楊亞蘭，張震陽，謝元棟，李澤華，劉曉莉，李 毅

腫瘤、創(chuàng)傷、感染、牙周疾病等可引起頜面部骨組織缺損，植骨術(shù)作為常用的治療手段，存在骨供體有限、疾病傳播、免疫排斥、可能導(dǎo)致供體區(qū)并發(fā)癥等問題[1]。在這種背景之下，骨組織工程逐漸興起，它利用工程學(xué)和生命科學(xué)的原理開發(fā)骨替代物，為修復(fù)口腔骨缺損，重建其功能提供了一種新型手段。骨組織工程包括三個(gè)要素：支架、細(xì)胞和生長信號(hào)。支架通過模擬細(xì)胞外基質(zhì)的微環(huán)境，為細(xì)胞生長、分化和骨組織形成提供結(jié)構(gòu)支持。為了滿足骨組織工程的需要，理想的支架應(yīng)具有生物降解性、機(jī)械穩(wěn)定性、骨傳導(dǎo)性、骨誘導(dǎo)性及3D多孔結(jié)構(gòu)等特征，而現(xiàn)有的純支架材料存在機(jī)械強(qiáng)度低、抗降解性差等問題，因此常采用交聯(lián)法對(duì)支架進(jìn)行改性。

交聯(lián)誘導(dǎo)支架材料與交聯(lián)劑發(fā)生反應(yīng)，形成氫鍵、離子鍵或者共價(jià)鍵，從而改善支架材料性能[2]。目前，交聯(lián)分為三種方式：物理交聯(lián)、化學(xué)交聯(lián)和酶交聯(lián)。由于物理交聯(lián)的效率較低、交聯(lián)鍵弱，酶交聯(lián)的費(fèi)用高昂、具有底物特異性，而化學(xué)交聯(lián)能夠產(chǎn)生均勻而高效的交聯(lián)且成本適中[3]，因而化學(xué)交聯(lián)成為了目前的研究熱點(diǎn)?？谇还墙M織工程中常用的化學(xué)交聯(lián)劑主要分為合成交聯(lián)劑和天然交聯(lián)劑。本文就一些常用化學(xué)交聯(lián)劑的特點(diǎn)、機(jī)制及應(yīng)用作一綜述。

1 常用交聯(lián)劑的特點(diǎn)及交聯(lián)機(jī)制

1.1 合成交聯(lián)劑

1.1.1 戊二醛 戊二醛(glutaraldehyde，GTA)是一種同型雙功能交聯(lián)劑，它的兩個(gè)醛基能夠與蛋白質(zhì)、多糖等聚合物的氨基或羥基發(fā)生反應(yīng)[4]，形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵。

GTA具有成本低、反應(yīng)效率高等優(yōu)點(diǎn)，常采用蒸汽或溶液形式進(jìn)行交聯(lián)[5]。GTA蒸汽多用于交聯(lián)多孔材料，避免了在材料中產(chǎn)生表面張力，無需反復(fù)冷凍干燥[6]，但它交聯(lián)材料費(fèi)時(shí)，且會(huì)受材料厚度影響而導(dǎo)致交聯(lián)不良。GTA溶液交聯(lián)材料速度相對(duì)較快，且交聯(lián)效果好，但殘留的GTA難以完全清除。GTA的醛基能夠與細(xì)胞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸發(fā)生反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至凋亡，引起宿主組織的炎癥和鈣化[7]，具有高細(xì)胞毒性，因而限制了其在材料改性中的應(yīng)用。

目前，學(xué)者們針對(duì)GTA的細(xì)胞毒性，提出了一些降低其毒性的策略。如用蒸餾水、磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer saline, PBS)反復(fù)沖洗，并用甘氨酸[7]、賴氨酸等氨基酸溶液或硼氫化鈉溶液中和支架上游離的醛基[8]。Casali等[9]發(fā)現(xiàn)用超臨界CO2對(duì)交聯(lián)的膠原膜處理僅1 h，即可去除超過95%的殘留GTA，且未影響膠原膜原有的機(jī)械性能。盡管上述方法能夠在一定程度上降低GTA交聯(lián)支架的毒性，但仍無法解決GTA從支架中逐漸釋放所帶來的毒性影響。

