譚 穎，陳曉倩，付恒芳，朱旭萌，李 春，劉麗波

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 哈爾濱 150030）

雙歧桿菌在人腸道中發(fā)揮重要作用，與人體的正常代謝及健康密切相關(guān)。而黏附是長雙歧桿菌定植于腸道發(fā)揮作用的前提[1-7]。深入研究長雙歧桿菌的黏附能力尤為重要，只有弄清其黏附機(jī)制，才能改善在人體腸道的定植狀況。

目前報道的雙歧桿菌黏附基因有BopA、Serpin、slpA、bif 等。Guglielmetti 等[8]從雙歧桿菌MIMBb75 中分離純化出對caco-2 具有黏附作用的BopA 蛋白。Jakava-Viljanen 等[9]從雙歧桿菌ATCC8287 中篩選出slpA 表面黏附蛋白。Schell等[10]篩選出與黏附相關(guān)的Serpin 黏附蛋白。bif 黏附蛋白是Fujiwara 等[11]在長雙歧桿菌SBT2928 中發(fā)現(xiàn)的，并證明bif 黏附蛋白不僅具有黏附作用，而且對致病菌的黏附能力有抑制作用，其對產(chǎn)志賀氏菌毒素大腸桿菌的抑制作用達(dá)到50%。bif 基因總長為1 059 bp，經(jīng)NCBI 數(shù)據(jù)庫分析其為長雙歧桿菌NCC2705 編號58012118 的序列[12]。

本試驗(yàn)旨在構(gòu)建長雙歧桿菌bif 基因缺失菌株，驗(yàn)證長雙歧桿菌bif 黏附基因的黏附性能。較為常見的基因敲除方法為插入失活、RNA 干擾以及同源重組[13-15]。孫金威等[16]利用同源重組方式成功敲除了保加利亞乳桿菌的ccpA 基因序列。本試驗(yàn)以同源重組方式敲除長雙歧桿菌bif 黏附基因，為進(jìn)一步研究長雙歧桿菌bif 基因的黏附作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長雙歧桿菌C16，實(shí)驗(yàn)室自備菌株；感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌（E.coli）DH5α，維地生物；質(zhì)粒pMD19-T simple Vector、質(zhì)粒PUC18，北京寶易生物有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；DNA 純化回收試劑盒，北京天根生化科技有限公司；2×Taq Mater Mix、2×Fast Pfu Mater Mix、λ/Hind Ⅲ DNA Marker、DL5000 DNA Marker、DNA ladder2000 Marker、T4DNA 連接酶，北京寶易生物有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ、PstⅠ，北京寶易生物有限公司；四環(huán)素、氨芐青霉素，Amresco 公司。

1.2 設(shè)備與儀器

SPX-150B 生化培養(yǎng)箱，上海一恒有限公司；HIRAYAMA HVE-50 型高壓滅菌鍋，HIRAYAMA公司；GL-21M 離心機(jī)，上?；C(jī)械廠；AF100型制冰機(jī)，Scotsman 公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱、水浴鍋、9700 型PCR 擴(kuò)增儀，Applied Biosystems 公司；BA300 型數(shù)碼顯微鏡，Motic 公司；ΜVP 凝膠成像系統(tǒng)儀，ΜVP 公司；電穿孔儀、200 mm 電轉(zhuǎn)杯，Bio-Rad 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.1 目的基因的提取 采用天根試劑盒提取長雙歧桿菌C16 的基因組，以提取的基因組為模版擴(kuò)增bif 黏附基因，PCR 反應(yīng)體系：2×Taq 25 μL，上、下游引物2 μL，目的基因模板2 μL，添加ddH2O 至50 μL；PCR 反應(yīng)程序（94 ℃預(yù)變性90 s，98 ℃變性20 s，61 ℃退火20 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)30 次，72 ℃終延伸5 min，4 ℃保溫）[12]。電泳檢測成功后擴(kuò)增bif 基因的上、下游同源臂。以質(zhì)粒PBR322 為模版對tet 基因進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系：2×Pfu 25 μL，上、下游引物2 μL，目的基因模板2 μL，添加ddH2O 至50 μL；PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性90 s，94 ℃變性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)30 次，72 ℃終延伸5 min，4℃保溫；PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，切下目的片段，用瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒回收目的片段，利用2×Taq Mater Mix 進(jìn)行3'端加A。

