王 雨 陳連鳳 王 偉 宋 瑋 嚴曉偉

褪黑素(melatonin)是脊椎動物的松果體合成的一種吲哚類激素，對機體膽固醇代謝具有調(diào)節(jié)作用[1]。膽固醇外流是將細胞內(nèi)游離膽固醇(free cholesterol,FC)等轉(zhuǎn)運到胞外HDL顆粒的過程，是膽固醇逆轉(zhuǎn)運的第一步，也是機體調(diào)控動脈粥樣硬化(atherosclerosis)發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵步驟[2]。其中，三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)在此過程中起重要作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素缺乏可導(dǎo)致大鼠巨噬細胞ABCA1介導(dǎo)的膽固醇外流功能降低，并導(dǎo)致ABCA1受體表達下降，但機制尚不明確[4]。筆者通過THP-1來源巨噬細胞體外培養(yǎng)，并用褪黑素溶液及相應(yīng)受體拮抗劑干預(yù)巨噬細胞，探討褪黑素調(diào)控巨噬細胞ABCA1表達的作用機制。

材料與方法

1.主要試劑:褪黑素干粉購自美國Sigma 公司。THP-1細胞購自北京中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞中心。RPMI-1640培養(yǎng)基購自英國Gibco-BRL公司。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、牛血清白蛋白(bovineserum albumin，BSA)購自美國Hyclone公司。佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)購自美國Sigma 公司。Trizol、總RNA 抽提試劑盒、cDNA合成試劑盒購自大連寶生物有限公司。ABCA1、LXRα和GAPDH引物購自上海生工生物工程股份有限公司。全蛋白提取試劑盒購自北京普利萊生物技術(shù)公司。兔抗人ABCA1 多克隆抗體、兔抗人LXRα多克隆抗體、兔抗人GAPDH 多克隆抗體購自英國Abcam公司。HRP 標記山羊抗兔IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。PPARγ抑制劑GW9662、非選擇性MT1/MT2受體拮抗劑Luzindole、選擇性MT2受體拮抗劑K185購自美國Sigma公司。LXRα抑制劑GSK2033購自美國Glaxo Smith Kline公司。

2.THP-1細胞的培養(yǎng)和巨噬細胞的分化：THP-1細胞在RPMI-1640培養(yǎng)基和10%胎牛血清中培養(yǎng)，37℃、5%CO2-95%空氣的恒溫培養(yǎng)箱中。THP-1細胞生長至對數(shù)期時接種于6孔板，在培養(yǎng)液中加入終濃度為100nmol/L的PMA誘導(dǎo)THP-1細胞向巨噬細胞分化24h。通過倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，流式細胞術(shù)檢測細胞表面特異性抗原CD14表達量的變化，鑒定THP-1細胞是否分化為巨噬細胞。

3.不同濃度褪黑素溶液對THP-1來源巨噬細胞ABCA1和LXRα的mRNA及蛋白表達的作用:將THP-1巨噬細胞分為對照組(陰性對照組)和褪黑素干預(yù)組。其中褪黑素干預(yù)組根據(jù)濃度又分為：50nmol/L濃度褪黑素干預(yù)組(褪黑素50nmol/L組)、100nmol/L濃度褪黑素干預(yù)組(褪黑素100nmol/L組)、500nmol/L濃度褪黑素干預(yù)組(褪黑素500nmol/L組)、1μmol/L濃度褪黑素干預(yù)組(褪黑素1μmol/L組)。對照組給予不含褪黑素的RPMI-1640培養(yǎng)基預(yù)處理24h，而褪黑素干預(yù)組分別給予50nmol/L、100nmol/L、500nmol/L和1μmol/L的褪黑素溶液預(yù)處理24h。

實時熒光定量PCR檢測：提取各組THP-1來源巨噬細胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。PCR引物用Primer 5.0軟件設(shè)計：ABCA1 基因上游引物: 5′-TACAGCCAGAAAGACACCAG-3′，下游引物:5′-CACAGTAGACTTTGGGAGAG-3′。LXRα基因上游引物:5′-TCAGCCGGGAGGACCAGATTG-3′，下游引物:5′-TCCGGAGGCTCACCAGTTTCATTA-3′。內(nèi)參基因GAPDH上游引物:5′-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3′，下游引物:5′-ACGACCAAATCCGTTGACTC-3′。實時熒光定量PCR實驗在ABI7500 RT-PCR儀上進行，通過各孔樣品的Ct值計算樣品mRNA相對內(nèi)參基因GAPDH的表達量。