EDC是一種“零長度”交聯(lián)劑，即在介導(dǎo)兩個(gè)分子交聯(lián)時(shí)，不會(huì)引入新的物質(zhì)，在反應(yīng)結(jié)束后，它本身不留在支架中，而是轉(zhuǎn)變成一種細(xì)胞毒性極低的尿素副產(chǎn)物，這種副產(chǎn)物與過量的EDC可以通過稀酸或水從支架上洗滌去除[11]。通常將N-羥基琥珀酰亞胺與EDC聯(lián)用以減少副反應(yīng)，穩(wěn)定中間產(chǎn)物[12]。

同樣，EDC也具有一定的局限性。首先，EDC在交聯(lián)過程中會(huì)消耗支架材料中細(xì)胞識(shí)別所需的氨基酸側(cè)鏈，影響細(xì)胞對(duì)支架的粘附[13]。針對(duì)這一缺點(diǎn)，Malcor等[14]將含有細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)的三螺旋肽結(jié)合到膠原膜支架上，增強(qiáng)細(xì)胞的粘附和擴(kuò)散；Bax等[13]將EDC與紫外線輻射結(jié)合交聯(lián)膠原膜，減少EDC的用量，保留細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)支架的粘附，同時(shí)紫外線誘導(dǎo)膠原的芳香族側(cè)鏈交聯(lián)，維持膠原膜的力學(xué)性能。其次，與GTA相比，EDC交聯(lián)支架的機(jī)械性能及抗降解性較差[5]。另外，EDC的交聯(lián)效率呈pH依賴性，在pH 4～6時(shí)交聯(lián)效率最佳，在堿性條件下交聯(lián)效率很低，而支架上的氨基基團(tuán)在堿性條件下則反應(yīng)活性更好，這可能會(huì)影響EDC對(duì)支架的改性效率[10]，后述的兩個(gè)問題仍有待進(jìn)一步的研究。

1.2 天然交聯(lián)劑

1.2.1 京尼平 京尼平(genipin，GP)是一種從梔子果實(shí)中提取出來的梔子苷水解產(chǎn)物，其毒性比GTA低[15]。GP具有多個(gè)活性基團(tuán)，如羥基和羧基，能夠自發(fā)地與蛋白質(zhì)、殼聚糖等的伯胺基發(fā)生反應(yīng)[16]。GP在交聯(lián)時(shí)會(huì)發(fā)出熒光，可通過監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度來追蹤交聯(lián)效率及支架降解情況[17]。

GP交聯(lián)效率與GTA相近，且細(xì)胞毒性較小，是一種有前景的交聯(lián)劑，但GP的細(xì)胞毒性具有劑量依賴性及種屬、細(xì)胞特異性，高濃度時(shí)可影響細(xì)胞活性，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[18]，低濃度時(shí)對(duì)部分細(xì)胞仍有明顯細(xì)胞毒性[19]。因此在應(yīng)用時(shí)應(yīng)將使用劑量、交聯(lián)效果與細(xì)胞毒性綜合考慮。另外，由于GP的產(chǎn)量低、價(jià)格昂貴，限制了其推廣，目前主要用于實(shí)驗(yàn)研究，因此GP的提取步驟有待優(yōu)化，提取產(chǎn)量有待提高。

1.2.2 檸檬酸 檸檬酸(citric acid，CA)是一種有機(jī)三羧酸，可以從植物中的檸檬、柑橘及動(dòng)物的骨骼、牙齒等物質(zhì)中提取出來。CA的三個(gè)羧基可與氨基和羥基反應(yīng)，形成較為穩(wěn)定的共價(jià)鍵，從而為多糖和蛋白質(zhì)等提供交聯(lián)[20]。CA脫氫后產(chǎn)生的共軛堿基可以參與三羧酸循環(huán)[21]，并且支架降解釋放的CA片段可作為細(xì)胞的營養(yǎng)物質(zhì)，因此CA具有良好的生物相容性。此外，CA基聚合物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有顯著的抑菌作用，這歸因于CA基聚合物中檸檬酸鹽衍生的大量游離羧基能螯合細(xì)胞壁中的金屬離子，改變細(xì)胞壁的通透性，影響細(xì)菌對(duì)營養(yǎng)的吸收，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷然后死亡[22]。

