呂 偉 韓俊梅 任果香 文 飛 王若鵬 劉文萍

(山西農(nóng)業(yè)大學經(jīng)濟作物研究所，山西 太原 030031)

芝麻(SesamumindicumL. )隸屬胡麻科(Pedaliaceaie)胡麻屬(Sesamum)[1]，是我國六大特色油料作物之一[2-5]。芝麻種子含油量達55%以上，亞油酸含量達40%以上，素有油中“皇后”之美譽，因含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，廣泛應用于食品、醫(yī)藥、美容等領域[6-8]。此外，芝麻具有耐貧瘠、耐旱、適應性強等特性，在我國種植歷史悠久，多數(shù)省份均有種植[9-10]。山西是我國西北地區(qū)芝麻主產(chǎn)省，但近年來芝麻種植面積逐年下降，單產(chǎn)低而不穩(wěn)，嚴重影響山西芝麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，其主要原因在于育成品種的親本遺傳基礎狹窄、抗逆性較差。因此，分析和研究芝麻種質(zhì)資源及其遺傳多樣性對有效利用種質(zhì)資源，拓寬育種親本的遺傳基礎，培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆芝麻新品種具有重要意義。

種質(zhì)資源遺傳多樣性的分析方法主要包括表型性狀和分子標記，利用表型性狀開展種質(zhì)資源遺傳多樣性研究的方法最為普遍[11]，具有簡單、直觀、易觀察記載的特點[12]，但由于表型性狀易受環(huán)境因素影響，對種質(zhì)資源鑒定具有一定的局限性[13]。隨著分子生物學技術的發(fā)展，DNA分子標記已廣泛應用于作物的遺傳多樣性研究。簡單重復序列標記 (simple sequence repeat，SSR)具有多態(tài)性高、重復性好、呈共顯性、分布廣等優(yōu)點[14-17]，已成為理想的遺傳標記技術。目前，國內(nèi)外學者利用SSR分子標記已對玉米[18]、黑麥[19]、大豆[20]、水稻[21-22]、花生[23-24]、豌豆[25]、藜麥[26]、綠豆[27]、小麥[28]等多種作物進行了遺傳多樣性研究。在芝麻上，Kim等[29]利用14對SSR引物對來自韓國和其他國家的75份芝麻資源進行了遺傳多樣性分析；孫建等[30]利用SSR分子標記對我國20份黑芝麻進行遺傳多樣性分析；劉文萍等[9]研究發(fā)現(xiàn)山西芝麻種質(zhì)資源與我國其他主產(chǎn)區(qū)種質(zhì)資源的遺傳關系較遠。但利用SSR分子標記對山西芝麻種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究鮮見報道。因此，本研究以71份山西芝麻種質(zhì)資源為研究材料，通過SSR分子標記對其進行遺傳多樣性分析及群體結(jié)構(gòu)分析，以期探明山西芝麻種質(zhì)資源的遺傳變異特性，為山西芝麻育種親本選擇、品種改良和優(yōu)異基因發(fā)掘提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試芝麻材料 山西芝麻種質(zhì)資源共計71份(表1)，由山西農(nóng)業(yè)大學經(jīng)濟作物研究所提供。

表1 參試芝麻種質(zhì)資源名稱及編號

1.1.2 SSR標記引物 30對多態(tài)性較好的SSR標記引物，由中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所提供，引物序列信息見表2。

表2 30對SSR引物序列

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取與質(zhì)量檢測 將參試芝麻材料在室內(nèi)培養(yǎng)，取其幼嫩葉片，采用CTAB改良法[31]提取基因組DNA，利用NANODROP 2000紫外分光光度核酸測定儀(Thermo，美國)檢測其質(zhì)量和濃度，將其稀釋至20 ng·μL-1，放置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴增 PCR反應體系(10 μL)： DNA 2.5 μL、10×buffer 1 μL、Taq DNA聚合酶0.16 μL、dNTP 0.2 μL、正反引物各0.16 μL、ddH2O 5.82 μL。PCR擴增反應程序：94℃預變性4 min；94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min，共32次循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色后拍照記錄。

