張群華，范小平，劉媛，袁文波，周愛(ài)梅，王國(guó)慶，陳贛

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.吉安井岡農(nóng)業(yè)生物科技有限公司，江西 吉安 343000)

柚苷酶(Naringinase)是一種由α-L-鼠李糖苷酶以及β-D-葡萄糖苷酶兩種酶組合而成的復(fù)合酶[1]，其不僅在柚柑類水果加工以及給食品增添香味中發(fā)揮作用，還可以用于生產(chǎn)抗生素、生物轉(zhuǎn)化類固醇和皂苷等[2-3]。然而游離柚苷酶對(duì)周圍環(huán)境敏感，在極端pH值、溫度等因素的作用下容易失活。為解決這一問(wèn)題，將游離酶固定在非溶性載體上來(lái)提高酶的穩(wěn)定性和重復(fù)利用率成為了一種簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)的方法[4]。

本研究選用生物相容性和機(jī)械性能俱佳的聚氨酯(PU)材料，采用電紡技術(shù)制備PU納米纖維膜(PUNF)，并用殼聚糖(CTS)對(duì)纖維膜表面進(jìn)行親水改性，引入功能性基團(tuán)，有效固定柚苷酶，提高酶的負(fù)載量和增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

聚氨酯(PU)，工業(yè)塑料；柚苷酶制劑(酶活 10 000 U/g)，食品級(jí)；丙酮(含量≥99.5%)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF，含量≥99.5%)、柚皮苷(純度≥99%)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，含量≥98.5%)、N-羥基珀酰亞胺(NHS，含量≥98%)、殼聚糖(CTS，脫乙?；?5%)、氫氧化鈉、乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀均為分析純；所用蒸餾水為一級(jí)水。

E02型靜電紡絲機(jī)；BS1240S型電子天平；HJ-4A型數(shù)控恒溫多頭磁力攪拌器；KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)；Sdc-100接觸角測(cè)量?jī)x；Vertex 70型傅里葉變換紅外光譜儀；Tescan Vega 3 S型掃描電鏡；T6型新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)。

1.2 酶膜的制備

1.2.1 PUNF制備 用電子天平稱取12 g的PU顆粒，加入到體積比為67∶33的丙酮和DMF溶劑中[5]，在室溫下用磁力攪拌器隔夜攪拌12 h，至完全溶解，獲得聚合物溶液。在室溫條件下，用注射器吸取5 mL的紡絲液，置于紡絲機(jī)的注射泵上，調(diào)節(jié)接收距離為22 cm，設(shè)置紡絲電壓為22 kV，注射的速率為0.5 mL/h，接收器滾輪轉(zhuǎn)速為300 r/h，待接收裝置上收集到一定厚度的PU膜，即停止紡絲。將膜放置到恒溫干燥箱中，烘30～45 min，待溶劑完全揮發(fā)后密封保存。

1.2.2 PUNF活化 將PU膜剪切成4 cm×4 cm的膜，用滴管吸取磷酸緩沖液(PBS)沖洗膜的表面，去除膜的表面雜質(zhì)。配制摩爾比為1∶2的EDC/NHS溶液，放入清洗過(guò)的PU納米纖維膜，于25 ℃恒溫水浴中反應(yīng)2 h后拿出。

1.2.3 PUNF改性 活化的PU納米纖維膜，用大量去離子水多次沖洗，除去膜表面附著的活化劑。配制一定濃度的CTS溶液(CTS用2%的乙酸溶解)，將活化后的膜浸泡在CTS溶液中，在25 ℃水浴下振蕩。以不同的CTS濃度為梯度，探究最佳改性參數(shù)。取出膜，用去離子水多次沖洗附著的CTS，將膜晾干，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 酶膜制備 準(zhǔn)備潔凈燒杯，電子天平精確稱量一定質(zhì)量的柚苷酶制劑放入其中，加入去離子水至溶解完全，于4 ℃下保存。量取30 mL柚苷酶溶液，將PU納米纖維膜浸泡在其中，置于4 ℃下反應(yīng)12 h。取出已固定柚苷酶的PU納米纖維膜，用去離子水多次洗滌，保存好原酶液、固定化后酶液以及清洗液。將沖洗后的纖維膜晾干，并保存在4 ℃的環(huán)境下。