1.3.2 目的基因與T 載體的連接及純化 將4 μL 純化的PCR 產(chǎn)物與1 μL 載體pMD19-T simple Vector 放入EP 管中，加5 μL 緩沖液，4 ℃過夜連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-T simple Vectorup、pMD19-T simple Vector-down、pMD19-T simple Vector-tet。從-80 ℃冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α，立即放在冰上緩化30 min，將連接好的重組質(zhì)粒全量10 μL 分別導(dǎo)入100 μL感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α 中，置冰上30 min 后42 ℃熱激75 s，再置冰上1 min，加入890 μL SOC培養(yǎng)基，150 r/min 振蕩培養(yǎng)1.5 h，平板涂布，37 ℃培養(yǎng)12～16 h。挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證，將陽性單菌落挑到質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的Amp液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～16 h，用快速質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒，送樣測序，將測序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)菌株比對。按照限制性內(nèi)切酶使用說明書方法用EcoRⅠ和NotⅠ對pMD19-T simple Vector-up 進(jìn)行酶切，用NotⅠ對pMD19-T simple Vector-tet進(jìn)行酶切，用NotⅠ和PstⅠ對pMD19-T simple Vector-down 進(jìn)行酶切，用EcoRⅠ和PstⅠ對質(zhì)粒PUC18 雙酶切處理。

1.3.3 基因片段的連接及純化 將up、down、tet和載體PUC18 的酶切純化產(chǎn)物按照T4DNA 連接酶使用說明書連接（16 ℃連接6 h），構(gòu)成敲除載體PUC18-up-tet-down，再將敲除載體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α 中培養(yǎng)（方法參照1.3.2 節(jié)）。菌落PCR 驗(yàn)證成功后，提取敲除載體，電泳檢測提取產(chǎn)物，進(jìn)行酶切純化。以純化產(chǎn)物為模版，以bif 基因序列的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，電泳檢測PCR條帶，切膠回收條帶，將純化的基因條帶送樣測序。將測序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)序列比對，若測序結(jié)果正確，將未酶切的敲除載體導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α，驗(yàn)證敲除載體的穩(wěn)定性。

1.3.4 敲除載體的轉(zhuǎn)化

1）線性打靶片段的構(gòu)建 以構(gòu)建好的敲除片段為模版，以bif-F1 和bif-R1 為引物擴(kuò)增線性打靶片段（PCR 反應(yīng)體系：2×Fast Pfu 25 μL，模版1 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，加ddH2O 至50 μL）。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性90 s，98 ℃變性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次，72 ℃終延伸5 min，4 ℃保溫[17]。電泳檢測PCR產(chǎn)物，后切膠回收。

2）感受態(tài)的制備 將長雙歧桿菌涂布于平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h，鏡檢單菌落。將確認(rèn)無雜菌的長雙歧桿菌傳代培養(yǎng)至第2 代，將二代菌用含0.5%的甘氨酸的Tpy 培養(yǎng)基培養(yǎng)至吸光度為0.5 A，冰浴30 min 使菌體停止生長，取10 mL 菌液6 000 r/min 離心10 min，棄上清，加同體積的滅菌并冰浴的去離子水，6 000 r/min 離心10 min，重復(fù)上一步，用同體積的30%PEG-8000 懸浮菌體6 000 r/min 離心10 min，棄上清，再用200 μL 30%PEG-8000 懸浮菌體，后立即進(jìn)行電轉(zhuǎn)化[18]。

3）電轉(zhuǎn)化 取2 μL 重組質(zhì)粒和5 μL 線性打靶片段與200 μL 感受態(tài)細(xì)胞混合后轉(zhuǎn)移到電轉(zhuǎn)杯中，在2.5 kV/cm 電壓下進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，立即放入900 μL 復(fù)蘇培養(yǎng)基（含有0.5 mol/L 蔗糖的Tpy 培養(yǎng)基）中，37 ℃孵育2 h。孵育完成后，5 000 r/min離心1 min，吸出800 μL 培養(yǎng)液，吸取剩余培養(yǎng)液100 μL 涂布于含有四環(huán)素（5 μg/mL）的固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h[19]。

