段碧晗 高 凌

隨著2型糖尿病和高血壓發(fā)生率的明顯增加，伴有高血壓的糖尿病患者罹患心血管疾病的風(fēng)險增加了1倍[1]。而高鹽攝入被認(rèn)為是與生活方式有關(guān)的高血壓和心血管疾病的重要危險因素[2]。在人群中減少鹽的攝入被認(rèn)為是預(yù)防糖尿病等非傳染性疾病(non-communicable diseases，NCDs)的前5項干預(yù)措施之一[3]。為了減少NCDs，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)計劃將鹽攝入量減少30%，并將此計劃作為九個全球目標(biāo)之一[4]。目前高血壓和糖尿病的發(fā)生率逐年上升，兩種疾病都會導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，例如心血管疾病和慢性腎臟疾病等[5]。這會在很長一段時間內(nèi)增加死亡風(fēng)險，因此預(yù)防和延緩高血壓、糖尿病的發(fā)生是醫(yī)學(xué)面臨的巨大挑戰(zhàn)。

鹽作為一種無熱量的必需微量元素，最近發(fā)現(xiàn)它與糖尿病的發(fā)展有關(guān)。在一項縱向研究中發(fā)現(xiàn)，高鹽攝入量可以獨立預(yù)測糖尿病的發(fā)生[6]。胃腸道營養(yǎng)素觸發(fā)的信號，如胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)在調(diào)節(jié)能量攝入中起重要作用。GLP-1主要是由腸道的L細(xì)胞中產(chǎn)生的腸源激素，通過增加胰島素和抑制胰高血糖素分泌來控制膳食相關(guān)的血糖波動，同時還能抑制胃排空和食物攝入[7]。同時過量的鹽攝入與心血管疾病相關(guān)，并認(rèn)為是高血壓發(fā)病的病因之一[8]。高鹽飲食可通過不同途徑促進(jìn)高血壓的發(fā)展[9, 10]。有趣的是，GLP-1也為心血管系統(tǒng)帶來了好處。例如抑制高血壓的發(fā)展，減少心臟纖維化和肥大[11]。有報道稱，GLP-1可通過利尿和利鈉作用降低血壓，GLP-1受體的活化通過促進(jìn)心鈉素的分泌而降低血壓[11]。而高鹽飲食衰減GLP-1對血壓的保護(hù)作用[12, 13]。目前關(guān)于腸道GLP-1表達(dá)水平與小鼠飲食鹽攝入量之間關(guān)系的研究較少。本研究旨在觀察高鹽飲食后，小鼠糖脂代謝、血壓及腸道GLP-1表達(dá)的變化。

材料與方法

1.實驗動物與分組：20只8周大的C57BL/6雄性小鼠，SPF(specific pathogen free)級，由武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物實驗中心提供。實驗動物飼養(yǎng)在SPF級屏障環(huán)境中，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實驗。稱量實驗動物體質(zhì)量，依照數(shù)字表法隨機(jī)分為兩組，正常對照組:整個實驗過程中用普通飼料喂養(yǎng)小鼠(n=10)；高鹽組:小鼠接受特制高鹽飼料(n=10)，每組小鼠均自由進(jìn)食、飲水，接受同等的光照時長，實驗持續(xù)時間為8周。

2.試劑與儀器：特制8%高鹽飼料，高鹽飼料為在普通飼料基礎(chǔ)上每100g普通飼料添加 8g NaCl的8%高鹽特制飼料(江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司)，血糖儀與配套的血糖試紙(日本泰爾茂公司)，無創(chuàng)血壓系統(tǒng)(CODA，美國Kent Scientific公司)，稱量器(MP2001，上海舜宇恒平科學(xué)儀器公司)，分析天平(CP124S，德國賽多利斯公司)，正置顯微鏡(BX51，日本奧林巴斯公司)，生化自動分析儀(ADVIA2400，德國西門子公司)，病理切片機(jī)(RM2601，上海徠卡儀器有限公司)，4%甲醛固定液(武漢谷歌生物有限公司)，GLP-1抗體(武漢谷歌生物有限公司)，戊巴比妥鈉(德國Merck公司)。