1.3 SSR分子標記統(tǒng)計與數(shù)據(jù)分析

記錄清晰的SSR擴增條帶，有條帶賦值為“1”，無條帶賦值為“0”，利用Microsoft Office Excel 2010軟件統(tǒng)計整理數(shù)據(jù)。利用POPGENE 1.31軟件計算每對引物的等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon指數(shù)(Ⅰ)、Nei′s遺傳多樣性指數(shù)(H)。利用LITTLE PROGRAME軟件計算每對引物的多態(tài)性信息含量(polymorphism information content，PIC)。利用NTSYS-pc 2.1軟件按照非加權(quán)配對算術平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)對參試材料進行聚類分析。利用STRUCTURE 2.3.1軟件對參試材料進行遺傳結(jié)構(gòu)分析，設置分析群體數(shù)K值范圍為1～10，將MCMC(markor chain monte carlo)開始時的不作數(shù)迭代設為100 000次，再將不作數(shù)迭代后的MCMC設為100 000次，迭代次數(shù)設置為5。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標記對芝麻種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析

利用多態(tài)性較好的30對SSR分子標記對71份山西芝麻種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析(圖1)，由表3可知，30對SSR標記共檢測到144個等位基因位數(shù)(Na)，變幅為2～10個，平均每個SSR標記4.800 個等位基因，等位基因數(shù)在5～10之間的有15對，占參試的50.0%，其中ZMM1494引物檢測到的等位基因數(shù)最多，為10個，其次為ZMM1832、ZMM1935引物，分別檢測到8個等位基因數(shù)。有效等位基因數(shù)(Ne)在1.058 ～5.149 之間，平均2.805 個，其中ZMM1832引物引物檢測到的有效等位基因數(shù)最多，為5.149 個，其次為ZMM1550，為5.128 個，ZMM1542、ZMM2313引物的有效等位基因數(shù)最少，均為1.058 個。

表3 30對SSR分子標記在71份芝麻種質(zhì)檢測到的遺傳變異參數(shù)

圖1 SSR引物ZMM2540和ZMM2313對編號1～12芝麻種質(zhì)擴增產(chǎn)物的電泳圖

30對SSR引物的Shannon指數(shù)(Ⅰ)變幅為0.128 ～1.813，平均為1.096，其中ZMM1832的Shannon指數(shù)最高，ZMM1542的Shannon指數(shù)最低，Shannon指數(shù)在1.5以上的有ZMM1550(1.698)、ZMM2133(1.590)、ZMM1935(1.648)、ZMM4097(1.563)、ZMM1832(1.813)、ZMM1851(1.646)、ZMM2350(1.545)。Nei′s遺傳多樣性指數(shù)(H)變幅為0.055 ～0.806，平均為0.558，其中ZMM1832的Nei′s遺傳多樣性指數(shù)最高，ZMM1550次之，ZMM1542和ZMM2313的Nei′s遺傳多樣性指數(shù)最低，Nei′s遺傳多樣性指數(shù)在0.7以上的有ZMM1522(0.704)、ZMM1550(0.805)、ZMM1632(0.735)、ZMM2345(0.742)、ZMM2133(0.767)、ZMM2276(0.733)、ZMM1935(0.748)、ZMM4097(0.764)、ZMM1832(0.806)、ZMM1851(0.770)、ZMM2350(0.734)。PIC變幅為0.053 ～0.783，平均為0.515，其中ZMM1832的PIC最高，ZMM1542和ZMM2313的PIC最低，PIC在0.7以上的有ZMM1550(0.776)、ZMM2133(0.734)、ZMM1935(0.714)、ZMM4097(0.729)、ZMM1832(0.783)、ZMM1851(0.738)。

