倪 斌 沈百欣 衛(wèi)中慶

間質(zhì)性膀胱炎(interstitial cystitis, IC)又稱為膀胱疼痛綜合征(bladder painful syndrome, BPS)，是一種慢性炎癥性膀胱病變，臨床表現(xiàn)為與膀胱充盈相關(guān)的疼痛或盆腔不適，伴有下尿路癥狀如尿頻或尿急。全球范圍內(nèi)報道的發(fā)生率有明顯差異，如歐美地區(qū)發(fā)生率可達(dá)2.7%～6.5%，亞太地區(qū)約為0.10%～0.26%，女性患者比例高于男性[1，2]。與其他類型的慢性膀胱炎比較，目前臨床上對于IC的病因、定義及診斷標(biāo)準(zhǔn)均尚未達(dá)成共識。近年來研究顯示，該疾病可能與氧化應(yīng)激相關(guān)通路的激活密切相關(guān)，氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致膀胱氧化代謝性活動和抗氧化的生理保護(hù)機(jī)制之間的平衡受到破壞[3]。其中，核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)通路，作為氧化應(yīng)激反應(yīng)中最為重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)節(jié)多種抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，對于研究IC的發(fā)生、發(fā)展具有重大意義。本文就Nrf2通路在IC中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、Nrf2通路的概述

1.Nrf2的蛋白結(jié)構(gòu)：Nrf2是一種包含605個氨基酸，由7個結(jié)構(gòu)域(Neh1～7)組成的轉(zhuǎn)錄因子。Neh1結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)Nrf2與抗氧化元件序列的正確結(jié)合，N末端的Neh2結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了Nrf2負(fù)調(diào)控因子Keap1和賴氨酸殘基的相互作用并參與調(diào)節(jié)Nrf2的泛素化和蛋白降解，C末端的Neh3負(fù)責(zé)染色質(zhì)重塑后的反式激活，Neh4和Neh5均為轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)促進(jìn)Nrf2轉(zhuǎn)錄。此外，Neh6結(jié)構(gòu)域參與負(fù)反饋調(diào)節(jié)Nrf2穩(wěn)定性，Neh7結(jié)構(gòu)域則參與抑制Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性[4]。

2.Nrf2相關(guān)機(jī)制通路：細(xì)胞內(nèi)Nrf2的豐度受到Keap1的嚴(yán)格調(diào)控，在正常生理情況下，兩個Keap1分子在ETGE和DLG基序處與Nrf2的Neh2域結(jié)合，并將Nrf2隔離在細(xì)胞質(zhì)中。響應(yīng)于應(yīng)激條件，Keap1失活促進(jìn)了Nrf2從Keap1的解離并易位至細(xì)胞核中與sMaf蛋白結(jié)合，Nrf2-sMaf復(fù)合物以序列特異性方式與Nrf2靶基因的啟動子區(qū)域中的抗氧化劑反應(yīng)元件(5′-TGACXXXGC-3′)結(jié)合，并啟動一系列抗氧化基因表達(dá)，如NAD(P)H：醌氧化還原酶1(NADPH: quinone oxidoreductase 1,NQO1)、血紅素加氧酶-1(heme oxygenase 1,HO-1)等。除Keap1外，Nrf2活性還受p62/SQSTM1的調(diào)節(jié)，應(yīng)激條件下p62上調(diào)，從而螯合Keap1使Nrf2解離并易位入核[5]。另外，Nrf2活性也可以通過絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶糖原合酶激酶3(GSK-3)和E3連接酶銜接子β-TrCP介導(dǎo)的蛋白酶體降解機(jī)制控制，GSK-3在其Neh6域中磷酸化Nrf2，以促進(jìn)β-TrCP識別Nrf2，從而促進(jìn)Nrf2蛋白降解。

