周嬡婷，王芳，尹加筆 ，劉麗，張東華，洪英娣，沈德周，馬煥成，伍建榕,

(1.西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院，云南省高校森林災(zāi)害預(yù)警控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，國(guó)家林業(yè)和草原局西南地區(qū)生物多樣性保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；3.德宏州林業(yè)和草原局，云南 德宏 678400)

油茶(Camelliaoleifera)屬山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)[1]，是一種經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，不僅能榨取高質(zhì)量的食用油，而且具有一定的生態(tài)價(jià)值[2]。近年來(lái)由于炭疽病的流行，導(dǎo)致油茶嚴(yán)重落花、落果、甚至整株植株死亡[3]，造成油茶產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量急劇下降。對(duì)此，化學(xué)防治是主要防治措施，進(jìn)而導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、病原菌產(chǎn)生抗性、污染環(huán)境等，而生物防治因綠色、安全、高效的特點(diǎn)逐漸成為了化學(xué)防治的有效替代措施。所以，本文針對(duì)油茶炭疽病開(kāi)展生物防治研究。

芽孢桿菌(Bacillusspp.)是目前研究最廣泛的生物防治劑，已被廣泛用于開(kāi)發(fā)生物農(nóng)藥和殺真菌劑，主要是由于其次級(jí)抗微生物代謝產(chǎn)物在植物病害中發(fā)揮重要保護(hù)作用，其中脂肽類物質(zhì)就是其中之一[4]，該類物質(zhì)因具有理想特性而備受關(guān)注，如廣譜性、低毒性、抗微生物活性強(qiáng)等[5]。Zhu M等[6]發(fā)現(xiàn)菌株F85貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)和T113淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)對(duì)根腫病害具有顯著的抑制作用。信珊珊等[7]從水稻(Oryzasativa)根部分離到一株解淀粉芽孢桿菌，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液中的脂肽類物質(zhì)引起油茶炭疽病菌絲畸形而產(chǎn)生抑制作用。本研究擬對(duì)油茶健康葉片中分離的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行鑒定，后通過(guò)平板對(duì)峙法篩選對(duì)油茶炭疽菌具有高效抑菌活性的拮抗細(xì)菌，并初步探討高效拮抗細(xì)菌的抑菌機(jī)制，為油茶炭疽病的綠色防治及新型生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病原真菌

炭疽菌(Colletotrichumfructicola)于德宏州油茶基地感病葉片中分離得到，該菌株保存于西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)與利用學(xué)院病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基 1 L的培養(yǎng)基含200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，15～20 g瓊脂，121 ℃滅菌30 min。

LB培養(yǎng)基 1 L的培養(yǎng)基含10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L Nacl，15～20 g瓊脂，121 ℃滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離

從德宏州油茶基地采集健康葉片和果實(shí)，參考方中達(dá)[8]的方法，分離內(nèi)生細(xì)菌。材料均用自來(lái)水沖洗1 min，以去除表面雜質(zhì)，后放入75%乙醇溶液中浸泡消毒2～3 s，接著用無(wú)菌水清洗3遍，以除去殘余的乙醇溶液，最后用無(wú)菌刀片切下健康組織5 mm×5 mm的小塊，將其轉(zhuǎn)移至LB固體培養(yǎng)基中，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，用劃線法純化菌株[9]，4 ℃斜面保存。

1.2.2 內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA序列分析

參照生工細(xì)菌試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA提取，然后利用細(xì)菌通用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)[10]擴(kuò)增16S rRNA片段，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送碩擎生物技術(shù)有限公司測(cè)序，所得序列在Etaxon網(wǎng)站(網(wǎng)址https://www.ezbiocloud.net/identify)比對(duì)分析。

PCR反應(yīng)體系(50 μL)：25 μL Mix，20 μL ddH2O，1 μL 27F，1 μL 1492R，3 μL DNA模板。PCR反應(yīng)條件：95 ℃變性5 min，94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸6 min，4 ℃保存。