蛋白免疫印跡實驗(Western blot)法分析：提取各組THP-1來源巨噬細胞胞質(zhì)蛋白，BCA蛋白定量后取50μg樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳分離和轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂牛奶溶液室溫封閉60min，分別加入ABCA1、LXRα和GAPDH的一抗(稀釋比1∶500～1∶800)，4℃孵育過夜。TBST洗膜15min×3次后，加入1∶2000稀釋的相應(yīng)二抗室溫孵育60min。再次用TBST洗膜15min×3次，ECL發(fā)光試劑盒顯色，X光片感光顯影，用Image J軟件分析各組ABCA1、LXRα和GAPDH的灰度值，將各組的ABCA1、LXRα分別與內(nèi)參GAPDH的灰度值進行比值化處理，并比較各組ABCA1和LXRα蛋白的相對表達量。

4.褪黑素調(diào)控THP-1來源巨噬細胞ABCA1表達的信號調(diào)控機制:通過上述濃度梯度實驗獲得的結(jié)果，后續(xù)實驗均采用濃度為1μmol/L的褪黑素溶液進行。

為明確褪黑素是否通過激活LXRα來調(diào)節(jié)ABCA1的表達，筆者應(yīng)用了LXRα拮抗劑GSK2033和PPARγ拮抗劑GW9662 進行后續(xù)實驗。THP -1來源巨噬細胞與10μmol/L的GSK2003(GSK組)或GW9662(GW組)溶液預(yù)孵育6h，然后與1μmol/L的褪黑素溶液干預(yù)24h。以未使用褪黑素的RPMI-1640培養(yǎng)基處理的細胞作為陰性對照(對照組)，以僅使用1μmol/L褪黑素處理的細胞作為陽性對照(褪黑素組)。24h后棄去干預(yù)溶液，然后收集細胞，進行蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法分析ABCA1和LXRα的蛋白表達情況。

為明確褪黑素是否通過褪黑素膜受體1型(MT1)或2型(MT2)介導(dǎo)的途徑調(diào)節(jié)ABCA1的表達，筆者使用了兩種拮抗劑:①非選擇性MT1/MT2拮抗劑luzindole (LUZ)；②選擇性MT2拮抗劑K185。THP-1來源巨噬細胞用10μmol/L LUZ(LUZ組)或K185(K185組)預(yù)孵育6h，然后用1μmol/L褪黑素處理24h，以未使用褪黑素的RPMI-1640培養(yǎng)基處理的細胞作為陰性對照(對照組)，以僅使用1μmol/L褪黑素處理的細胞作為陽性對照(褪黑素組)。24h后棄去干預(yù)溶液，然后收集細胞，進行Western blot法分析ABCA1蛋白表達情況。

結(jié) 果

1.不同濃度褪黑素溶液對THP-1來源巨噬細胞ABCA1和LXRα的mRNA及蛋白表達的作用:與對照組比較，隨著褪黑素濃度的增加，巨噬細胞ABCA1 mRNA和蛋白表達均顯著升高，且呈劑量依賴性(P<0.05，圖1A、圖2中A和C)。與對照組比較，褪黑素干預(yù)組LXRα mRNA和蛋白水平顯著升高，且呈劑量依賴性(P<0.05，圖1B及圖2中B、D)。

圖1 不同濃度褪黑素溶液干預(yù)體外培養(yǎng)THP-1來源巨噬細胞后ABCA1及LXRα mRNA相對表達量A.巨噬細胞ABCA1 mRNA相對表達量；B.巨噬細胞LXRα mRNA相對表達量;與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖2 不同濃度褪黑素溶液干預(yù)體外培養(yǎng)THP-1來源巨噬細胞后ABCA1及LXRα蛋白表達A.ABCA1蛋白Western blot法條帶圖；B.LXRα蛋白Western blot法條帶圖；C.ABCA1蛋白相對表達量柱形圖；D.LXRα蛋白相對表達量柱形圖；與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P=0.000

2.GSK2033或GW9662對經(jīng)褪黑素處理的THP-1來源巨噬細胞ABCA1和LXRα蛋白表達的影響:與對照組比較，褪黑素組的ABCA1蛋白表達水平顯著升高(P=0.000，圖3中A和C)。然而，GSK組的ABCA1蛋白表達水平顯著低于褪黑素組(P=0.000，圖3中A和C)。與上述結(jié)果類似，GW組對ABCA1表達相對褪黑素組存在顯著的抑制作用(P=0.000，圖3中A和C)。與對照組比較，褪黑素組的LXRα蛋白表達水平顯著升高(P=0.000，圖3中B和D)。然而，與褪黑素組比較，GSK組的LXRα蛋白表達保持不變(圖3中B和D)。GW組的LXRα蛋白表達相比褪黑素組顯著下降(P=0.000，圖3中B和D)。