4）基因缺失菌株篩選及驗(yàn)證 在平板上挑取單菌落作為菌落PCR 模板，電泳檢測PCR 產(chǎn)物，平板涂布陽性克隆菌株，挑取單菌落，接種到5 mL Tpy 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)后提取基因組。以提取的基因組為模板，擴(kuò)增打靶片段。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將上一步所得陽性菌落傳代培養(yǎng)，以提取基因組DNA 為模版，分別用bif-F、tet-R 和tet-F、bif-R 為引物做交叉驗(yàn)證試驗(yàn)，電泳檢測目的基因條帶[16]。

1.3.5 技術(shù)路線圖 見圖1。

圖1 試驗(yàn)技術(shù)路線圖Fig.1 The experiment technology roadmap

2 結(jié)果與分析

2.1 長雙歧桿菌DNA 的提取結(jié)果

選取分離自健康嬰兒腸道內(nèi)具有高黏附性的長雙歧桿菌C16 為研究對象，用試劑盒提取長雙歧桿菌C16 的DNA，如圖2所示，用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在23.1 kb 下方得到長雙歧桿菌基因序列條帶。由此表明按照細(xì)菌基因組DNA 試劑盒說明書操作可以提取出長雙歧桿菌C16 的全基因組。

圖2 細(xì)菌基因組DNAFig.2 Bacterial genomic DNA

2.2 基因片段純化回收

圖3電泳結(jié)果顯示，在1 000 bp 處檢測出清晰的目的基因條帶，與bif 黏附基因大小基本相同，切膠回收bif 黏附基因片段，電泳檢測回收條帶并送樣測序。將測序結(jié)果與bif 黏附基因標(biāo)準(zhǔn)序列對比，相似度為99.92%，由此表明長雙歧桿菌C16 中含有bif 黏附基因。彭珍[12]以長雙歧桿菌WBLO01 的DNA 為模版，擴(kuò)增出bif 黏附基因。本試驗(yàn)根據(jù)GenBank 報道的長雙歧桿菌bif 黏附基因序列設(shè)計(jì)特異性引物。擴(kuò)增出目的基因條帶的同時含有明顯的雜帶，可能是因遺傳序列具有高度保守性，引物發(fā)生改變而使其特異性下降，導(dǎo)致引物與基因間發(fā)生非特異性結(jié)合，擴(kuò)增出非目的基因片段，因此含有明顯雜帶。此結(jié)果與Ruiz-Villalba 等[20]研究結(jié)果一致，退火溫度決定PCR 特異性及產(chǎn)量，退火溫度低造成引物與模版錯配，發(fā)生非特異性結(jié)合；退火溫度高，特異性增強(qiáng)，而退火過高會影響引物與模版的結(jié)合，因此應(yīng)選擇合適的退火溫度。將退火溫度60 ℃提至61 ℃，成功擴(kuò)增出單一的bif 黏附基因條帶。

圖3 目的基因PCR（a）及純化（b）結(jié)果Fig.3 Target gene PCR（a） and purification（b） results

如圖4所示，以擴(kuò)增出的bif 黏附基因?yàn)槟０?，擴(kuò)增其的上、下游同源臂，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在250 bp 上端發(fā)現(xiàn)清晰的目的基因條帶。切膠純化回收基因片段，為bif 黏附基因上、下游同源臂與t 載體pMD19-T simple Vector 連接做準(zhǔn)備。

圖4 目的基因上（a）、下（b）游PCR 純化結(jié)果Fig.4 PCR purification results of the upstream（a）and downstream（b） target gene

如圖5所示，在1 000 bp 上部發(fā)現(xiàn)清晰的基因條帶，表明成功擴(kuò)增出tet 抗性基因片段，切膠回收，為tet 抗性基因與t 載體pMD19-T simple Vector 連接做準(zhǔn)備。限制性內(nèi)切酶Not Ⅰ全部由堿基CG 組成，提高了引物中的CG 的含量。當(dāng)GC含量在70%以上時，用普通PCR 條件難以擴(kuò)增出目的基因片段。因?yàn)镚、C 之間形成3 對氫鍵，解鏈所需能量較高，所以模板較難打開，并且單鏈的GC 豐富區(qū)容易自身互補(bǔ)配對形成引物二聚體，不能與模版結(jié)合，DNA 聚合酶也難于延伸或停止延伸，出現(xiàn)嚴(yán)重的非特異性條帶，甚至擴(kuò)增不出靶基因[21]。本試驗(yàn)在引物兩端加入保護(hù)堿基序列來降低引物中的GC 含量，參照2×Fast Pfu PCR 試劑盒說明書將變性溫度調(diào)至94 ℃，退火溫度調(diào)至58℃，成功擴(kuò)增出正確的tet 抗性基因片段。利用2×Taq Mater Mix 擴(kuò)增出3' 端含有A 的tet 抗性基因片段。