1.2.3 內(nèi)生細(xì)菌的體外抑菌效果篩選

采用平板對(duì)峙法[11]篩選拮抗菌株。炭疽菌于PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d，制成直徑6 mm的菌塊，然后移至新的PDA培養(yǎng)皿中央。用待測(cè)菌株菌懸液(每片濾紙片打5 μL，OD600=0.1)點(diǎn)接至距離培養(yǎng)皿中央3 cm的4個(gè)位置處，無(wú)菌水處理作對(duì)照，每處理3次重復(fù)，置于26 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第4 d起每天記錄病原菌直徑，計(jì)算抑菌率[10]，抑菌率公式如下所示。

抑菌率=[(未處理病原菌直徑-處理病原菌直徑)/未處理病原菌直徑]×100%

1.2.4 抑菌效果最佳菌株在油茶離體葉片上對(duì)炭疽菌的抑制效果

經(jīng)體外平板對(duì)峙培養(yǎng)法篩選25株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)炭疽菌的抑制效果后，選擇抑菌率最高的1株內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行葉片回接。回接共設(shè)4個(gè)處理：(1)無(wú)菌水(對(duì)照)；(2)菌懸液；(3)炭疽菌；(4)菌懸液+炭疽菌，每處理3次重復(fù)?；亟雍笕~片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參照表1。

表1 油茶葉片質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

用無(wú)菌針刺傷葉片中央，菌懸液培養(yǎng)24 h后，均勻噴施于葉片表面，再過(guò)24 h后在刺傷位置接種直徑5 mm的病原菌塊，第4 d起每天觀察記錄，計(jì)算病情指數(shù)和發(fā)病率[12]，公式如下所示。

病情指數(shù)=[(各病級(jí)葉片數(shù)×該級(jí)代表數(shù)值)/(總?cè)~片數(shù)×最高一級(jí)代表數(shù)值)]×100

發(fā)病率=(發(fā)病葉片總數(shù)/葉片總數(shù))×100%

1.2.5 抑菌效果最佳菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定 把單菌落轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基，置搖床上28 ℃，180 r/min培養(yǎng)24 h。菌懸液搖勻后，取1 mL于1.5 mL離心管中，加入9 mL無(wú)菌水，用梯度稀釋法制備1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8的稀釋液。取100 μL 稀釋液涂布于LB固體培養(yǎng)基中，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)特征[13]。

16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析 抑菌效果最佳菌株擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物送至碩擎生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)得的序列在Etaxon網(wǎng)站中(網(wǎng)址https://www.ezbiocloud.net/identify)進(jìn)行比對(duì)，最后用MEGA 6.0的Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定該菌株的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位。

1.2.6 抑菌效果最佳菌株脂肽基因檢測(cè)

根據(jù)Farzand等[14]報(bào)道：Iturin、Bacillomycin、Fengycin、Bacillaene、Plipastatin、Bacillibactin、Surfacin和Bacylisin等脂肽類物質(zhì)具有高效的抗真菌活性。本文以效果最佳菌株的DNA為模板，擴(kuò)增該菌株相應(yīng)脂肽基因，各脂肽基因特異性引物見(jiàn)表2。

表2 各脂肽基因引物信息

PCR反應(yīng)體系(50 μL)：25 μL Mix，18 μL ddH2O，引物各2 μL，3 μL DNA模板。PCR反應(yīng)條件：95 ℃變性3 min，94 ℃變性30 s，具體退火溫度見(jiàn)表2，退火時(shí)間40 s，72 ℃延伸40 s，32個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理及圖表制作采用Excel 2010軟件，數(shù)據(jù)顯著性分析采用SPSS Statistics 17.0進(jìn)行單因素ANOVA Duncan’s多重差異顯著性分析，差異水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離與16S rRNA序列分析

本研究共獲得25株內(nèi)生細(xì)菌，均來(lái)自健康葉片，所得菌株經(jīng)16S rRNA序列分析鑒定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 25株內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA序列比對(duì)結(jié)果

