周紅艷，張曉旻，曹 靈，王 玨，梅予鋒

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

Estiseal F光固化窩溝封閉劑、35%GLUMA釉質(zhì)酸蝕凝膠(Heraeus，德國(guó))；37 ℃恒溫培養(yǎng)箱(精宏，中國(guó)上海)；4 ℃冰箱(海爾，中國(guó)山東)；抗酸指甲油(Maybelline，美國(guó))；低速切割機(jī)(Isomet 1000，美國(guó))；體視顯微鏡XTB-1型(江南光學(xué)儀器廠)；低速杯狀刷(TPC，美國(guó))；高速1/2球鉆(FG1/2，DENSPLY，美國(guó))；原子力顯微鏡(Veeco，Autopbobe CP-R型，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本選擇 2017年7月—10月在南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院頜面外科收集50顆因阻生拔除的下頜第三磨牙。納入標(biāo)準(zhǔn)：牙體完整，無(wú)齲壞，無(wú)磨耗，無(wú)隱裂，無(wú)染色，無(wú)釉質(zhì)發(fā)育不良，深窩溝明顯。4 ℃生理鹽水浸泡保存。深窩溝的標(biāo)準(zhǔn)為:肉眼觀察離體牙，看不到窩溝底部，可以插入或卡住探針[4]。

1.2.2 樣本分組與操作方法 將50 顆離體牙隨機(jī)編號(hào)分組，每組10顆，共5組。使用1/2球鉆對(duì)窩溝進(jìn)行釉質(zhì)成形[5]，35%磷酸酸蝕30 s，沖洗后干燥，涂封閉劑，組1即刻光照40 s 使其固化。組2、3、4、5組標(biāo)本分別停留15 s、30 s、45 s、60 s后光固化40 s。

窩溝封閉完成后要求所有深窩溝均被窩溝封閉劑覆蓋，并探診光滑，無(wú)氣泡。然后將樣本浸泡于37 ℃生理鹽水中24 h，分別浸入5 ℃和55 ℃蒸餾水中進(jìn)行500個(gè)溫度循環(huán)，每個(gè)溫度停留30 s。用浸蠟法包裹整個(gè)牙根，對(duì)距封閉劑邊緣1.0 mm外的牙冠涂布3層指甲油，待指甲油干燥后，將樣本浸泡于37 ℃ 1%的亞甲基藍(lán)溶液中24 h后取出，流水沖洗24 h，于4 ℃蒸餾水中儲(chǔ)存。截除牙根，用蠟塊固定牙冠，用低速切割機(jī)沿近遠(yuǎn)中[6]窩溝片切標(biāo)本，每個(gè)樣本得到2個(gè)切片，共100個(gè)切片。

1.2.3 滲透率和微滲漏測(cè)定 分別由兩位檢查者在帶測(cè)微器目鏡的體視顯微鏡( ×30)下，對(duì)每個(gè)切片進(jìn)行檢測(cè)，Kappa 值為0.87。測(cè)量方法參考Bahar法[7]。測(cè)量并記錄切片中最深窩溝內(nèi)封閉劑滲透深度的網(wǎng)格數(shù)(e)、窩溝深度的網(wǎng)格數(shù)(e+f)及染料滲漏的網(wǎng)格數(shù)(a+c)、封閉劑與窩溝交界面的網(wǎng)格數(shù)(b+d)[8](圖1)。封閉劑滲透率=e÷(e+f)×100%，微滲漏率=(a+c)÷(b+d)×100%。

圖1 測(cè)量方法示意圖Fig.1 Schematic diagram of measurement method

1周后，重復(fù)測(cè)定，每個(gè)切片經(jīng)過(guò)2次評(píng)估共有4次測(cè)定值，記錄其平均值。

1.2.4 原子力顯微鏡的超微結(jié)構(gòu)觀察 根據(jù)體視顯微鏡結(jié)果選取即刻組及30 s組切片固定于硬組織切片機(jī)上，平行切片，切成約1 mm厚硬幣大小，徹底干燥保存。將樣品固定在原子力顯微鏡XY掃描臺(tái)上，用監(jiān)視器定位樣本的封閉劑-釉質(zhì)交界面，在大氣中進(jìn)行掃描成像。儀器工作方式為輕敲式，MPP-11123-10硅探針，所用的微懸臂力常數(shù)為20～80 N/m， 掃描長(zhǎng)度為5 μm。利用儀器自帶的軟件(Image Processing Software Version 2.1)進(jìn)行圖像數(shù)據(jù)的采集。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用K個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 滲透及微滲漏情況

窩溝封閉不同滲透時(shí)間組的滲透率與邊緣微滲漏率見(jiàn)(表1)。隨著滲透時(shí)間的增長(zhǎng)，封閉劑的滲透率明顯增加，在30 s時(shí)達(dá)到高峰，45 s及60 s時(shí)滲透率又平緩下降。K個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)顯示，5組的滲透率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.031)，即刻固化組與30 s、45 s及60 s組均有顯著差異(P<0.05)，其余各組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。而各組的邊緣微滲漏率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表1 不同滲透時(shí)間組封閉劑的滲透率及微滲漏率 Tab.1 Penetration rates and microleakage rates of sealant in different groups

2.2 原子力顯微鏡觀察結(jié)果

即刻組及停留30 s組的二維圖像均顯示明顯的樹(shù)脂突，清晰規(guī)則，三維圖像顯示樹(shù)脂突密集排列，樹(shù)脂突長(zhǎng)度無(wú)顯著差異。見(jiàn)圖2、3。