2.2 SSR標記對芝麻種質(zhì)資源的聚類分析

采用NTSYS-pc 2.1軟件按照UPGMA法對參試材料進行聚類分析，并制作聚類樹狀圖。由圖2可知，71份山西芝麻種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)范圍為0.21～0.67，在遺傳相似系數(shù)0.27處將參試材料分為六大類，第Ⅰ類包括2份芝麻種質(zhì)，分別為太谷芝麻1號、運城芝麻3號；第Ⅱ類包括4份芝麻種質(zhì)，分別為見喜芝麻1號-1、四棱芝麻-1、雜F11-6、絳縣澮南-1；第Ⅲ類包括4份芝麻種質(zhì)，分別為吳堡楊家溝芝麻、晉芝十號、吉縣芝麻、絳縣大交-1；第Ⅳ類包括51份芝麻種質(zhì)，以遺傳相似系數(shù)0.3為閾值，將第Ⅳ類分為Ⅳ-A、Ⅳ-B、Ⅳ-C三亞群，其中Ⅳ-A由5份芝麻種質(zhì)組成(太谷芝麻2號-1、臨縣芝麻5號-1、柳林芝麻3號、吳堡郭家墕-1、早熟-3)，Ⅳ-B由33份芝麻種質(zhì)組成，基本為汾陽芝麻種質(zhì)，Ⅳ-C由13份芝麻種質(zhì)組成(臨縣芝麻2號、臨縣芝麻3號、臨縣芝麻4號、2012-43-02、柳林芝麻1號-1、吳堡丁家灣芝麻、定襄芝麻1號-1、吳堡大棗灣芝麻、吳堡高尚墕芝麻、吳堡劉家里-1、柳林石西-1、吳堡赤木峪芝麻、不抗-9)；第Ⅴ類包括9份芝麻種質(zhì)，分別為吳堡任家莊-1、2012雜F3-4、82030、2012-48-01、2012-47-01、吉縣南耀芝麻、g14、吉縣底貼芝麻、選4-1；第Ⅵ類包括1份芝麻種質(zhì)，為柳林芝麻2號-1。在所有的參試材料中，63號(g46)、65號(2000g65)、71號(g15)這3份芝麻種質(zhì)間的遺傳相似性系數(shù)以及67號(g60)、70號(g67)這2份芝麻種質(zhì)間的遺傳相似性系數(shù)最高，均為0.67；1號(太谷芝麻1號)、27號(吉縣芝麻)、10號(柳林芝麻2號-1)、28號(絳縣大交-1)、3號(運城芝麻3號)這5份芝麻種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)的平均值較低，分別為0.195、0.200、0.207、0.211、0.218。

圖2 基于SSR標記山西芝麻種質(zhì)聚類樹狀圖

同時采用NTSYS-pc軟件對71份芝麻種質(zhì)進行二元主成分分析，構(gòu)建主成分分析二維圖(圖3)。根據(jù)參試材料在圖中的位置分布，將71份材料分成4部分，a區(qū)域主要為類群Ⅳ-B的部分材料，b區(qū)域主要為類群Ⅳ-A、Ⅵ材料及類群Ⅳ-B的部分材料，c區(qū)域主要為類群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ材料，d區(qū)域主要為類群Ⅳ-C材料。主成分分析從不同的角度更直觀地對71份山西芝麻種質(zhì)資源進行了親緣關系分析，山西芝麻種質(zhì)資源在主成分分析二維圖分布較為均勻，表明其遺傳多樣性較為豐富。