1.3 其他交聯(lián)劑

1.3.1 環(huán)氧化合物 環(huán)氧化合物(epoxy compounds，ECs)是一種具有三元環(huán)醚結(jié)構(gòu)的化合物，在酸或堿的催化下可與聚合物中的氨基、羥基、羧基等官能團(tuán)產(chǎn)生開環(huán)反應(yīng)[23]，發(fā)生三點(diǎn)交聯(lián)，生成具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的大分子，故采用ECs交聯(lián)的支架材料機(jī)械性能表現(xiàn)優(yōu)良。目前，ECs常用于心臟瓣膜、氣管、血管等部位支架的改性，經(jīng)其處理的生物材料具有良好的生物相容性、柔韌性及親水性、較低的免疫原性、較強(qiáng)的抗鈣化能力[24]。ECs在交聯(lián)過程中可能會(huì)因?yàn)榻宦?lián)不完全而殘留環(huán)氧基，后者具有一定的細(xì)胞毒性，但通過處理，環(huán)氧基易水解生成羥基，其細(xì)胞毒性降低[25]，能夠滿足醫(yī)用材料的安全要求。由此可見，采用ECs交聯(lián)的支架材料綜合性能優(yōu)良。目前常用的ECs有乙二醇二縮水甘油醚(商用環(huán)氧樹脂)、聚乙二醇二縮水甘油醚等。

1.3.2 低聚原花青素 原花青素是一類可從多種植物(如花生皮、葡萄籽)中提取出來的多酚類化合物，由單體兒茶素通過碳—碳鍵聚合而成，其中聚合度小于10的聚合物稱為低聚原花青素(oligomericproanthocyanidins，OPCs)。OPCs含有多個(gè)酚羥基，多通過與其他聚合物之間形成非共價(jià)鍵(如氫鍵)發(fā)揮交聯(lián)作用。研究發(fā)現(xiàn)，OPCs能夠增強(qiáng)膠原蛋白網(wǎng)絡(luò)的交聯(lián)密度，從而增強(qiáng)牙本質(zhì)彈性模量[26]。天然來源的OPCs對(duì)細(xì)胞的毒性很小，甚至能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖[27-28]。此外，OPCs有一定的抗炎作用?；钚匝踝鳛橐环N炎癥信號(hào)因子及炎性介質(zhì)，在濃度較高時(shí)會(huì)導(dǎo)致傷口缺血性修復(fù)不良，而富含羥基的OPCs具有強(qiáng)大的抗氧化性，從而加速傷口愈合[29]。

2 在口腔骨組織工程支架改性中的應(yīng)用

2.1 改善機(jī)械性能

骨組織工程支架對(duì)力學(xué)性能的要求較為復(fù)雜，需具有抗壓縮、抗拉伸、抗疲勞等特性，以承受負(fù)荷，維持缺損部位的空間結(jié)構(gòu)，為組織新生提供結(jié)構(gòu)支持。Yang等[5]比較了GP、GTA、EDC對(duì)明膠海綿支架交聯(lián)后壓縮彈性模量的影響，結(jié)果表明，三個(gè)交聯(lián)組的機(jī)械強(qiáng)度明顯提高，干燥狀態(tài)下均達(dá)到700 kPa以上，在濕潤狀態(tài)下，GP和GTA組的壓縮模量顯著高于EDC組。這提示著GP和GTA的交聯(lián)效率相當(dāng)，能夠與明膠產(chǎn)生高度交聯(lián)，在濕潤狀態(tài)下溶脹程度較小，從而保持較高的機(jī)械強(qiáng)度。Babo等[30]制備了經(jīng)GP交聯(lián)的血小板裂解物(platelet lysate，PL)支架。PL來源于血清，機(jī)械強(qiáng)度較差。PL經(jīng)交聯(lián)后不會(huì)發(fā)生收縮，能持續(xù)穩(wěn)定釋放生長因子，并表現(xiàn)出粘彈性，特別適用于諸如牙周膜等承受動(dòng)態(tài)機(jī)械負(fù)荷的組織。

