽的西林瓶中，接種3 mL 10%的糞便懸液，壓蓋。2 種微溶于水的培養(yǎng)基發(fā)酵方法：將200 μL Asp 培養(yǎng)基分裝到對應(yīng)培養(yǎng)基標(biāo)簽的西林瓶中，接種3 mL 10%的糞便懸液，壓蓋；稱量0.5 g糞便，加入5 mL 0.25 mg/mL Tyr 培養(yǎng)基，混勻并過濾，配制成10%Tyr/PBS 糞便懸濁液，取3 mL 分裝到對應(yīng)培養(yǎng)基標(biāo)簽的西林瓶中，壓蓋。所有西林瓶放置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在24 h 取樣。

1.3 SCFA 分析

氣相色譜檢測24 h 樣品中SCFA 的濃度。試驗(yàn)中，500 μL 發(fā)酵液樣品加入100 μL 巴豆酸，酸化24 h，離心后取上清，經(jīng)過0.22 μm 水系過濾膜，上機(jī)。過濾液通過DB-FFAP 型氣相色譜柱（0.32 mm×30 m×0.5 μm），使用氫氣火焰離子化檢測器，以巴豆酸（反式-2-丁烯酸）作為內(nèi)標(biāo)物，檢測乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸、戊酸。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

將Caco-2 細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)液為DMEM 高糖（4.5 g/L）培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%L-谷氨酰胺、青霉素100 μg/mL、鏈霉素100 μg/mL），置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱，每隔3～4 d 傳代1 次，取對數(shù)生長期細(xì)胞作后續(xù)試驗(yàn)。將狀態(tài)良好的細(xì)胞消化，吹打均勻，調(diào)節(jié)密度2×106個(gè)/mL，每孔加入2×105個(gè)細(xì)胞，同時(shí)在頂側(cè)（Apical，AP）與基底側(cè)（Basolateral，BL）加入不同SCFA（丁酸、異丁酸、異戊酸、戊酸）共同孵育72 h，頂側(cè)與基底側(cè)的SCFA 終濃度為2.5 mmol/L。在孵育過程中的24，48，72 h，測定不同SCFA（異丁酸、異戊酸、戊酸、丁酸）對Caco-2 細(xì)胞的跨膜電阻值（TEER）的影響。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過SPSS 軟件（IBM SPSS Statistics 19.0 軟件）先做方差齊性檢驗(yàn)，判斷數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布。對不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)（即方差不齊性）采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)；對符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)（即方差齊性）選擇 ANOVA-LSD 檢驗(yàn)。計(jì)算得出不同氨基酸培養(yǎng)基與對照組的SCFA濃度的顯著性差異。T 值采用雙總T 檢驗(yàn)中的獨(dú)立樣本檢驗(yàn)計(jì)算，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 人體糞便SCFA 的組成

采用氣相色譜測定27 名試驗(yàn)參與者糞便中SCFA 濃度結(jié)果見表1。

表1 濕糞便中SCFA 含量差異（±s，n=27）Table 1 Difference of SCFA content in wet feces （±s，n=27）

表1 濕糞便中SCFA 含量差異（±s，n=27）Table 1 Difference of SCFA content in wet feces （±s，n=27）

注：*.乙酸、丙酸、丁酸之和；**.異丁酸、異戊酸、戊酸之和。

蛋白酵解SCFA**含量/mmol·g-1 66.04 ±27.31指標(biāo) 總酸 乙酸 丙酸 丁酸 異丁酸 異戊酸 戊酸 糖酵解SCFA*4.26 ±4.26與總酸的摩爾比-0.67∶1 0.15∶1 0.11∶1 0.01∶1 0.03∶1 0.02∶1 0.93∶1 0.07∶1 43.40 ±16.48 10.34 ±5.16 8.04 ±6.41 0.79 ±0.58 2.08 ±3.10 1.38 ±1.11 61.79 ±25.85