表3顯示：25株內(nèi)生細(xì)菌其中88%的菌株屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)。其中菌株6701、6703、6705、6707、6708、6709、6712、6714、6715、6718、6719、6720和6725的近源菌為B.tequilensisKCTC 13622，其序列相似性在99.58%～99.93%之間，占總分離菌株數(shù)的52%。菌株6702與近源菌B.megateriumNBRC 15308的相似性為99.59%，占總分離菌株數(shù)的4%。菌株6704與B.mobilis0711P9-1相似性最高，其相似性為99.1%，占總分離菌株數(shù)的4%。菌株6706與B.velezensisCR-502相似性最高，其相似性為99.21%，占總分離菌株數(shù)的4%。菌株6710與B.proteolyticusTD42相似性最高，相似性為99.59%，占總分離菌株數(shù)的4%。菌株6711和6717與近源菌B.halotoleransATCC 25096相似性最高，序列相似性為99.3%，占總分離菌株數(shù)的8%。菌株6713與S.sciuriDSM 20345相似性最高，其相似性為99.86%，占總分離菌株數(shù)的4%。菌株6716與近源菌B.siamensisKCTC 13613相似性為99.37%，占總分離菌株數(shù)的4%。菌株6721與L.adecarboxylataNBRC 102595相似性最高，相似性為99.71%，占總分離菌株數(shù)的4%。菌株6722和6723與近源菌B.zanthoxyli1433相似性最高，序列相似性在99.58%～99.65%之間，占總分離菌株數(shù)的8%。菌株6724與P.intestiniLAH16相似性最高，相似性為99.23%，占總分離菌株數(shù)的4%。

2.2 25株內(nèi)生細(xì)菌的體外抑菌效果篩選

以油茶炭疽菌為指示菌，分離得到的25株內(nèi)生細(xì)菌為待測(cè)菌株，用平板對(duì)峙法測(cè)定各待測(cè)菌株的抑菌效果，結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。由圖1可見(jiàn)，菌株6715的抑菌效果最好。

圖1 25株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)油茶炭疽菌的體外抑菌作用注：開(kāi)展對(duì)峙培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的第7 d效果。Fig.1 Antagonistic activity of 25 strains isolated from healthyC.oleifera leaf against Colletotrichum fructicola in vitro

圖2 25株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)油茶炭疽菌的抑菌率注：第7 d 25株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)油茶炭疽菌的抑菌率結(jié)果；不同字母經(jīng)單因素ANOVA Duncan’s多重差異顯著性分析，差異水平為P<0.05。Fig.2 The inhibitory rate of 25 endophytic bacteriastrains against Colletotrichum fructicola

圖2可見(jiàn)菌株6715抑菌率最高(57.59%)，顯著高于其他待測(cè)菌株，占比為4%。菌株6703、6705、6706、6707、6708、6709、6711、6712、6714、6718、6719、6720和6725共13株內(nèi)生細(xì)菌抑菌率在40%～50%之間，占25株菌株總數(shù)的52%，且不同菌株間抑菌率差異不顯著。菌株6701和6717抑菌率在30%～40%之間，占比為8%。菌株6716抑菌率在20%～30%之間，占比為4%。菌株6704、6723和6724抑菌率在10%～20%之間，占比為12%。菌株6702和6713抑菌率在0～10%之間，占比為8%。菌株6710、6721和6722抑菌率在-10%～0%之間，占比為12%。

2.3 抑菌效果最好菌株6715在離體油茶葉片上對(duì)炭疽菌的抑制效果

經(jīng)體外平板對(duì)峙培養(yǎng)法篩選出菌株6715對(duì)該病原真菌的抑制效果最佳，對(duì)其進(jìn)行葉片回接，各處理回接第10 d的結(jié)果見(jiàn)圖3、表4和圖4。

圖3 菌株6715在離體葉片上對(duì)油茶炭疽菌的抑制效果注：為葉片回接第10 d的效果，處理1、處理2、處理3、處理4分別表示無(wú)菌水(對(duì)照)(1-1，1-2，1-3)、菌懸液6715(2-1，2-2，2-3)、油茶炭疽菌(3-1，3-2，3-3)、菌懸液+油茶炭疽菌(4-1，4-2，4-3)。Fig.3 Inhibitory effects of strain 6715 againstColletotrichum fructicola on detached leaves ofC.oleifera after inoculation 10 days