圖5 tet 抗性基因PCR（a）及純化（b）結(jié)果Fig.5 Resistance gene PCR（a）and the purification（b） results

2.3 基因片段的連接及酶切

如圖6所示，bif 黏附基因上、下游同源臂和tet 抗性基因片段成功連接到t 載體pMD19-T simple Vector 上，分別形成重組質(zhì)粒pMD19-Tup、pMD19-T-down、pMD19-T-tet。采用pMD19-T通用引物測序。將測序報告與bif 黏附基因上、下游同源臂和tet 抗性基因比對，結(jié)果顯示：bif 黏附基因上、下游同源臂與標(biāo)準(zhǔn)序列相似度都為100%，tet 抗性基因與標(biāo)準(zhǔn)序列相似度為99.88%。本試驗(yàn)選取t 載體pMD19-T simple Vector 的原因是pMD19-T simple Vector 上包括EcoRⅠ、NotⅠ和PstⅠ在內(nèi)的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)均被消除，若連接在t 載體上的片段是bif 黏附基因上、下游同源臂和tet 抗性基因片段，則保證重組質(zhì)粒上只會含有一個特異性酶切位點(diǎn)，連接失敗，限制性內(nèi)切酶無法切開重組質(zhì)粒[22]。

圖6 bif 粘附基因上、下游及抗性基因連接結(jié)果Fig.6 Upstream and downstream and resistance gene junction results of bif adhesion gene

如圖7和圖8所示，利用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ和PstⅠ成功從3 種重組質(zhì)粒上切下bif黏附基因，基因上、下游同源臂及tet 抗性基因片段。遵從Gawin 等[23]的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)原則（切位點(diǎn)選擇的基本原則是酶切位點(diǎn)單一，基因內(nèi)部不能含有酶切位點(diǎn)，酶切效率高以及所有限制性內(nèi)切酶公用buffer）選取EcoRⅠ、NotⅠ及PstⅠ為本試驗(yàn)的限制性內(nèi)切酶。在bif 黏附基因上游同源臂兩端加入EcoRⅠ和NotⅠ，在下游兩端加入NotⅠ和PstⅠ，在tet 抗性基因兩端加入NotⅠ。限制性內(nèi)切酶標(biāo)準(zhǔn)用量是0.1 μL 切100 ng 的DNA。用量過低無法切開重組質(zhì)粒，用量過高會將重組質(zhì)粒切成若干片段。酶切體系中的甘油含量控制在5%，其過高導(dǎo)致限制性內(nèi)切酶失活，影響酶切效率。本試驗(yàn)改進(jìn)了傳統(tǒng)方法，即提高限制性內(nèi)切酶用量至0.12 μL，切100 ng DNA，用超純水替代洗脫緩沖液作為重組質(zhì)粒溶劑，成功切開重組質(zhì)粒。

圖7 bif 粘附基因上（a）、下（b）游質(zhì)粒酶切結(jié)果Fig.7 The digestion results of upstream（a）and downstream（b） plasmid of bif adhesion gene

圖8 tet 抗性基因質(zhì)粒酶切結(jié)果Fig.8 The digestion results of plasmid of tet resistance gene

2.4 敲除載體的構(gòu)建

圖9表明通過T4DNA 連接酶成功將bif 黏附基因上、下游同源臂和tet 抗性基因連接到載體PUC18 上構(gòu)成敲除載體PUC18-up-tet-down。采用通用引物對敲除載體測序，測序報告與敲除片段up-tet-down 標(biāo)準(zhǔn)序列相似度為99.78%。再次將構(gòu)建成功的敲除載體PUC18-up-tet-down 轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α 中，重復(fù)上述步驟，檢測敲除載體的穩(wěn)定性。此結(jié)果與萬翠香等[24]的研究結(jié)果一致。