3.空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)測定: 于實驗?zāi)?，將實驗小鼠禁?不禁水)14h后，抓取并固定小鼠，將尾尖剪去約3mm，采血約0.05ml，按照血糖儀說明書步驟測定小鼠尾靜脈快速血糖。

4.血壓測量：實驗8周后，使用標(biāo)準(zhǔn)無創(chuàng)尾部血測壓系統(tǒng)測量小鼠尾動脈血壓，保持小鼠安靜狀態(tài)，將袖帶附在尾巴上，然后記錄收縮壓和舒張壓，重復(fù)測量15次，取平均值為最終血壓值。

5.血脂檢測: 通過眼眶取血收集血液，離心后分離小鼠血清并保存至-80℃直至分析。血清甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(serum total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)使用全自動生化分析儀測量。

6.腸道(小腸上段) GLP-1檢測: 小鼠予1%戊巴比妥鈉麻醉(50mg/kg)，眼眶取血后處死，打開腹腔及胸腔，使用0.9%NaCl注射液對小鼠予以心臟灌流，待腎臟由紅色變?yōu)榛野咨纯?，分離出小腸，分別做好標(biāo)記后，將標(biāo)本固定于4%多聚甲醛中48h，脫水后進(jìn)行石蠟包埋，用于免疫組化實驗。根據(jù)免疫組化實驗步驟，檢測小鼠腸道 GLP-1的表達(dá)，通過正置顯微鏡觀察切片，采集圖像后分析結(jié)果。

結(jié) 果

1.小鼠一般情況比較：實驗前，高鹽組和對照組小鼠毛發(fā)光滑潤澤，反應(yīng)靈敏。實驗8周時，兩組外觀無明顯差別。于實驗第4周末及8周末時稱量小鼠體質(zhì)量，與對照組比較，高鹽組小鼠的體質(zhì)量增加差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，兩組小鼠體質(zhì)量情況詳見表1。

表1 兩組小鼠體質(zhì)量情況

2.小鼠血脂和FBG的比較：與正常對照組比較，實驗?zāi)?，在禁?不禁水)狀態(tài)下，8%高鹽飲食8周后，高鹽組FBG水平明顯高于正常對照組(P<0.05)。高鹽飲食組小鼠血清中TC、TG含量明顯升高(P<0.05)，HDL-C含量明顯降低(P<0.05)，兩組小鼠血清中LDL-C含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表2)。

3.小鼠血壓比較：與處理前比較，8%高鹽飼料喂養(yǎng)8周后，高鹽組收縮壓、舒張壓均顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表3)。

表3 小鼠實驗前后血壓比較

4.小鼠小腸上段GLP -1表達(dá)的變化：GLP-1的免疫反應(yīng)性位于腸道黏膜的卵圓形或錐體上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，其形態(tài)與腸道內(nèi)分泌細(xì)胞一致，小鼠小腸上段組織中GLP-1 陽性表達(dá)為胞質(zhì)內(nèi)淡黃色-棕黃色顆粒。與對照組比較，實驗8周后，小鼠小腸上段免疫組化染色結(jié)果顯示，高鹽組小鼠小腸上段GLP-1陽性細(xì)胞數(shù)量明顯少于對照組小鼠(P<0.05，圖1)。對照組和高鹽組小腸上段組織GLP-1陽性表達(dá)的平均累計吸光度分別為：對照組13.53±1.66，高鹽組6.58±2.11，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.011)。