圖3 經(jīng)褪黑素處理和GSK2033或GW9662預(yù)處理的THP-1來源巨噬細胞ABCA1和LXRα的蛋白表達A.ABCA1蛋白Western blot法條帶圖；B.LXRα蛋白Western blot法條帶圖；C.ABCA1蛋白相對表達量柱形圖；D.LXRα蛋白相對表達量柱形圖;與對照組比較，*P=0.000;與褪黑素組比較，#P=0.000

3.LUZ或K185對經(jīng)褪黑素處理的THP -1來源巨噬細胞ABCA1蛋白表達的影響：與對照組比較，褪黑素組的ABCA1蛋白表達水平顯著升高(P=0.000，圖4)。然而，與褪黑素組比較，LUZ組或K185組中褪黑素上調(diào)的ABCA1蛋白表達均未被抑制(圖4)。

圖4 經(jīng)褪黑素處理和LUZ或 K185預(yù)處理的THP-1來源巨噬細胞ABCA1和LXRα的蛋白表達A.ABCA1蛋白Western blot法條帶圖；B.ABCA1蛋白相對表達量柱形圖；與對照組比較，*P=0.000

討 論

ABCA1在預(yù)防動脈粥樣硬化疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[5]。Matsunaga等[6]早期研究發(fā)現(xiàn)，人類ABCA1表達缺陷可導(dǎo)致Tangier病，其特征是患者血漿高密度脂蛋白膽固醇水平大幅降低，其膽固醇外排功能受損，細胞內(nèi)膽固醇酯積聚。因此，Tangier病患者往往比正常人更早發(fā)生冠狀動脈性心臟病和外周動脈粥樣硬化性疾病[7]。而上調(diào)ABCA1的表達及其膽固醇外排功能均能發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用[8]。為明確褪黑素對ABCA1 表達的直接影響作用，筆者用不同濃度的褪黑素體外干預(yù)THP-1 來源的巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)褪黑素可同時上調(diào)ABCA1 轉(zhuǎn)錄和蛋白水平，表明一定藥理劑量濃度的褪黑素可以直接影響ABCA1 的表達水平，尤其以1μmol/L濃度的褪黑素干預(yù)組最為顯著。

研究表明，ABCA1的表達可能受到多種核轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，包括肝X受體(LXR)、視黃素X受體(RXR)和過氧化物酶體增殖激活受體(PPAR)，而PPAR被認為是LXR的上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[9～12]。其中，PPARγ-LXRα通路是目前研究最深入的調(diào)控ABCA1表達和功能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其與動脈粥樣硬化發(fā)生過程密切相關(guān)[13]。本研究結(jié)果表明，作為PPARγ拮抗劑，GW9662顯著抑制了褪黑素對ABCA1和LXRα表達的促進作用，表明PPARγ參與了褪黑素對ABCA1促表達作用，并同時影響了LXRα的表達。這與之前報道的PPARγ對LXRα存在調(diào)控作用的結(jié)果一致[14]。而GSK2033 顯著抵消了褪黑素上調(diào)ABCA1作用，但其并不影響LXRα 的蛋白表達。這一方面表明，LXRα拮抗劑可能對LXRα僅發(fā)揮功能性阻斷作用；另一方面表明，LXRα 也參與了褪黑素對ABCA1 表達的調(diào)控。因此筆者推測褪黑素通過PPARγ-LXRα-ABCA1參與的途徑調(diào)節(jié)巨噬細胞ABCA1的表達。

既往研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素通過與其膜受體MT1和MT2或核受體相互作用，從而調(diào)節(jié)哺乳動物的一些生理功能[15]。而本研究結(jié)果表明，褪黑素膜受體MT1和MT2都不參與褪黑素誘導(dǎo)的ABCA1表達。Cecon等[16]研究認為，褪黑素作為親脂性激素，可以進入細胞直接與核轉(zhuǎn)錄因子相互作用，而不經(jīng)過細胞的膜受體。Zhang等[17]研究表明，褪黑素核受體與PPAR γ交互作用可能影響體外培養(yǎng)細胞的部分功能表達。因此筆者推測，褪黑素可能通過核受體而非膜受體參與調(diào)節(jié)ABCA1的表達。

綜上所述，褪黑素可劑量依賴性的上調(diào)巨噬細胞ABCA1的表達，PPARγ-LXRα通路參與了褪黑素對ABCA1表達的調(diào)節(jié)作用，且該調(diào)節(jié)作用不依賴褪黑素膜受體。