亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        DPA體外抗炎活性及機(jī)制研究

        2021-08-11 09:33:12鄭振霄戴志遠(yuǎn)
        中國食品學(xué)報 2021年7期
        關(guān)鍵詞:分泌量抗炎磷酸化

        鄭振霄,朱 凱,戴志遠(yuǎn)*

        (1浙江工商大學(xué)海洋食品研究院 杭州 310012 2浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點實驗室 杭州 310012)3 浙江工商大學(xué) 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 杭州 310012)

        炎癥是活體組織對有害刺激的一種保護(hù)性生理反應(yīng),通常情況下,炎癥反應(yīng)是為了清除有害刺激并促進(jìn)傷口愈合。然而,持續(xù)的炎癥反應(yīng)會損傷機(jī)體[1-3]。由于快節(jié)奏的生活方式,導(dǎo)致出現(xiàn)更多不健康的飲食方式和不規(guī)律的作息時間,使人們體內(nèi)發(fā)生炎癥的概率大幅增加。如果炎癥得不到有效控制,很容易引發(fā)癌癥、心血管疾病和代謝疾病等惡性疾病,嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量[4-7]。目前,市面上用于消炎的多數(shù)為西藥制劑,這些制劑雖具有一定的消炎作用,但副作用、耐藥性等問題不容忽視。

        近年來,隨著人們對n-3 多不飽和脂肪酸(n-3PUFA)研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)n-3PUFA【主要指二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、二十二碳六烯酸(DHA)】之所以對人體產(chǎn)生有益作用,與它們具有的抗炎作用是分不開的。此外,n-3PUFA 是天然存在于自然界中的物質(zhì),長期服用幾乎不會對人體產(chǎn)生毒副作用,因此,對n-3PUFA 抗炎活性及機(jī)制的研究成為熱點[8]。目前,相關(guān)研究主要集中在EPA 和DHA 上,對DPA 相關(guān)活性及機(jī)制的研究非常少。這主要是因為DPA 與EPA 和DHA 的結(jié)構(gòu)性質(zhì)相似,難以獲得DPA 純品。二十二碳五烯酸(DPA)是α-亞麻酸(ALA)經(jīng)過碳鏈加長酶、去飽和酶和β-氧化代謝而成,存在于金槍魚、三文魚等深海魚類及海豹、海狗等海洋哺乳動物中,含量一般在2%~7%,此外在動物瘦肉、牛乳中也有少量分布[9]。

        本文以脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的RAW264.7 為炎癥的體外模型,采用本實驗室自制的DPA 純品對其進(jìn)行干預(yù),通過炎癥介質(zhì)和炎癥因子評價DPA的抗炎能力,并從NF-κB 代謝通路的角度探索DPA 體外抗炎活性機(jī)制,旨在為DPA 后續(xù)的研究提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        DPA 乙酯(純度>97%)由本實驗室自制,制備方法參考文獻(xiàn)[10];RAW264.7 細(xì)胞,中科院上海生命科學(xué)研究院(110642);DMEM 高糖培養(yǎng)基,??寺∩锘瘜W(xué)制品(北京)有限公司;胎牛血清,浙江天杭生物科技股份有限公司;PGE2、TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-10 試劑盒,美國R&D 公司。

        1.2 試劑

        LPS(分析純),北京索萊寶科技有限公司;95%乙醇(分析純),杭州雙林化工試劑廠;異丙醇(分析純)、氯仿(分析純),國藥集團(tuán)(上海)有限公司。

        1.3 儀器與設(shè)備

        恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(E163302)、臺式低溫高速離心機(jī)(Micro17R),美國Thermo Fisher Scientific 公司;恒溫水浴鍋(DKS-12),上海森信實驗儀器有限公司;凈化生物超凈工作臺(YJ-840),蘇州凈化設(shè)備有限公司;倒置顯微鏡(TS2),日本尼康株式會社;PCR 儀(T100)、熒光定量PCR 儀(CFX96),美國Bio-Rad 公司。

        1.4 方法

        細(xì)胞培養(yǎng)和干預(yù):RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)液中(含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基),并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37 ℃,5%CO2),每2 d傳代1 次。

        n-3PUFA 工作液的制備:用乙醇將EPA、DPA和DHA 溶解,配制成20 mmol/L 的母液,之后取適量母液,加到細(xì)胞培養(yǎng)液中制得60 μmol/L 的EPA、DPA 和DHA 工作液。