3.Nrf2參與調(diào)控的下游基因:(1)血紅素加氧酶-1:由HMOX1基因編碼的血紅素加氧酶-1是一種可誘導(dǎo)的抗氧化酶，它可以催化血紅素分子的分解從而導(dǎo)致游離Fe2+的釋放，為了防止羥自由基的形成，與HMOX1上調(diào)的同時，Nrf2增強(qiáng)了編碼鐵蛋白復(fù)合物的組分基因的表達(dá)，鐵蛋白復(fù)合物將Fe2+氧化為Fe3+，從而發(fā)揮解毒作用[6]。(2)NAD(P)H：醌氧化還原酶1:NAD(P)H：醌氧化還原酶1是一種普遍存在的胞質(zhì)Ⅱ期生物轉(zhuǎn)化酶，其主要生理學(xué)作用是催化醌的兩電子還原并發(fā)揮解毒作用，NQO1基因敲除小鼠IC模型表現(xiàn)出膀胱組織活性氧(reactive oxygen species, ROS)增加，能量代謝和黏附因子改變以及線粒體結(jié)構(gòu)喪失，這些因素共同導(dǎo)致凋亡細(xì)胞死亡增加及尿路上皮丟失[7]。(3)硫氧還蛋白：硫氧還蛋白是一種蛋白質(zhì)二硫鍵還原酶，可作為抗氧化劑保護(hù)蛋白質(zhì)免受氧化應(yīng)激的影響，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊，通過亞硝基化作用調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡并調(diào)節(jié)炎癥。(4)谷胱甘肽過氧化物酶：谷胱甘肽過氧化物酶是一種廣泛存在的過氧化物分解酶，能夠催化谷胱甘肽向氧化型谷胱甘肽的轉(zhuǎn)化，將有毒的過氧化物轉(zhuǎn)化為無毒代謝物，從而發(fā)揮保護(hù)作用。

二、Nrf2通路在間質(zhì)性膀胱炎中的研究進(jìn)展

1.Nrf2在間質(zhì)性膀胱炎中的表達(dá)：間質(zhì)性膀胱炎的獨特之處在于其不適用于感染性或非感染性膀胱炎的經(jīng)典區(qū)分，全球范圍內(nèi)定義及診斷標(biāo)準(zhǔn)仍存在巨大差異，目前IC的臨床診斷主要是通過病史采集及體格檢查，膀胱鏡下水?dāng)U張和膀胱黏膜活組織檢查，排除其他疾病如膀胱癌、腺性膀胱炎等。部分IC患者膀胱鏡下可見膀胱黏膜出現(xiàn)小球樣出血，僅10%左右的患者會出現(xiàn)典型的Hunner潰瘍。這種排他性診斷并不準(zhǔn)確且容易誤診，治療方式也十分有限。一項隨機(jī)對照實驗納入了16例女性IC患者及25例健康女性，分析并比較發(fā)現(xiàn)IC組中氧化應(yīng)激損傷明顯上調(diào)，相關(guān)氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)單獨使用并無特異性，聯(lián)合使用可以作為IC診斷中的標(biāo)志物[8]。在IC的相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎性介質(zhì)的作用貫穿疾病整個發(fā)展過程，Nrf2通路被認(rèn)為在該疾病發(fā)生、發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用。

目前最有說服力的理論學(xué)說描述了糖胺聚糖層的破壞和功能障礙，導(dǎo)致尿路上皮損傷，繼而引起炎性介質(zhì)浸潤及氧化應(yīng)激損傷，同時激活了Nrf2通路的表達(dá)，多種動物研究模型根據(jù)該理論學(xué)說建立，如環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide, CYP)腹腔注射，脂多糖膀胱內(nèi)灌注等。Mbanefo等[9]對CYP誘導(dǎo)的小鼠IC模型膀胱進(jìn)行了組織學(xué)檢測及轉(zhuǎn)錄譜分析，研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CYP處理后小鼠膀胱表現(xiàn)出明顯炎性水腫，轉(zhuǎn)錄譜分析顯示上調(diào)了一系列促炎基因表達(dá)，如IL-1β、TNF-α和IL-6等，更強(qiáng)調(diào)了Nrf2通路下游抗氧化基因HO-1的轉(zhuǎn)錄上調(diào)。使用魚精蛋白/脂多糖小鼠膀胱內(nèi)灌注后可誘導(dǎo)出類似IC排尿行為的改變、組織學(xué)的損傷以及各類氧化應(yīng)激指標(biāo)的升高，并檢測到Nrf2通路下游抗氧化基因表達(dá)明顯上升[10]。由此可見，Nrf2通路是IC的發(fā)生、發(fā)展過程中重要的調(diào)控靶點，基于Nrf2通路的相關(guān)研究對于IC的早期診斷、臨床治療及改善預(yù)后具有重大意義。