表4 離體葉片病斑直徑及發(fā)病率

圖4 第10 d病斑直徑注：葉片回接第10 d數(shù)據(jù)，不同字母經(jīng)單因素ANOVA Duncan’s多重差異顯著性分析，差異水平為P<0.05。Fig.4 Effects of strain 6715 on lesion diameterafter inoculation 10 days

圖3和表4可以明顯的看出，處理1(無(wú)菌水，對(duì)照)和處理2(菌懸液6715)在整個(gè)時(shí)段內(nèi)回接的葉片均未發(fā)病，且葉片顏色均為亮綠色，說(shuō)明內(nèi)生菌株6715為非致病菌?；亟拥? d時(shí)，處理3(油茶炭疽菌)，葉片均出現(xiàn)病斑，病斑較小，葉片顏色逐漸褪去，其發(fā)病率為100%，病情指數(shù)為25。同時(shí)，處理4(菌懸液6715+油茶炭疽菌)部分葉片出現(xiàn)病斑，不明顯，較為輕微，葉片顏色基本未發(fā)生變化，其發(fā)病率為44.44%，病情指數(shù)為11，顯著低于處理3(油茶炭疽菌)?；亟拥?0 d時(shí)，處理3(油茶炭疽菌)，葉片病斑明顯增大，病斑直徑為5.36 mm，顯著高于處理4(菌懸液6715+油茶炭疽菌)(圖4)，葉片顏色由亮綠色褪為黃綠色，病情指數(shù)達(dá)50，增加為第7 d處理的2倍。同時(shí)，處理4(菌懸液6715+油茶炭疽菌)葉片均出現(xiàn)病斑，病斑較小，直徑為1.84 mm，較為輕微，顯著低于處理3，葉片顏色微微褪綠，變化不大，病情指數(shù)增大到25。以上結(jié)果表明，內(nèi)生菌株6715為非致病菌，且對(duì)油茶炭疽菌有較好的抑制活性。

2.4 抑菌效果最好菌株6715的鑒定

2.4.1 形態(tài)學(xué)

菌株6715的液體培養(yǎng)單菌落，于搖床28 ℃、180 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。取100 μL 1×10-6的稀釋液涂布，恒溫箱28 ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 菌株6715形態(tài)特征

菌株6715培養(yǎng)基上菌落呈乳白色，近圓形，菌體干燥、無(wú)粘性，表面粗糙，菌落中央有皺褶產(chǎn)生。革蘭氏染色結(jié)果表明，該菌株為陽(yáng)性菌，呈棒桿狀。

2.4.2 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育聚類圖

通過(guò)對(duì)菌株6715的16S rRNA基因發(fā)育系統(tǒng)(圖6)的分析，發(fā)現(xiàn)與其相似性最高的菌株為SJ33(MG396987)，序列相似性為100%，且與B.tequilensis種的菌株聚為一支，所以，將菌株6715鑒定為B.tequilensis。

2.5 菌株6715脂肽基因檢測(cè)

由圖7可以看出，通過(guò)對(duì)菌株6715脂肽基因進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該菌株存在脂肽基因bacA(500 bp)、ppsD(350 bp)和srfAA(200 bp)，但是脂肽基因fenD、baC、baE、bmyB、ituB均未檢測(cè)到，其中檢測(cè)到的基因bacA(500 bp)、ppsD(350 bp)和srfAA(200 bp)分別與Bacylisin、Plipastatin和Surfacin 3種脂肽物質(zhì)相對(duì)應(yīng)。

圖6 菌株6715 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

圖7 菌株6715脂肽基因擴(kuò)增結(jié)果注：M表示Marker，1，2，3，4，5，6，7，8分別是基因bacA(500 bp)、ppsD(350 bp)、srfAA(200 bp)、fenD、baC、baE、bmyB、ituB，其中基因4，5，6，7，8未檢測(cè)到。Fig.7 Electrophoresis of biosynthesis genes for strain 6715