        試驗分組:1)細(xì)胞培養(yǎng)在含有0.8 μg/mL LPS和60 μmol/L EPA 的細(xì)胞培養(yǎng)液中24 h(EPA組);2)細(xì)胞培養(yǎng)在含有0.8 μg/mL LPS 和60 μmol/L DPA 的細(xì)胞培養(yǎng)液中24 h(DPA 組);3)細(xì)胞培養(yǎng)在含有0.8 μg/mL LPS 和60 μmol/L DHA的細(xì)胞培養(yǎng)液中24 h(DHA 組);4)細(xì)胞培養(yǎng)在含有0.8 μg/mL LPS 的細(xì)胞培養(yǎng)液中24 h(LPS 組);5)細(xì)胞培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)液中24 h(對照組);LPS、EPA、DPA 和DHA 的作用濃度由前期的MTT 實驗確定。

        NO 測定采用Griess 法;PGE2、TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-10 分泌量的測定參照試劑盒上的說明書進(jìn)行。TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-10 表達(dá)量的測定采用RT-qPCR 方法。Western blot 檢測由谷歌生物科技有限公司完成。

        1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

        相關(guān)測定數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。采用SPSS 21.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析,采用Origin 9.0 軟件進(jìn)行繪圖。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 DPA 對NO 分泌和iNOS 表達(dá)的影響

        NO 是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的氣態(tài)內(nèi)源性信號分子,在免疫反應(yīng)中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用,NO 在正常細(xì)胞內(nèi)的含量很少,炎癥會誘導(dǎo)細(xì)胞合成較多的一氧化氮合酶(iNOS),產(chǎn)生大量的NO[11]。不同處理條件下細(xì)胞分泌的NO 的量如圖1a 所示,NO 在LPS 組中的分泌量最高,EPA、DPA 和DHA干預(yù)能夠顯著降低NO 的分泌量。以LPS 組NO的分泌量為100%,EPA、DPA 和DHA 處理后,NO的分泌量分別下降到46.63%,23.95%和24.81%,這說明DPA 和DHA 比EPA 更能夠抑制NO 的分泌。對照組中NO 的分泌量最低,僅為LPS 組的5.16%。由于NO 是由iNOS 誘導(dǎo)產(chǎn)生,不同分組中iNOS 的表達(dá)水平通過Western blot 方法檢測,結(jié)果如圖1b 所示,結(jié)果與NO 分泌量結(jié)果相似。

        圖1 DPA 對NO 產(chǎn)量及iNOS 表達(dá)的影響Fig.1 Effect of DPA on the production of NO and expression of iNOS

        2.2 DPA 對PGE2 分泌和COX-2 表達(dá)的影響

        PGE2 是類花生酸中的重要成員,對炎癥的發(fā)生和發(fā)展具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)作用,可以間接反映體內(nèi)炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度,由花生四烯酸在環(huán)氧合酶-2(COX-2)催化下生成[12-13]。不同處理對細(xì)胞中PGE2 分泌的影響如圖2a 所示。LPS 組中PGE2的分泌量最高,EPA、DPA 和DHA 處理后PGE2的分泌量均有顯著下降。以LPS 組中的分泌量為100%,EPA、DPA 和DHA 處理后,PGE2 的分泌量分別下降到52.24%,38.18%和42.31%,這說明DPA 抑制PGE2 分泌的能力最強(qiáng),DHA 次之,EPA最弱。不同處理對細(xì)胞中COX-2 表達(dá)的影響如圖2b 所示,結(jié)果與PGE2 結(jié)果具有一致性。

        圖2 DPA 對PGE2 產(chǎn)量及COX-2 表達(dá)的影響Fig.2 Effect of DPA on the production of PGE2 and expression of COX-2

        2.3 DPA 對炎癥因子分泌量的影響

        不同處理條件對細(xì)胞中炎癥因子(TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-10)分泌的影響如圖3所示。對于TNF-α,LPS 組中的分泌量最高,EPA、DPA 和DHA 處理后,細(xì)胞中TNF-α 的分泌量均有下降,其中DPA 和DHA 的抑制作用強(qiáng)于EPA,而兩者之間沒有顯著差異(P<0.05)。IL-1β 在LPS 組中的分泌量最高,EPA、DPA 和DHA 處理均可以有效抑制其分泌,其中DPA 的抑制能力最強(qiáng),DHA 次之,EPA 較弱。IL-6 在LPS 組中的分泌量也最高,EPA、DPA 和DHA 處理均可以顯著抑制其分泌,而三者之間無顯著差異(P<0.05)。對于抗炎因子IL-10 來講,其分泌量在LPS 組中最低,EPA、DPA和DHA 處理組中的分泌量顯著高于LPS 組,其中DPA 組的含量要顯著高于EPA 和DHA 組。