1.3 測(cè)試與表征

1.3.1 靜電紡PU納米纖維膜的表征 采用掃描電子顯微鏡對(duì)靜電紡納米纖維膜的形貌進(jìn)行觀察，并用Nano measurer軟件測(cè)量纖維的平均直徑。使用接觸角測(cè)量?jī)x對(duì)納米纖維膜進(jìn)行接觸角的測(cè)量。對(duì)靜電紡納米纖維膜進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜分析，設(shè)置掃描范圍為500～4 000 cm-1，判斷改性后納米纖維膜上基團(tuán)的情況。

1.3.2 載酶量測(cè)定 取潔凈試管，分別取1 mL固定前的酶溶液、固定化酶后的溶液以及清洗固定化酶膜所用的溶液于試管中，加入4 mL考馬斯亮藍(lán)G-250染料試劑，輕搖混勻，分別取三組平行試樣，在分光光度計(jì)595 nm 的波長(zhǎng)處檢測(cè)對(duì)應(yīng)的吸光值，代入蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線中，得到固定前后酶溶液以及清洗酶膜液的相應(yīng)濃度[6]。以下式計(jì)算納米纖維膜上柚苷酶的負(fù)載量。

式中G——納米纖維膜上的酶固定量，mg/g；

C0，C1——分別表示固定化酶前后酶溶液中酶含量，mg/mL；

C2——沖洗固定化酶膜的去離子水中酶的含量，mg/mL；

V0——原始酶溶液的體積，mL；

V2——清洗酶膜所用的去離子水的體積，mL；

M——聚氨酯納米纖維膜的質(zhì)量，g(干重)。

1.3.3 柚苷酶酶活力的測(cè)定 參考Davis法[7]，用pH為 4.5的緩沖液配制濃度0.8 g/L的柚皮苷溶液。試劑瓶中放入酶膜，加入0.8 mL柚皮苷溶液，在50 ℃的恒溫水浴中反應(yīng)30 min。量取0.1 mL反應(yīng)后的酶解液于試管中，加入0.1 mL濃度4 mol/L的 NaOH溶液以及5 mL體積分?jǐn)?shù)為90%的一縮二乙二醇溶液，充分混合均勻后靜置10 min。用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)420 nm處測(cè)定吸光值。

柚苷酶酶活力(U)的定義：在 pH 4.5，50 ℃條件下，每分鐘降解1 μg柚皮苷所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。酶比活力(U/g或U/mL)的定義：在pH 4.5、50 ℃條件下，1 g固定化柚苷酶(或 1 mL 游離柚苷酶)所表現(xiàn)出的酶活力。相對(duì)酶活力(%)按下式計(jì)算。

相對(duì)酶活力=(酶活力/最高酶活力)×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 掃描電鏡表征

圖1是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的PU紡絲液在接收距離為22 cm，紡絲電壓為22 kV，注射速率為 0.5 mL/h，接收器滾輪轉(zhuǎn)速為300 r/h的紡絲參數(shù)下制得的纖維膜的微觀結(jié)構(gòu)。

圖1 PU納米纖維膜掃描電鏡圖Fig.1 SEM of PU nanofilm

由圖1可知，紡得的PU納米纖維膜的纖維表面無(wú)串珠狀結(jié)構(gòu)，纖維不粗糙，整體較為光滑，說(shuō)明噴絲頭處的液滴在電場(chǎng)作用下能夠很好地被拉伸成絲，通過(guò)靜電紡絲獲得了具有較好纖維樣貌的納米纖維膜。由圖2可知，纖維絲直徑主要分布在450～500 nm范圍內(nèi)，纖維絲較細(xì)。

圖2 納米纖維膜直徑分布圖Fig.2 Distribution of nanofilm diameter

2.2 接觸角測(cè)量

測(cè)量CTS親水改性前后PUNF的接觸角，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，CTS改性前，PU納米纖維膜的接觸角為124.5°，即納米纖維膜表現(xiàn)為疏水性；CTS親水改性后，PU納米纖維膜的接觸角為72.8°，表現(xiàn)為親水性。這是因?yàn)镃TS分子結(jié)構(gòu)中含有大量的氨基和羥基親水基團(tuán)，使得纖維膜的親水性得到良好的改善[8]。