2.2 人體腸道菌群發(fā)酵20 種氨基酸后SCFA 產(chǎn)量的比較

試驗(yàn)采用氣相色譜測定24 h 樣品上清液中SCFA 濃度。通過比較不同氨基酸培養(yǎng)基與對照組之間SCFA 的含量（圖1），研究發(fā)現(xiàn)在含有20 種氨基酸的培養(yǎng)基中，乙酸、丙酸、丁酸的產(chǎn)量（圖1a～1c）與對照組沒有顯著差異，提示膳食中的氨基酸可能不參與結(jié)腸內(nèi)乙酸、丙酸和丁酸的代謝合成。然而，3 種SCFA（異丁酸、異戊酸、戊酸）與對照組有顯著差異（圖1d～1f）。其中Val 培養(yǎng)基中異丁酸含量明顯高于對照組（圖1d），且有極顯著性差異（t=15.4089，P=1×10-6<0.01）。Leu 和Ile 培養(yǎng)基中，異戊酸含量明顯高于對照組（圖1e）（Leu：t=15.3183，P=1×10-6<0.01；Ile：t=16.9307，P=1×10-6<0.01；BSA：t=4.0311，P=2.651×10-4<0.01）。Pro培養(yǎng)基中戊酸含量明顯高于對照組中的戊酸，且有極顯著差異（t=12.0208，P=3×10-6<0.01）（圖1f）。該結(jié)果表明，糞便中的乙酸、丙酸、丁酸不是由氨基酸降解形成；糞便中的異戊酸是由Leu、Ile 降解形成；異丁酸是由Val 代謝形成；戊酸是由Pro 代謝產(chǎn)生。

圖1 發(fā)酵液中SCFA 含量差異Fig.1 The different of short-chain fatty acids in fermentation broth

2.3 SCFA 對Caco-2 細(xì)胞腸屏障的影響

腸道菌群代謝產(chǎn)生的短鏈脂肪酸對腸道細(xì)胞具有各種作用，其中一個(gè)重要的作用為增強(qiáng)腸道屏障[19]。本研究采用測定Caco-2 細(xì)胞跨膜電阻值（TEER） 來考察SCFA 對腸屏障的影響，TEER 越大表示通透性越差，腸屏障功能越好。結(jié)果顯示，與對照組相比，氨基酸代謝產(chǎn)生的SCFA 中，戊酸能顯著提高Caco-2 細(xì)胞跨膜電阻值（圖3a～3b），促進(jìn)Caco-2 細(xì)胞腸屏障的形成，與碳水化合物產(chǎn)生的丁酸類似，然而在相同濃度下，戊酸增強(qiáng)腸道屏障的能力較弱，需發(fā)酵48 h 后才有效果。已有許多研究表明丁酸可以促進(jìn)腸屏障的形成[13]，而戊酸對腸屏障的影響未見報(bào)道。氨基酸產(chǎn)生的另外2 種SCFA（異丁酸、異戊酸）會(huì)降低Caco-2 細(xì)胞跨膜電阻值（圖3c～3d），抑制Caco-2 細(xì)胞腸屏障的形成。Blakeney 等[20]研究報(bào)道，異戊酸可引起結(jié)腸平滑肌松弛，從而抑制腸道屏障的形成，與本研究結(jié)果一致。

3 討論與結(jié)論

糞便中SCFA 的含量和比例是人體健康的一個(gè)重要指標(biāo)，可以直接反映腸道菌群的活性和平衡。例如，在正常飲食狀態(tài)下2 型糖尿病患者糞便中乙酸和丁酸的含量顯著低于對照組的健康人群[21]。同時(shí)糞便SCFA 含量和比例還受飲食結(jié)構(gòu)的影響。Giuditta 等[22]發(fā)現(xiàn)與低熱量的地中海飲食模式相比，純素食飲食模式下糞便中乙酸和丁酸的含量下降，而異丁酸、異戊酸含量顯著增加。有報(bào)道指出健康人群糞便中碳水化合物產(chǎn)生的乙酸、丙酸和丁酸和蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生的戊酸、異戊酸和異丁酸的摩爾比值為95∶5 到90∶10[23]。而本試驗(yàn)組健康人群糞便中此物質(zhì)的摩爾比為93∶7，提示試驗(yàn)參與者的膳食組成正常。而且乙酸、丙酸、丁酸之間的摩爾比值為67∶15∶11，基本符合65∶20∶15 的比例，進(jìn)一步提示試驗(yàn)組人員腸道菌群代謝處于正常狀態(tài)。

圖2 SCFA 對Caco-2 細(xì)胞腸屏障的影響Fig.2 Effects of short-chain fatty acids on intestinal barrier of Caco-2 cells