通常，支架機(jī)械強(qiáng)度的增加會(huì)伴隨著支架孔隙率的降低。支架孔隙的大小、形狀、數(shù)量、互通性等也會(huì)影響成骨效果，研究表明支架的孔徑大于100 μm、孔隙率高于80%更有利于細(xì)胞和組織長入支架[31]。Goudouri等[32]分別采用GP和EDC交聯(lián)，制備了孔隙彼此貫通、孔徑300～600 μm及孔隙度90%以上的復(fù)合支架，這種高度多孔隙結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞的粘附增殖、植入?yún)^(qū)域的血運(yùn)重建及營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物的轉(zhuǎn)運(yùn)，最終成功促進(jìn)牙槽骨再生。

2.2 增強(qiáng)抗降解性能

支架材料在較長時(shí)間內(nèi)維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性至關(guān)重要，通過交聯(lián)可以顯著減緩其降解速度，使支架在足夠長的時(shí)間內(nèi)為細(xì)胞增殖、分化和骨再生提供結(jié)構(gòu)支持。Yang等[5]在體外實(shí)驗(yàn)中比較了分別采用GP、GTA、EDC交聯(lián)的明膠海綿支架的抗水解性，結(jié)果顯示，未交聯(lián)組在幾分鐘內(nèi)完全溶解，而GTA和GP組1個(gè)月內(nèi)幾乎無質(zhì)量損失，5個(gè)月后仍保留原質(zhì)量的94%，EDC組的質(zhì)量1個(gè)月內(nèi)下降到87.3%，5個(gè)月后損失近50%。Shalumon等[31]在PBS溶液中對(duì)比了分別采用EDC和GTA交聯(lián)明膠/羥基磷灰石凝膠支架的抗水解性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EDC交聯(lián)組的抗水解性與GTA交聯(lián)組相比較差，推測(cè)可能是由于EDC交聯(lián)產(chǎn)生的酰胺鍵親水性強(qiáng)，而GTA交聯(lián)產(chǎn)生的亞胺鍵有更高的水解穩(wěn)定性。

由于支架在植入體內(nèi)后還會(huì)受到多種酶的消化，因此，除抗水解性之外，支架還需要具有一定的抗酶解性。有學(xué)者將經(jīng)GTA交聯(lián)的血清來源支架接種人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞后植入大鼠下頜骨缺損處，90 d觀察到支架仍有部分保留，成功誘導(dǎo)缺損處的骨再生[33]。隨后Redondo等[34]在臨床研究中驗(yàn)證了上述GTA交聯(lián)支架修復(fù)上頜骨囊性骨缺損的能力，并且沒有嚴(yán)重的不良反應(yīng)產(chǎn)生。然而，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，支架材料延遲降解可能會(huì)引發(fā)炎癥反應(yīng)而影響再生骨骼的質(zhì)量[35]。Yang等[5]的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證明了這一點(diǎn)，他們分別將經(jīng)GTA、GP和EDC交聯(lián)的支架材料植入大鼠皮下后發(fā)現(xiàn)，交聯(lián)明顯延長了支架的降解時(shí)間，免疫排斥反應(yīng)較重，材料周圍均有較厚的組織增生。因此，如何在通過交聯(lián)提高支架抗降解性的同時(shí)保證支架的生物相容性，仍是有待解決的問題。