        圖3 DPA 對炎癥因子產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of DPA on the production of inflammatory cytokines

        2.4 DPA 對炎癥因子mRNA 表達(dá)的影響

        不同處理對炎癥因子(TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-10)mRNA 表達(dá)量的影響如圖4所示。促炎因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 的mRNA 表達(dá)量在LPS組中均最高,EPA、DPA 和DHA 處理后,促炎因子mRNA 表達(dá)量均有所下降,其中DPA 處理對IL-1β 的基因表達(dá)量的抑制作用最強(qiáng),顯著強(qiáng)于EPA和DHA。對于抗炎因子IL-10,其基因的表達(dá)量在LPS 組中最低,在DPA 組中最高,其次是DHA 和EPA。

        圖4 DPA 對炎癥因子mRNA 表達(dá)量的影響Fig.4 Effect of DPA on mRNA expression of inflammatory cytokines

        2.5 DPA 對NF-κB 代謝通路的影響

        核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(Nuclear transcription factor-κB,NF-κB) 是一類關(guān)鍵性的轉(zhuǎn)錄因子,通常以二聚體(p50 和p65)非活性形式存在于幾乎所有類型細(xì)胞的胞質(zhì)中,具有十分重要的功能。它與免疫細(xì)胞的活化、T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞的發(fā)育、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等多種細(xì)胞活動有關(guān),正常情況下,NF-κB 與其遏制蛋白IκB 在胞漿中以無活性的三聚體形式存在,炎癥發(fā)生時,NF-κB發(fā)生磷酸化激活,使其從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位于細(xì)胞核,與NF-κB 反應(yīng)性基因的κB 位點結(jié)合激活細(xì)胞中的促炎基因,引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)[14-17]。因此,檢測p50和p65 的磷酸化水平可以反映細(xì)胞中NF-κB 代謝通路的活化水平,從而反映炎癥反應(yīng)水平。DPA對NF-κB 代謝通路中p50 和p65 的磷酸化水平的影響如圖5所示。LPS 組中p50 的磷酸化水平最高,p-p50/p50 的值高達(dá)0.67,顯著高于其它組;EPA、DPA 和DHA 干預(yù)可以顯著抑制p50 的磷酸化,其中DPA 對p50 磷酸化的抑制作用最明顯(p-p50/p50 的值為0.12),DHA 次之(p-p50/p50的值為0.24),EPA 最弱(p-p50/p50 的值為0.37)。p65 的檢測結(jié)果和p50 具有一致性。

        圖5 DPA 對p50(a)和p65(b)磷酸化的影響Fig.5 Effect of DPA on the phosphorylation of p50(a) and p65(b)

        3 討論

        本文以LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞為炎癥的體外模型,采用DPA 對其進(jìn)行干預(yù),并以炎癥介質(zhì)(NO 和PGE2)和炎癥因子(TNF-α,IL-1β,IL-6 和IL-10)的分泌量為指標(biāo),評價了DPA 的體外抗炎活性,然后從NF-κB 代謝通路中關(guān)鍵蛋白的磷酸化角度探索了DPA 抗炎的作用機(jī)制,為DPA 功能的開發(fā)及后續(xù)研究提供了參考。

        在炎癥反應(yīng)過程中,LPS 作為一種內(nèi)毒素會導(dǎo)致促炎介質(zhì)NO 和PGE2 的過量分泌,其中NO是由iNOS 作為限速酶參與合成的,而PGE2 則是由COX-2 作為限速酶參與合成的。NO 是炎癥反應(yīng)中的重要炎癥介質(zhì),無論急性炎癥反應(yīng)或慢性炎癥反應(yīng)過程都會伴隨NO 的過量分泌[18],因此NO 和iNOS 常用來評價炎癥反應(yīng)的發(fā)生程度。PGE2 是類花生酸中的重要一員,是花生四烯酸(AA)經(jīng)COX-2 合成的[19],對炎癥具有一定促進(jìn)作用。因此,PGE2 和COX-2 產(chǎn)量可以反映炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度。在本文中,通過LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞作為炎癥的體外模型,并以NO、PGE2、iNOS 和COX-2 為指標(biāo)評價了DPA 的體外抗炎效果,并與EPA 和DHA 進(jìn)行比較,結(jié)果表明,DPA 和DHA均具有明顯的抗炎效果,這種效果強(qiáng)于EPA。