圖1 小鼠小腸上段組織GLP-1表達(dá)的變化(免疫組化染色，×200)A.高鹽組；B.對照組;箭頭指示陽性細(xì)胞

討 論

每天適量的鹽攝入對于維持細(xì)胞外液、血壓、血管功能的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[14]。但現(xiàn)在越來越多的證據(jù)表明，高鹽飲食與許多疾病之間存在聯(lián)系。為了研究高鹽飲食對小鼠糖脂代謝、血壓及腸道GLP-1表達(dá)的影響，筆者分析了喂養(yǎng)高鹽飲食8周的小鼠FBG、血清血脂水平、血壓及腸道GLP-1表達(dá)情況。在這項研究中，盡管未觀察到小鼠體質(zhì)量的變化，但是，與對照組比較，8%高鹽飼料喂養(yǎng)8周后，小鼠表現(xiàn)出空腹血糖受損、血脂異常、血壓升高。另外，小鼠腸道GLP-1的表達(dá)也會減少。這些變化意味著高鹽攝入會影響小鼠的健康。實驗結(jié)果提示高鹽飲食可引起小鼠空腹血糖、血清血脂高于對照組，同時升高血壓。這可能與高鹽飲食導(dǎo)致GLP-1表達(dá)減少有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，8%高鹽飲食8周后，小鼠血壓水平與對照組比較升高。有研究表明血清活性GLP-1具有抗高血壓作用。GLP-1受體在腎臟中表達(dá)，介導(dǎo)利尿和利鈉作用[15]。研究表明，GLP-1對腎素-血管緊張素醛固酮具有抑制作用[16]。高鹽飲食后，腸道GLP-1表達(dá)水平降低，從而減弱GLP-1對血壓的保護(hù)作用。在一般人群中，空腹葡萄糖受損是一種常見的血糖異常，空腹葡萄糖受損被認(rèn)為是糖尿病前期狀態(tài)。在收縮壓≥140mmHg時，空腹血糖受損會顯著增加8年總病死率和心血管疾病病死率[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，高鹽組小鼠實驗8周后，F(xiàn)BG水平升高。GLP-1有利于降低血糖并使血糖維持在恒定水平。高鹽飲食后，小鼠FBG升高可能與腸道GLP-1表達(dá)水平降低有關(guān)。血清TC水平的升高被證明是冠心病的危險因素。同時，TG水平升高與心血管事件發(fā)生率增加獨立相關(guān)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)高鹽飲食使得血清TC、TG水平明顯升高，這一結(jié)果提示高鹽飲食與心血管疾病密切相關(guān)。

本研究檢測了小鼠小腸GLP-1的表達(dá)。GLP-1是腸內(nèi)分泌L細(xì)胞中產(chǎn)生的腸降血糖激素，并根據(jù)食物攝入而釋放到血液中[19]。此前的研究已經(jīng)提出，GLP-1可抑制胃排空，以抑制附加的食物攝取和餐后高血糖[20]。到目前為止，鹽調(diào)節(jié)GLP-1的分子機(jī)制尚不明確，可能通過以下作用機(jī)制起作用,首先，鈉葡萄糖同向共轉(zhuǎn)運蛋白1(sodium glucose co-transporter 1，SGLT-1)抑制后可增強腸促胰素GLP-1 分泌[21, 22]。此外，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，與正常飲食小鼠比較，高鹽飲食后小鼠腸道SGLT-1表達(dá)增加[23]?？赏茢喔啕}干預(yù)會降低并延遲GLP-1的分泌。其次有文獻(xiàn)報道，高鹽攝入(含5% NaCl)可導(dǎo)致自主神經(jīng)活動減弱。高鹽攝入引起的自主神經(jīng)活動減弱也可能導(dǎo)致GLP-1分泌減少。ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitive potassium channel，KATP)與葡萄糖觸發(fā)的GLP-1釋放有關(guān)，而醋酸脫氧皮質(zhì)酮鹽型高血壓大鼠中KATP功能是受損的。因此筆者推斷受損的KATP可能導(dǎo)致GLP-1釋放減少。這些研究共同表明，高鹽飲食可導(dǎo)致小鼠GLP-1的表達(dá)、分泌和釋放減少。

綜上所述，本研究表明高鹽飲食會降低小鼠小腸GLP-1的表達(dá)，并升高小鼠的血壓，影響小鼠的糖脂代謝，而小鼠的血壓和糖脂代謝與GLP-1密切相關(guān)。筆者希望提供有關(guān)高鹽攝入對心血管疾病、糖脂代謝影響的證據(jù)。高血壓和糖尿病為慢性病的兩大主要病種，在心血管疾病、糖尿病等慢性病防治中，應(yīng)強調(diào)對鹽攝入限制的重要性，減少鈉鹽的攝入，降低心血管疾病、糖尿病等疾病風(fēng)險。