2.3 潛在的成骨作用

骨主要由羥基磷灰石晶體鑲嵌于膠原纖維之間組成。有些交聯(lián)劑除發(fā)揮交聯(lián)作用外，還對(duì)新生骨形成起調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)CA是一種天然的磷酸鈣成核分子，在礦化過程中對(duì)誘導(dǎo)和穩(wěn)定羥基磷灰石的生長起重要作用，從而參與調(diào)節(jié)骨礦化[36]。Raucci等[37]采用CA交聯(lián)制備可注射纖維素水凝膠，研究CA對(duì)成骨分化的影響。結(jié)果表明粘附于交聯(lián)水凝膠表面的細(xì)胞其堿性磷酸酶活性顯著提高，并且這些細(xì)胞表達(dá)骨相關(guān)標(biāo)志物的基因上調(diào)。Chen等[38]將CA交聯(lián)支架放入模擬體液鹽溶液中，觀察到支架表面有礦化球狀晶體沉積，并且這些晶體的數(shù)量和大小隨時(shí)間延長而增加。Shalumon等[31]分別采用EDC和GTA交聯(lián)制備明膠/羥基磷灰石凝膠支架，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EDC交聯(lián)組細(xì)胞的堿性磷酸酶活性顯著高于GTA組，產(chǎn)生的鈣結(jié)節(jié)鈣磷含量最高，鈣磷比值最接近于理想比值(1.67)，成骨相關(guān)基因表達(dá)(堿性磷酸酶、骨鈣素、骨橋蛋白、Ⅱ型膠原)均高于GTA組，這些表明相比GTA，EDC在促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化方面更有優(yōu)勢(shì)。Kulakowski等[28]采用經(jīng)OPCs處理的牙本質(zhì)基質(zhì)培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)參與牙本質(zhì)形成和生物礦化的關(guān)鍵基因(骨鈣蛋白、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2等)上調(diào)。但CA、EDC、OPCs作為交聯(lián)劑在口腔骨組織工程領(lǐng)域的研究較少，其成骨作用仍有待進(jìn)一步研究。

2.4 其他作用

交聯(lián)可以將一些具有促進(jìn)骨再生、血管再生等作用的生物活性物質(zhì)(如藥物、生長因子)添加至支架上，并調(diào)節(jié)這些活性物質(zhì)的釋放速率，從而充分發(fā)揮其生物學(xué)作用。有研究表明，經(jīng)交聯(lián)后控制釋放的生物活性物質(zhì)，可以誘導(dǎo)更多的骨組織形成[39]。Das等[40]采用EDC將血管內(nèi)皮生長因子和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-6交聯(lián)至聚乳酸-乙交酯共聚物支架上，并使得兩者持續(xù)釋放達(dá)21 d，進(jìn)一步將支架植入大鼠下頜骨的缺損部位，發(fā)現(xiàn)含有兩種生長因子的實(shí)驗(yàn)組顯著增強(qiáng)了缺損部位的骨形成以及血管增殖。交聯(lián)還可將一些修飾蛋白接枝到支架材料上，對(duì)支架進(jìn)行改性。Luo等[41]采用EDC將一種介導(dǎo)細(xì)胞粘附的整合素配體與缺乏細(xì)胞粘附配體的海藻酸鹽交聯(lián)，增強(qiáng)后者對(duì)細(xì)胞的親和力，促進(jìn)細(xì)胞粘附增殖，提高細(xì)胞存活率。

此外，交聯(lián)可以修飾天然支架材料的抗原位點(diǎn)，降低其抗原性[42]。有研究發(fā)現(xiàn)，與未交聯(lián)支架相比，交聯(lián)支架上的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長良好，細(xì)胞增殖和附著更多，并且更有利于細(xì)胞的成骨分化[43-44]。但也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)支架經(jīng)交聯(lián)后可能會(huì)引起異物反應(yīng)，從而影響組織再生[45]。因此，交聯(lián)支架的生物相容性仍需更多的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

3 總結(jié)及展望

骨組織工程要求支架具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度及抗降解性，以支撐新骨形成，化學(xué)交聯(lián)劑可顯著增強(qiáng)支架材料的上述性能，但這些性能應(yīng)與細(xì)胞生長、細(xì)胞外基質(zhì)分泌及骨組織再生相匹配，因此應(yīng)根據(jù)骨組織生長特性選擇合適的交聯(lián)劑及交聯(lián)條件，從而調(diào)節(jié)支架的降解速率。修復(fù)頜面骨缺損的支架其降解速率應(yīng)控制在3～6個(gè)月。

此外，支架材料應(yīng)具有良好的生物相容性，而當(dāng)前用于支架材料改性的大多數(shù)交聯(lián)劑的一些非反應(yīng)性殘基具有細(xì)胞毒性。目前來看，通過降低交聯(lián)劑的濃度或者封閉其毒性基團(tuán)來降低其細(xì)胞毒性是較為有效的方式。我們?nèi)匀恍枰_發(fā)新的交聯(lián)方法及交聯(lián)劑，探索交聯(lián)參數(shù)，以制備機(jī)械性能、抗降解性和生物相容性俱佳的支架材料。