        除了NO、PGE2 這些炎癥介質(zhì)外,促炎因子(TNF-α、IL-1β 和IL-6)和抗炎因子(IL-10)之間的平衡在炎癥反應(yīng)中也發(fā)揮了很重要的作用。TNF-α 是炎癥因子網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵因子,可以誘導(dǎo)IL-1β 和IL-6 的產(chǎn)生,增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的敏感性。此外,TNF-α 是一種內(nèi)生性的致熱源,可以導(dǎo)致發(fā)熱,刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌一系列的炎癥因子,這些物質(zhì)反過來又會誘導(dǎo)TNF-α 的產(chǎn)生。IL-1 是最早發(fā)現(xiàn)的白介素,幾乎所有的體細(xì)胞都可以合成該因子,而巨噬細(xì)胞是它的主要合成場所。IL-1 有ILα 和IL-β 兩種,其中IL-1β 最為常見,對中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞有趨化作用,大量的IL-1β 進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)引起發(fā)熱。此外,IL-1β 還可以刺激免疫細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì),激活轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控與炎癥相關(guān)代謝通路。因此,IL-1β 是體內(nèi)誘導(dǎo)作用最強(qiáng)的炎癥介質(zhì)之一,是調(diào)控局部和全身炎癥中關(guān)鍵的炎性細(xì)胞因子。IL-6 是一類分子質(zhì)量在21~28 ku 之間的糖蛋白,IL-6 在炎癥反應(yīng)中的作用機(jī)制復(fù)雜,它既可以觸發(fā)促炎的級聯(lián)反應(yīng),同時又參與抗炎反應(yīng),然而多數(shù)研究認(rèn)為過量的IL-6會起到促炎作用。IL-10 是由巨噬細(xì)胞、B 細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有多種功效的抗炎因子,它的抗炎作用是通過抑制NF-κB 信號通路的活化,降低促炎因子TNF-α、IL-1β 等的釋放而發(fā)揮作用的。此外,IL-10 在臨床上經(jīng)常作為判斷病毒性流感、腎小球疾病、慢性腎衰竭尿毒癥及HIV發(fā)生程度的指標(biāo)。正常情況下,機(jī)體中的促炎和抗炎因子處在一種動態(tài)平衡的狀態(tài),當(dāng)受到外界有害因素誘導(dǎo)時,促炎因子的合成量會大幅增加,抗炎因子的合成會相應(yīng)減少,這樣就導(dǎo)致機(jī)體炎癥的發(fā)生,嚴(yán)重時會誘發(fā)相關(guān)病變[20]。本研究通過分析樣品中炎癥因子分泌量及相應(yīng)mRNA 表達(dá)量的差別,評價了DPA 的抗炎效果,并與EPA 和DHA 進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)DPA 可以有效降低促炎因子mRNA 的表達(dá)及合成,增加抗炎因子mRNA 的表達(dá)及合成,此外,DPA 在抑制IL-1β 和促進(jìn)IL-10方面獨具特效。

        為進(jìn)一步解釋DPA 抗炎的分子機(jī)制,以與炎癥密切相關(guān)的NF-κB 信號通路為切入點,研究了DPA 等n-3PUFA 對該信號通路中關(guān)鍵蛋白p50和p65 磷酸化的影響。結(jié)果表明,DPA 可以通過抑制NF-κB 信號通路上的IκB 降解,進(jìn)而抑制p50/p65 入核與炎癥基因作用位點的結(jié)合發(fā)揮抗炎功效,并且這種抑制效果要顯著強(qiáng)于EPA。然而,n-3PUFA 抗炎的分子作用機(jī)制十分復(fù)雜,涉及到多種機(jī)制的共同作用。新的研究表明,DPA 等n-3PUFA 在代謝過程中可以產(chǎn)生消散素、保護(hù)素等特殊的消退介質(zhì)(Specialized pro-resolution mediators,SPMs),這些介質(zhì)可以通過抑制NF-κB 信號通路的活化,調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活性,增加對炎癥因子的吞噬作用而發(fā)揮強(qiáng)的抗炎功效[21-22]。Arita 等[23]采用EPA 來源的消退素RvE1 對大鼠結(jié)腸炎進(jìn)行干預(yù),結(jié)果表明RvE1 可以顯著提高大鼠的存活率,維持大鼠體重,改善組織病理評分,降低白細(xì)胞浸潤,下調(diào)促炎因子,如TNF-α、IL-12 以及NOS 基因的表達(dá)。Janakiram 等[24]的研究表明這些特殊的消退介質(zhì)可以顯著緩解皮膚炎癥、腹膜炎和樹突細(xì)胞轉(zhuǎn)移等癥狀,在結(jié)腸炎方面,甚至可以緩解結(jié)腸炎向癌癥的轉(zhuǎn)變。此外,不同的n-3PUFA 產(chǎn)生SPMs 途徑不同,產(chǎn)物也不盡相同,有研究表明這些消退介質(zhì)所發(fā)揮的抗炎功效甚至比它們的前體還要強(qiáng)[25]。因此,EPA、DPA 和DHA 在抗炎功效方面的差異也很有可能與它們代謝所產(chǎn)生的SPMs不同有關(guān)。