圖3 71份芝麻種質(zhì)資源二元主成分分析

根據(jù)DNA擴增結(jié)果，對山西11個不同地理來源芝麻亞群進行分析，獲得11個亞群的遺傳一致度和遺傳距離結(jié)果。由表4可知，從遺傳距離來看，11個亞群間的遺傳距離介于0.050 ～0.325 之間，平均為0.164。從遺傳一致度來看，11個亞群間的遺傳一致度范圍為0.722 ～0.951，平均為0.850，其中柳林芝麻亞群與吳堡芝麻亞群之間遺傳距離最小，為0.050，遺傳一致度最高，為0.951，說明它們之間的遺傳交流頻率相對較高；文水芝麻亞群與運城芝麻亞群遺傳距離最大，為0.325，遺傳一致度最低，為0.722，說明它們之間的遺傳交流頻率相對較低，親緣關系較遠。對山西11個不同地理來源芝麻亞群進行聚類分析，由圖4可知，柳林、吳堡、臨縣、汾陽等山西西部地區(qū)芝麻種質(zhì)間遺傳距離較近，吉縣、絳縣、定襄、文水、聞喜、運城等山西中部地區(qū)、山西南部地區(qū)芝麻種質(zhì)與山西西部地區(qū)芝麻種質(zhì)的遺傳距離較遠。

表4 山西11個芝麻亞群的遺傳距離(左下角)和遺傳一致度(右上角)

圖4 山西11個芝麻亞群的UPGMA聚類分析

2.3 SSR標記對芝麻種質(zhì)資源的群體結(jié)構(gòu)分析

基于SSR分子標記檢測結(jié)果，將分析得到的LnP(D)平均值繪制折線圖(圖5)，結(jié)果表明，在K=5時LnP(D)似然值最大。因此，將71份參試材料劃分為5個組群(圖6)。

圖5 對數(shù)似然函數(shù)值LnP(D)的變化曲線

圖6 基于SSR標記的山西芝麻種質(zhì)遺傳結(jié)構(gòu)圖

當某一材料在某個組群中的Q值≥0.6時，認為該材料遺傳結(jié)構(gòu)相對單一，某一材料在某個組群中的Q值<0.6時，則認為該材料擁有混合來源[32-33]，因此，為了能夠充分體現(xiàn)山西芝麻材料間的遺傳結(jié)構(gòu)成分，分析其在不同組群的Q值分布，將Q值大于或等于0.6的46份山西芝麻種質(zhì)材料(占參試材料的64.8%)劃歸到相應的5個組群中，其余25份來源于汾陽、吳堡、柳林、臨縣、絳縣、定襄、文水的芝麻種質(zhì)材料(占參試材料的35.2%)遺傳結(jié)構(gòu)具有復雜的混合來源，無法明確其歸屬的組群，因此將其劃歸為混合組群中(表5)。由表5可知，組群1(圖6紅色組群)的芝麻材料有7份，占參試材料的9.9%，均為來源于汾陽，分布于二元主成分分析的a區(qū)域；組群2(圖6綠色組群)的芝麻材料有7份，占參試材料的9.9%，來源于汾陽、吉縣、吳堡，分布于二元主成分分析的b、c區(qū)域；組群3(圖6藍色組群)的芝麻材料有8份，占參試材料的11.3%，來源于吳堡、臨縣、柳林，分布于二元主成分分析的d區(qū)域；組群4(圖6黃色組群)的芝麻材料有13份，占參試材料的18.3%，均為來源于汾陽，分布于二元主成分分析的b區(qū)域；組群5(圖6粉色組群)的芝麻材料有11份，占參試材料的15.5%，來源于汾陽、太谷、吉縣、絳縣、聞喜、運城、柳林、臨縣，分布于二元主成分分析的b、c區(qū)域。該群體結(jié)構(gòu)的組群劃分不僅體現(xiàn)了參試芝麻種質(zhì)間的親緣關系，且與二元主成分分析結(jié)果大致吻合。

表5 71份芝麻種質(zhì)在5個不同組群的Q值

由表6可知，從遺傳距離來看，6個組群間的遺傳距離介于0.033 ～0.168 之間，平均為0. 091；從遺傳一致度來看，6個組群間的遺傳一致度范圍為0.846 ～0.968，平均為0.913。由圖7可知，組群1與組群3之間遺傳距離最大，為0.168，而遺傳一致度最低，為0.846；組群4與組群M遺傳距離最小，為0.033，而遺傳一致度最高，為0.968。