2.Nrf2通路相關(guān)治療手段在IC中的研究進(jìn)展

(1)激活Nrf2通路的天然抗氧化化合物：目前針對Nrf2通路的治療藥物富馬酸二甲酯已被FDA批準(zhǔn)用于治療多發(fā)性硬化癥，同樣有大量研究在探索是否有相關(guān)藥物可應(yīng)用于IC。Core等[11]研究發(fā)現(xiàn),紫花苜蓿中的活性成分百里香醌(thymoquinone)劑量依賴性地保護(hù)了小鼠膀胱組織學(xué)改變，抑制炎性細(xì)胞因子的釋放，并在小鼠膀胱組織內(nèi)檢測到Nrf2通路相關(guān)抗氧化基因的表達(dá)上調(diào)及氧化應(yīng)激指標(biāo)的降低。其他類似化合物在日常生活中也不難獲取，如叔丁基對羥基茴香醚、萊菔硫烷(sulforaphane, SFN)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)、蘋果汁、姜黃素等，這些天然化合物能夠通過誘導(dǎo)激活Nrf2及其下游靶基因的表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激及炎性介質(zhì)，對于IC的預(yù)防治療極具研究意義及研發(fā)前景。

(2)褪黑素：在CYP誘導(dǎo)的膀胱炎模型中用蘇木精和曙紅染色對膀胱的組織學(xué)鏡下觀察可以發(fā)現(xiàn)廣泛的膀胱炎，黏膜下層有明顯的白細(xì)胞浸潤。相反，在褪黑素(N-乙?；?5-甲氧基色胺)治療的膀胱中，尿道上皮保存良好且炎癥改變得到緩解[12]。褪黑素是一種主要由哺乳動物的松果體分泌的神經(jīng)激素，廣泛分布于人體器官中。褪黑素的生物學(xué)功能被廣泛研究，作為一個強(qiáng)大有效的抗氧化劑，可以清除不同類型的氧自由基并激活抗氧化劑防御功能，其中涉及多個通路，如NF-κB、Nrf2、MAPK通路等[13]。Tripathi等[14]研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素治療IC小鼠可增加膀胱組織中Nrf2及下游抗氧化基因的表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎性介質(zhì)分泌，從而減少膀胱損傷和細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素還可以改善膀胱過度活動等LUTS癥狀，并通過褪黑素受體激動劑對照實驗發(fā)現(xiàn)褪黑素改善膀胱功能主要是由于其抗氧化及抗炎特性[15]。因此，褪黑素由于其卓越的抗氧化能力且安全可靠，對于IC的預(yù)防及治療具有指導(dǎo)意義，但目前尚缺乏相關(guān)循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