        4 結(jié)論

        本文以LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 為炎癥的體外模型,研究了DPA 的體外抗炎特性,并與EPA 和DHA 進(jìn)行比較。結(jié)果表明,DPA 可以通過調(diào)節(jié)炎癥因子(TNF-α,IL-1β,IL-6 和IL-10)和炎癥介質(zhì)(NO 和PGE2)的分泌發(fā)揮抗炎作用,并且,DPA 在抑制促炎物質(zhì)IL-1β 和PGE2 以及促進(jìn)抗炎物質(zhì)IL-10 的分泌方面獨具特效。Western-blot的結(jié)果表明,DPA 可以有效抑制NF-κB 信號通路中p50 和p65 的活化,這可能是其發(fā)揮抗炎效果的分子作用機(jī)制。

        猜你喜歡
        分泌量抗炎磷酸化
        口水白流
        手術(shù)室護(hù)理對剖宮產(chǎn)術(shù)后乳汁分泌時間及分泌量的影響評價
        婚育與健康(2024年2期)2024-02-25 02:11:01
        手術(shù)室護(hù)理對剖宮產(chǎn)術(shù)后乳汁分泌時間及分泌量的影響
        秦艽不同配伍的抗炎鎮(zhèn)痛作用分析
        ITSN1蛋白磷酸化的研究進(jìn)展
        牛耳楓提取物的抗炎作用
        中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:20
        短柱八角化學(xué)成分及其抗炎活性的研究
        中成藥(2017年10期)2017-11-16 00:50:09
        熏硫與未熏硫白芷抗炎鎮(zhèn)痛作用的對比研究
        中藥與臨床(2015年5期)2015-12-17 02:39:30
        MAPK抑制因子對HSC中Smad2/3磷酸化及Smad4核轉(zhuǎn)位的影響
        脂多糖對氣道上皮細(xì)胞分泌炎癥因子的影響*
        亚洲夫妻性生活免费视频| 亚洲高清视频在线播放| 成人影院免费观看在线播放视频 | 日中文字幕在线| 久久精品人妻嫩草av蜜桃| 国产一区二区三区天堂| 男人进去女人爽免费视频| 天天av天天爽无码中文| 亚洲伊人久久综合精品| 亚洲精品中文字幕视频色| 成人毛片av免费| 欧美在线区| 一个人的视频免费播放在线观看| 人妻少妇中文字幕久久| 亚洲看片lutube在线观看| 草莓视频一区二区精品| 亚洲中文字幕日本日韩| 中文字幕亚洲综合久久天堂av | 99亚洲精品久久久99| 韩国三级大全久久网站| 青青草视频在线观看入口| 亚洲国产成人精品无码区在线秒播| 国产精品视频一区二区三区四 | 亚洲欧美精品aaaaaa片| 国产一区二区丁香婷婷| 在线观看午夜视频国产| 老太脱裤子让老头玩xxxxx | 精品无码人妻一区二区三区不卡| 久久人妻AV无码一区二区| 一区二区三区精品亚洲视频| 亚洲国产日韩a在线乱码| 色翁荡息又大又硬又粗又视频图片 | 亚洲AV秘 无码一区二p区三区| 亚洲国产线茬精品成av| 久久国语露脸国产精品电影| 日本熟妇人妻xxxxx视频| 亚洲欧美变态另类综合| 亚洲自拍偷拍一区二区三区 | 国产av精品一区二区三区久久 | 亚洲av人片在线观看调教| 亚洲美女av一区二区在线|