表6 6個芝麻組群的遺傳距離(左下角)和遺傳一致度(右上角)

圖7 6個芝麻組群的UPGMA聚類分析

3 討論

芝麻品種的遺傳改良主要取決于對芝麻種質(zhì)資源的掌握與利用，只有掌握芝麻種質(zhì)材料的遺傳變異信息，才能更有針對性選擇親本材料，從而有助于培育出雜種優(yōu)勢較大的后代。DNA分子標記技術是分析植物遺傳多樣性和遺傳基礎的主要方法，大量研究表明，SSR標記以其穩(wěn)定性高、易于操作、信息含量豐富等優(yōu)點，成為研究芝麻種質(zhì)間遺傳差異、種屬間親緣關系最重要、發(fā)展最迅速的分子標記[30]。孫建等[30]利用23對SSR分子標記對我國20個芝麻品種進行遺傳多樣性分析，每對標記檢測出3～6個等位基因位點，平均每對標記4.00個等位基因；張艷欣等[34]用20對SSR引物對216份芝麻核心種質(zhì)進行檢測，每對引物檢測出2～8個等位基因位點，平均等位基因為3.95個；岳文娣等[35]利用42對SSR引物對國內(nèi)外545份芝麻品種進行遺傳多樣性分析，引物的等位基因位點范圍為3～9個, 平均每對引物等位基因為3.8個，PIC平均值為0.409 2；魏利斌等[36]用27對SSR多態(tài)引物對國內(nèi)外36個芝麻材料進行遺傳多樣性分析，檢測到的等位基因位點為2～7個，平均3.37個，PIC平均值為0.390。而本試驗利用30對SSR標記對71份山西芝麻種質(zhì)進行遺傳多樣性分析，每對標記檢測出2～10個等位基因位點，平均每個SSR標記4.800 個等位基因，PIC平均值為0.515，均高于前人研究結(jié)果，說明本研究采用的SSR標記具有更高的多態(tài)性，參試的芝麻種質(zhì)資源具有較高的遺傳多樣性。此外，PIC是核心引物篩選的重要指標，本研究中引物ZMM1494的等位基因數(shù)最多，為10個，PIC為0.626，ZMM1935、ZMM4097、ZMM2133、ZMM1851、ZMM1550、ZMM1832的等位基因數(shù)變幅為6～8個，少于ZMM1494，但其PIC較高，變幅在0.714 ～0.783 之間。這些具有較高多態(tài)性的SSR標記，不僅在分析芝麻種質(zhì)親緣關系方面發(fā)揮重要作用，也為芝麻遺傳變異檢測等其他分子生物學研究提供重要標記資源。

本研究利用NTSYS-pc軟件對71份山西芝麻種質(zhì)資源進行UPGMA法聚類分析和二元主成分分析，同時利用Structure軟件對其進行遺傳結(jié)構(gòu)分析，這3種聚類分析方法對參試芝麻種質(zhì)的聚類結(jié)果大致吻合，但略有差異，主要是由其聚類原理和方法決定的。UPGMA法聚類是假設各類群的進化速率相同，按照順序依次將距離最小的兩個材料聚在一起，直到所有的材料都聚到一個完整的系統(tǒng)發(fā)生樹中[37]。而二元主成分分析則是利用降維的統(tǒng)計方法，把多個指標轉(zhuǎn)化為幾個綜合指標，降低觀測的空間維數(shù)來獲取最主要的信息，通過直觀圖像距離獲取材料間相關性的分析方法[38]。UPGMA法聚類分析和二元主成分分析基于參試材料的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離對其進行群體劃分，但這種群體聚類結(jié)果時常由于人為地將平面區(qū)域位置較近者劃歸為一類，使類群間相互滲透的材料不易劃分，而群體結(jié)構(gòu)分析基于哈代-溫伯格平衡和貝葉斯模型算法，避免了人為因素對群體劃分造成的偏差[32]。因此，本研究采用距離聚類與模型聚類相結(jié)合的方法分析種質(zhì)資源，對充分掌握群體間和種質(zhì)間的親緣關系具有重要意義。