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

本次研究從健康葉片共獲得25株內(nèi)生細(xì)菌，經(jīng)分子鑒定表明：有88%的菌株屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)。其中13株與近源菌B.tequilensisKCTC 13622的序列相似性在99.58%～99.93%之間，占總分離菌株數(shù)的52%，推測(cè)B.tequilensis為當(dāng)?shù)赜筒璁a(chǎn)區(qū)內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)類群。有學(xué)者表明，從解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)中檢測(cè)到存在促生長(zhǎng)的植物激素IAA[15]，同時(shí)，本研究在平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬的菌株，可能抑制或促進(jìn)病原菌的生長(zhǎng)。另外，菌株6715葉片回接抑菌效果顯示與平板對(duì)峙結(jié)果有高度的相關(guān)性，而對(duì)于該菌株盆栽活體苗的回接效果有待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)菌株6715對(duì)油茶炭疽菌的抑制效果最好，抑菌率為57.59%，經(jīng)16S rRNA序列分析鑒定為B.tequilensis。據(jù)報(bào)道B.tequilensis在研究中表現(xiàn)出較好的生防應(yīng)用能力，Bhattacharya等[16]研究表明，B.tequilensis對(duì)番茄枯萎病菌鐮刀菌有高效的拮抗活性。Hui Li[17]在水稻稻瘟病(PyriculariaoryzaeCav.)研究中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生細(xì)菌B.tequilensis能夠顯著抑制稻瘟病病原菌的生長(zhǎng)。Claudia Guerrero-Barajasa[18]報(bào)道了B.tequilensis能夠減輕由膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)引起的牛油果炭疽病的發(fā)生，且其對(duì)炭疽病菌的抑制率為60%。對(duì)其生防機(jī)制進(jìn)行初探，發(fā)現(xiàn)菌株6715存在脂肽基因bacA(500 bp)、ppsD(350 bp)和srfAA(200 bp)分別與Bacylisin、Plipastatin和Surfacin 3種物質(zhì)相對(duì)應(yīng)，均屬于脂肽家族。研究表明，脂肽類物質(zhì)是一類由非核糖體途徑合成的具有抗細(xì)菌和抗真菌作用屬性的生物活性分子[19]，包含Surfacin、Iturin和Fengycin 3類。研究報(bào)道脂肽類物質(zhì)主要是靠自身的兩親性和與目標(biāo)物的互作，致使靶細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而改變致病菌細(xì)胞膜的滲透性，進(jìn)而控制致病菌的生長(zhǎng)[20]。Surfacin是很強(qiáng)的表面活性劑，有研究發(fā)現(xiàn)，其與抗菌活性密切相關(guān)，能較好的抑制黃單胞桿菌(Xanthomonas)，當(dāng)缺乏合成與Surfacin相關(guān)的防御基因時(shí)，抑制效果顯著下降[21];脂肽類Bacylisin在黃瓜枯萎病[Fusariumoxysporum(Schl.) F.spcucumerinumOwen]和辣椒疫霉病(PhytophthoracapsiciLeonian)的生物防治中表現(xiàn)出良好的活性[22];脂肽類Plipastatin通過(guò)使鐮刀菌(Fusariumgraminearum)菌絲發(fā)生空泡化、菌絲纏繞凝結(jié)阻礙菌絲正常分枝，導(dǎo)致菌絲畸形，從而對(duì)病原菌表現(xiàn)出良好的拮抗活性[23]。對(duì)于菌株6715代謝物是否能有效產(chǎn)生Bacylisin、Plipastatin和Surfacin 3種脂肽物質(zhì)以及菌株6715對(duì)油茶炭疽菌的抑制作用機(jī)理，尚有待進(jìn)一步研究。

3.2 結(jié)論

本次研究從健康葉片共獲得25株內(nèi)生細(xì)菌，經(jīng)分子鑒定表明：有88%的菌株屬于芽孢桿菌屬，其中B.tequilensis的分離率最高，占總分離菌株數(shù)的52%，推測(cè)B.tequilensis為當(dāng)?shù)赜筒璁a(chǎn)區(qū)內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)類群。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)菌株6715(B.tequilensis)對(duì)油茶炭疽菌的抑制效果最好，抑菌率為57.59%。對(duì)其生防機(jī)制進(jìn)行初探，發(fā)現(xiàn)菌株6715存在脂肽基因bacA(500 bp)、ppsD(350 bp)和srfAA(200 bp)分別與Bacylisin、Plipastatin和Surfacin 3種物質(zhì)相對(duì)應(yīng)，均屬于脂肽家族。