3 討 論

窩溝封閉作為預(yù)防窩溝齲的一種有效方法已被許多研究證實(shí)，并被臨床廣泛接受[9-11]。窩溝封閉通過(guò)保護(hù)牙釉質(zhì)不受細(xì)菌及代謝產(chǎn)物的侵蝕，以及斷絕原來(lái)存在于窩溝中細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源這兩種作用機(jī)制，有效預(yù)防乳、恒牙窩溝齲的發(fā)生[12]。

樹(shù)脂類窩溝封閉劑是一種高分子材料，具有良好的流動(dòng)性，可以滲入狹窄的窩溝底部[13]。理論上，流動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)， 窩溝封閉劑滲透的深度應(yīng)增加。本研究結(jié)果表明光照之前停留滲透30 s可以使封閉劑的滲透深度及封閉劑與牙面之間的密合性達(dá)到最優(yōu)化，滲透30 s以上封閉劑的滲透深度并沒(méi)有繼續(xù)明顯增加，微滲漏率也并沒(méi)有顯著減少；相反，隨著滲透時(shí)間的增加，其滲透深度的平均值略有降低，微滲漏率也略有升高，但是與滲透30 s組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并沒(méi)有顯著差異。

1987年Chosack等[14]研究了光照之前滲透時(shí)間分別為0.5 s、5.0 s、10.0 s及20.0 s的樹(shù)脂突長(zhǎng)度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)滲透20.0 s可以使封閉劑形成的樹(shù)脂突達(dá)到最長(zhǎng)。Meyer-Lueckel等[15]在2006年研究了5種粘結(jié)劑及1種封閉劑分別在滲透15、30 s后滲透進(jìn)牛牙釉質(zhì)表面損害的能力，他們的研究結(jié)果顯示滲透時(shí)間增加，其材料的滲透深度及均一性均顯著增加。

A：二維圖，顯示明顯的樹(shù)脂突，清晰規(guī)則；B：三維圖，顯示樹(shù)脂突密集排列，長(zhǎng)度一致

A：二維圖，顯示樹(shù)脂突明顯清晰，排列規(guī)則均勻；B：三維圖，顯示樹(shù)脂突長(zhǎng)度一致，排列密集

窩溝封閉劑被特定波長(zhǎng)的光源照射后，很快聚合固化，失去流動(dòng)性。如果光照之前窩溝封閉劑有足夠的時(shí)間來(lái)滲透，則其滲透深度可達(dá)到最大化，不會(huì)產(chǎn)生與牙面之間的縫隙，與牙面達(dá)到良好的密合性，即不會(huì)產(chǎn)生微滲漏。因?yàn)楣夤袒瘶?shù)脂暴露于環(huán)境光線中較長(zhǎng)時(shí)間時(shí)也會(huì)逐漸固化[16]。同理臨床操作時(shí)，如果滲透時(shí)間延長(zhǎng)，由于環(huán)境光源的影響，樹(shù)脂類封閉劑表層也會(huì)緩慢固化，影響了封閉劑的流動(dòng)，導(dǎo)致表層下的封閉劑固化不全或固化不均勻，使深窩溝最底處封閉不全且密合不良；同時(shí)臨床操作時(shí)滲透時(shí)間延長(zhǎng)，增加了唾液污染的風(fēng)險(xiǎn)，并不能產(chǎn)生理論上最大的滲透深度與最小的微滲漏。Hosseinipour、張曉曉等均研究證實(shí)唾液污染后窩溝封閉的微滲漏明顯增加[17-18]。Gawali等[19]研究發(fā)現(xiàn)唾液污染后疏水性封閉劑材料滲透深度明顯減少。

Chosack等[14]通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)臨床使用光固化封閉劑通常不超過(guò)5 s即光照，并且由于兒童配合程度的影響，幾乎都是即刻光照。光固化封閉劑因易控制，操作時(shí)間短，縮短了對(duì)幼兒控制唾液污染的時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)在臨床廣受歡迎。臨床中如果為了獲得最佳的滲透深度而使?jié)B透時(shí)間延長(zhǎng)，同時(shí)又要防止唾液污染，則必須保證完全的隔濕與干燥。

原子力顯微鏡一般有3種工作模式:接觸模式(contact mode)、非接觸模式(non-contact mode)和敲擊模式(tapping mode)[20]。3種模式各有特點(diǎn)，可根據(jù)樣品性質(zhì)及實(shí)驗(yàn)需求選擇不同模式。其中敲擊模式不僅減少了接觸模式下掃描時(shí)針尖對(duì)樣品表面的影響，又具有比非接觸模式高的分辨率，適合樹(shù)脂突超微結(jié)構(gòu)研究，因此本研究選擇了敲擊模式。關(guān)于掃描電鏡觀察口腔科材料超微結(jié)構(gòu)的文獻(xiàn)很多，原子力顯微鏡在口腔研究中的應(yīng)用逐漸廣泛，Tuncay等[21]利用原子力顯微鏡研究樹(shù)脂根管封閉劑表面硬度，Keinan等[22]用原子力顯微鏡觀察牙釉質(zhì)的形態(tài)結(jié)構(gòu)，但是關(guān)于原子力顯微鏡觀察封閉劑樹(shù)脂突的實(shí)驗(yàn)較少，因此本實(shí)驗(yàn)嘗試用原子力顯微鏡觀察封閉劑樹(shù)脂突的形成情況。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，臨床操作窩溝封閉中，光照之前使封閉劑有最佳的滲透時(shí)間，可以獲得良好的邊緣封閉性能，期待進(jìn)一步研究證實(shí)，以望臨床應(yīng)用。