圖9 重組質(zhì)粒質(zhì)粒連接結(jié)果Fig.9 The ligation results of recombinant plasmid

2.5 基因缺失菌株鑒定結(jié)果

挑取電轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)成的單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，引物為bif-F 和bif-R，若發(fā)生同源交換，則擴(kuò)增出長度為1 800 bp 的片段；若未能發(fā)生同源交換，則擴(kuò)增出長度為1 059 bp 的片段。如圖10所示，1 號泳道成功擴(kuò)增出1 800 bp 的片段。2 號泳道同時擴(kuò)增出1 800 bp 和1 059 bp 的片段。3號以及4 號泳道只擴(kuò)增出1 059 bp 的片段。決定電轉(zhuǎn)化成功率的一大關(guān)鍵因素是細(xì)胞弱化劑。長雙歧桿菌是革蘭氏陽性菌，細(xì)胞壁較厚，本試驗(yàn)用甘氨酸為細(xì)胞壁弱化劑，將細(xì)胞壁肽橋之間的丙氨酸置換，阻礙細(xì)胞壁的修復(fù)與合成，在細(xì)胞壁上形成孔洞，提高電轉(zhuǎn)化的成功率[25]。決定電轉(zhuǎn)化成功率的另一因素是電壓，電壓太低導(dǎo)致細(xì)胞壁難以形成通道，敲除載體難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部；電壓太高會擊穿菌體細(xì)胞，導(dǎo)致菌體死亡，影響菌體生長。達(dá)到長雙歧桿菌最佳電轉(zhuǎn)效率的電場強(qiáng)度為2.5 kV/cm[18]。3 號和4 號泳道說明該宿主細(xì)菌的細(xì)胞壁上因甘氨酸處理不徹底而導(dǎo)致無法形成通道，敲除載體和打靶片段難以進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)部。1 號泳道說明打靶片段與bif 黏附基因成功完成同源交換，而2 號泳道說明雖然敲除載體和打靶片段進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)部，但未完成同源交換，這是因?yàn)檫z傳序列有高度的保守性，打靶片段上雖有bif 黏附基因的同源序列，但不能完全保證其能整合到宿主基因上，由此表明通過同源重組的方法將打靶片段整合到宿主基因上的成功率并不是100%，存在一定的概率性[26]。

圖10 菌落PCR 驗(yàn)證結(jié)果Fig.10 PCR verification results of colony

對擴(kuò)增出正確片段的1 號泳道對應(yīng)的菌落用含tet 抗生素（10 ng/μL）的Tpy 培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，提取DNA 進(jìn)行PCR 驗(yàn)證。圖11電泳結(jié)果顯示：在2 000 bp 下方成功擴(kuò)增出長度約1 800 bp 基因條帶，切膠回收片段，測序報告與打靶片段標(biāo)準(zhǔn)序列相似度為99.88%。

圖11 bif 突變菌株P(guān)CR 驗(yàn)證結(jié)果Fig.11 PCR results of bif mutant strain

2.6 PCR 驗(yàn)證

如圖12所示，利用兩對引物分別成功擴(kuò)增出長度為1 491 bp 的片段。本試驗(yàn)采用孫金威等[16]的PCR 交叉驗(yàn)證方式對基因缺失菌株進(jìn)行驗(yàn)證，如果打靶片段整合到宿主DNA 上，則用bif-F 和tet-R 為引物擴(kuò)增出長度為1 491 bp 的基因片段。此結(jié)果與孫金威等[16]研究結(jié)果一致，說明打靶片段up-tet-down 成功整合到宿主DNA 上。

圖12 PCR 交叉驗(yàn)證Fig.12 PCR cross validation

3 結(jié)論

本試驗(yàn)成功擴(kuò)增出長雙歧桿菌C16 的bif 黏附基因，以此為基礎(chǔ)成功擴(kuò)增出該菌bif 黏附基因的上、下游同源臂，重組質(zhì)粒pMD19-T simple Vector-up、pMD19-T simple Vector-down、pMD19-T simple Vector-tet。在此基礎(chǔ)上酶切出上、下游同源臂及tet 抗性基因，并成功將上、下游同源臂及tet 抗性基因片段連接到載體PUC18 上，利用電轉(zhuǎn)化的方式將敲除載體PUC18-up-tet-down 以及打靶片段up-tet-down 導(dǎo)入感受態(tài)長雙歧桿菌中，實(shí)現(xiàn)其bif 黏附基因的敲除，為進(jìn)一步研究長雙歧桿菌bif 基因的黏附作用奠定基礎(chǔ)。