遺傳相似系數(shù)可判斷作物種質(zhì)資源親緣關系，在親緣關系研究中，遺傳相似系數(shù)越低則親緣關系越遠，說明材料之間遺傳差異越大[37]。岳文娣等[35]利用SSR引物分析中國芝麻種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)在0.546 2～0.981 1之間，其中東北、西北等區(qū)域的資源與黃淮、華中、華南等區(qū)域的資源親緣關系較遠；劉文萍等[9]分析98份芝麻種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)在0.280 ～0.996 之間，其中山西芝麻種質(zhì)與我國芝麻主產(chǎn)區(qū)芝麻種質(zhì)遺傳關系較遠，其遺傳相似系數(shù)集中在0.300 ～0.500 之間。本研究中，71份山西芝麻種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)為0.21～0.67，說明山西芝麻種質(zhì)資源遺傳差異相對較高，遺傳基礎較廣，具有豐富的遺傳多樣性，其中太谷芝麻1號、吉縣芝麻、柳林芝麻2號-1、絳縣大交-1、運城芝麻3號的遺傳相似系數(shù)的平均值較低，表明這5份芝麻種質(zhì)在整個群體的遺傳距離相對較遠，這為今后芝麻雜交育種及遺傳改良提供了材料基礎。

本研究對不同區(qū)域芝麻種質(zhì)亞群進行聚類分析，從聚類結(jié)果發(fā)現(xiàn)柳林、吳堡、臨縣、汾陽等山西西部地區(qū)芝麻種質(zhì)間遺傳距離較近，這可能是因為其芝麻種質(zhì)之間交流頻繁或地理環(huán)境相近，從而導致其遺傳基礎較一致，而吉縣、絳縣、定襄、文水、聞喜、運城等山西中部地區(qū)、山西南部地區(qū)芝麻種質(zhì)與山西西部地區(qū)芝麻種質(zhì)的遺傳距離較遠。同時對遺傳結(jié)構(gòu)分析得到的6個組群進行了聚類分析，發(fā)現(xiàn)組群1、組群3與組群4間的遺傳距離接近6個組群間的平均遺傳距離(0.091)，說明汾陽、吳堡、臨縣、柳林等山西西部地區(qū)芝麻種質(zhì)間遺傳距離較近，而組群1、組群3與組群5間的遺傳距離較大，說明山西西部地區(qū)芝麻種質(zhì)與山西中部、南部地區(qū)芝麻種質(zhì)的遺傳距離較遠，這與不同區(qū)域芝麻種質(zhì)亞群聚類分析結(jié)果相一致。因此，有必要加大對山西中部、南部地區(qū)芝麻種質(zhì)資源的收集、發(fā)掘與利用，為今后芝麻改良育種提供理論和材料基礎。

4 結(jié)論

本研究利用30對SSR標記對山西芝麻種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，每個SSR標記平均4.800 個等位基因，多態(tài)性信息含量平均為0.515，同時發(fā)掘出ZMM1935、ZMM4097、ZMM2133、ZMM1851、ZMM1550、ZMM1832等多態(tài)性較高的SSR標記，該研究結(jié)果為今后芝麻品種遺傳改良和功能分子標記開發(fā)提供了理論基礎?；赟SR標記對參試材料進行UPGMA聚類分析，發(fā)現(xiàn)參試材料的遺傳相似系數(shù)范圍為0.21～0.67，在遺傳相似系數(shù)0.27處將參試材料分為6個類群，同時對不同區(qū)域芝麻種質(zhì)亞群進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)山西西部地區(qū)芝麻種質(zhì)與中部、南部地區(qū)芝麻種質(zhì)的遺傳距離較遠。本研究不僅闡明了山西芝麻種質(zhì)遺傳多樣性，還為今后山西芝麻種質(zhì)資源的收集、發(fā)掘及利用提供了一定的理論和材料基礎。