人體腸道微生物降解氨基酸后主要代謝產(chǎn)物包括氨、生物胺、H2S 和3 種SCFA（異丁酸、異戊酸、戊酸），其中生物胺的研究已有較多報(bào)道[24-26]，然而對這3 種SCFA（異丁酸、異戊酸、戊酸）的研究相抵比較少。Shen 等[27]在2010年通過體外發(fā)酵模型對比研究了不同烹調(diào)方式下牛肉、雞肉和三文魚對人體腸道微生態(tài)和SCFA 的影響，發(fā)現(xiàn)新鮮三文魚肉顯著影響到丁酸和異丁酸的產(chǎn)生。Zarling 等[10]也是通過體外發(fā)酵試驗(yàn)證實(shí)了異丁酸和異戊酸分別由Val 和Leu 降解形成。在本研究中，研究證實(shí)了氨基酸、蛋白質(zhì)食物組分在人體腸道中對乙酸、丙酸和丁酸的形成影響很小，然而直接影響戊酸、異戊酸和異丁酸的形成。除了Leu 之外，腸道菌群發(fā)酵Ile 也可以形成異戊酸；Val 代謝產(chǎn)生異丁酸，而Pro 代謝產(chǎn)生戊酸。

3 種SCFA（異丁酸、異戊酸、戊酸）對人體健康的影響已有部分報(bào)道。例如，流行病學(xué)的證據(jù)表明戊酸和丁酸一樣對腸道健康有益[28-29]。還有研究發(fā)現(xiàn)與克羅恩病患者相比，健康人的糞便中含有更多產(chǎn)戊酸的細(xì)菌[29]。對老年人的研究發(fā)現(xiàn)，健康百歲老人的糞便中戊酸、丙酸與丁酸的濃度明顯升高[30]。Blakeney 等[20]研究報(bào)道，異戊酸可引起結(jié)腸平滑肌松弛，從而抑制腸道屏障的形成。Yuille等[31]報(bào)道戊酸能夠像丁酸一樣，在體外細(xì)胞模型中作為組蛋白去乙?；傅囊种苿┯绊懠?xì)胞的繁殖周期。因此，本研究中也利用體外細(xì)胞模型，比較了氨基酸代謝產(chǎn)物異丁酸、戊酸和異戊酸對細(xì)胞通透性的影響。研究發(fā)現(xiàn)只有戊酸能夠在體外增加Caco-2 細(xì)胞腸屏障，而異戊酸和異丁酸降低Caco-2 細(xì)胞腸屏障，并且在2.5 mmol/L 濃度下戊酸增強(qiáng)腸道屏障的能力稍弱于丁酸，丁酸增強(qiáng)腸道屏障已經(jīng)有眾多研究，其增強(qiáng)腸道屏障的機(jī)制主要通過激活A(yù)MPK 介導(dǎo)緊密連接重組裝實(shí)現(xiàn)[32]，氨基酸代謝產(chǎn)物戊酸增強(qiáng)腸道屏障為首次發(fā)現(xiàn)，相關(guān)研究有待進(jìn)一步探索，如其強(qiáng)腸道屏障的具體機(jī)理等，因其化學(xué)結(jié)構(gòu)與丁酸具有相似性，其機(jī)制可能也是通過激活A(yù)MPK 介導(dǎo)緊密連接重組裝而實(shí)現(xiàn)。戊酸對人體健康的影響逐漸受到越來越多的關(guān)注。最近有報(bào)道戊酸通過T 淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的代謝和表觀遺傳重編程發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用[33]，這些表明戊酸在人體健康中可能起正向作用。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)異丁酸、異戊酸能夠增加腸道通透性，在人體健康中可能起到反向作用。國外研究報(bào)道中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)糞便中異戊酸含量高與人體抑郁癥的發(fā)病有關(guān)[34]，結(jié)合本研究結(jié)果，提示異戊酸可能影響到腸粘膜的通透性，進(jìn)而通過腦腸軸影響到與精神系統(tǒng)有關(guān)疾病的發(fā)生。本研究中這些對人體健康起不同作用的戊酸、異戊酸、異丁酸，在腸道菌中由特定的氨基酸發(fā)酵降解而成，因此高蛋白飲食經(jīng)腸道菌發(fā)酵后對人體健康的不同影響可能與其含不同的這些特定氨基酸有關(guān)。

總之，本研究利用體外發(fā)酵模型，探究了氨基酸作為底物對腸道微生物代謝產(chǎn)物SCFA 產(chǎn)生的影響，填補(bǔ)了多年來在3 種SCFA（異丁酸、異戊酸、戊酸）底物研究上的空缺。同時(shí)采用測定細(xì)胞跨膜電阻值的方法，比較了對人體上皮細(xì)胞通透性的影響。目前的研究雖然都采用體外模型，但是研究結(jié)果為今后進(jìn)一步探究腸道菌群氨基酸代謝對機(jī)體健康狀態(tài)的影響奠定了基礎(chǔ)。