(3)單克隆抗體：血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是一種促進(jìn)血管生成的多效細(xì)胞因子。研究表明，VEGF在IC患者尿液中高表達(dá)且與膀胱疼痛嚴(yán)重程度相關(guān)，可作為臨床診斷IC的尿液生物學(xué)標(biāo)志物[16]。同時在IC模型小鼠的膀胱中也檢測到VEGF的表達(dá)上調(diào)，其機(jī)制可能與炎性介質(zhì)的激活、趨化因子活化以及巨噬細(xì)胞募集增加相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，抗VEGF中和抗體應(yīng)用于IC小鼠模型可改善疼痛導(dǎo)致的骨盆超敏，但對排尿行為無明顯作用，而阻斷VEGF/VEGF受體2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可改善IC相關(guān)膀胱功能障礙[17，18]。其中相關(guān)具體機(jī)制尚不明確，有研究發(fā)現(xiàn)，VEGF可通過ERK1/2信號通路激活Nrf2通路，進(jìn)而上調(diào)其自身表達(dá)，同時Nrf2也可以通過Nrf2/HO-1/HIF-1α途徑上調(diào)VEGF的表達(dá)，促進(jìn)異常血管生成， 這可能部分解釋了以上研究結(jié)果。目前單克隆抗體在IC治療中的應(yīng)用研究甚少，相關(guān)具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探索，但其為IC治療提供了新的思路。

(4)干細(xì)胞療法：尿路上皮功能障礙是IC相關(guān)致病性的關(guān)鍵因素之一，而干細(xì)胞具有自我更新、增殖和分化為各種細(xì)胞類型的能力，包括尿路上皮和平滑肌細(xì)胞，因此干細(xì)胞療法被視為治療IC的最新策略。同樣的，在正常干細(xì)胞中，Nrf2誘導(dǎo)抗氧化劑基因使細(xì)胞內(nèi)ROS保持在較低水平，以抑制干細(xì)胞的過度增殖。人臍帶血干細(xì)胞可以顯著改善IC大鼠的排尿頻率，組織學(xué)分析顯示，可治愈IC的大多數(shù)病理特征，包括尿路上皮剝奪和肥大細(xì)胞浸潤，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和受損膀胱黏膜中的血管生成。同樣的，人間充質(zhì)干細(xì)胞在大鼠IC模型中已獲得成功進(jìn)展，Chen等[19]研究證明,聯(lián)合使用脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞和褪黑素可明顯改善IC癥狀。實驗發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合療法顯著下調(diào)了膀胱組織中炎性標(biāo)志物以及ROS相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，同時激活了Nrf2通路上調(diào)了抗氧化蛋白HO-1及NQO1的表達(dá)。此外，尿源性干細(xì)胞(USC)更容易獲得，抗炎作用明顯優(yōu)于其他干細(xì)胞，且具有完整的干細(xì)胞特性,更有改善膀胱功能障礙的潛力，因此被視為治療IC的最佳干細(xì)胞來源[20]。Li等[10]將USC應(yīng)用于IC大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，膀胱組織中Nrf2通路下游抗氧化蛋白HO-1及NQO1明顯上調(diào)，并下調(diào)了凋亡、氧化應(yīng)激、自噬相關(guān)標(biāo)志物，從而改善膀胱內(nèi)環(huán)境，發(fā)揮保護(hù)IC逼尿肌細(xì)胞的作用?？傊?，干細(xì)胞療法既依賴于Nrf2誘導(dǎo)的低ROS環(huán)境，又能在IC中通過激活上調(diào)Nrf2通路及其下游抗氧化基因表達(dá)，為IC的再生治療提供新的方案。

三、展 望

綜上所述，Nrf2通路在IC中可通過上調(diào)下游抗氧化基因表達(dá)，從而抑制氧化應(yīng)激損傷，改善膀胱功能。盡管近年來人們對IC的認(rèn)識已經(jīng)取得較大進(jìn)步，但仍缺乏早期診斷、有效治療和改善預(yù)后的相關(guān)手段，因此Nrf2通路對于IC的病理生理及治療手段的研究具有重要意義，但因缺乏客觀的功能評價體系，尚無法對IC動物模型的功能性活動進(jìn)行量化評價，相關(guān)具體機(jī)制及治療作用仍需進(jìn)一步探索。本文回顧并討論了Nrf2通路的概念和功能，并綜述了其在間質(zhì)性膀胱炎中的研究進(jìn)展，希望有助于以Nrf2通路為方向的臨床應(yīng)用研究。