圖3 改性前后PUNF的接觸角Fig.3 Measurement of contact angle before (a) and after (b) modification a.改性前；b.改性后

2.3 傅里葉變換紅外光譜

圖4是PU原膜、PU-CTS膜和PU-CTS-酶膜的紅外吸收光譜圖。

圖4 傅里葉變換紅外光譜圖Fig.4 Fourier infrared spectrum

由圖4可知，經(jīng)接枝CTS后的膜相較于原膜，在2 924 cm-1增加了一個(gè)吸收峰，在3 332 cm-1處的吸收峰值增大，這可能是接枝CTS后引入的CH2—OH基團(tuán)。酶膜在705 cm-1處出現(xiàn)了一個(gè)吸收峰，這可能是酶上的氨基酸的COO變角振動(dòng)，因此可判斷柚苷酶成功地固定在了PU納米纖維膜上。

2.4 殼聚糖濃度對(duì)載酶量及其酶活力的影響

CTS質(zhì)量濃度測(cè)試結(jié)果見圖5。

圖5 殼聚糖濃度對(duì)膜上載酶量的影響Fig.5 Effect of CTS concentration on loading amount of PU nanofilm

由圖5可知，當(dāng)PU膜接枝了CTS后，使得膜的載酶量有了較大幅度的提升，可能是由于CTS上的親水基團(tuán)為柚苷酶提供了更多的接枝位點(diǎn)。載酶量隨著CTS的濃度增大而增大，CTS濃度0.5%時(shí)，PU膜上的載酶量達(dá)到最大值，為83.2 mg/g。CTS濃度>0.5%時(shí)，載酶量下降，這可能是由于空間位阻的影響，在PU膜上的纖維表面所排列的CTS過(guò)于緊密，導(dǎo)致柚苷酶與膜之間的傳質(zhì)通道受到限制。

由圖6可知，CTS濃度增加時(shí)，柚苷酶的相對(duì)酶活性隨之增大，CTS濃度為0.5%時(shí)，柚苷酶酶活力達(dá)到最大值。隨著CTS濃度的增加，對(duì)PU膜的親水改性效果越好，良好的親水性可以給柚苷酶提供一個(gè)微水環(huán)境，有利于酶活性的保持[9]，所以柚苷酶的酶活力逐漸增加。而后隨著濃度增大，酶活力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，一方面可能由于在柚苷酶對(duì)柚皮苷進(jìn)行分解作用的過(guò)程中，PU膜上固定的柚苷酶量出現(xiàn)了下降的趨勢(shì)，載酶量的下降使得對(duì)柚皮苷的脫苦率有所下降；另一方面是CTS濃度的增加，導(dǎo)致纖維膜內(nèi)部空間受影響，酶與底物催化的傳質(zhì)阻力增大。

圖6 殼聚糖濃度對(duì)固定化酶的酶活力的影響Fig.6 Effect of CTS concentration on relative activity of immobilized enzyme

2.5 溫度對(duì)酶活力的影響

一般情況下，酶催化底物的速率開始時(shí)隨溫度的增加而逐漸升高，待溫度到達(dá)一定值，由于溫度過(guò)高使得酶蛋白發(fā)生變性而抑制其活性，導(dǎo)致酶解反應(yīng)速率降低[10]。因而探究了溫度對(duì)柚苷酶活力的影響，情況見圖7。

圖7 酶解溫度對(duì)固定化酶的酶活力的影響Fig.7 Effect of temperature on relative activity of immobilized enzyme

由圖7可知，游離柚苷酶和固定化柚苷酶的酶活力均先上升后下降，在溫度50 ℃時(shí)具有最高酶活力。在30～50 ℃和50～70 ℃時(shí)，固定化柚苷酶的酶活力均高于游離柚苷酶的酶活力，說(shuō)明經(jīng)固定化后，酶溫度穩(wěn)定性得到了提高。

2.6 酶解時(shí)間對(duì)酶活力的影響

圖8是在不同的時(shí)間長(zhǎng)度下分別用游離酶和固定化酶對(duì)柚皮苷進(jìn)行脫苦，對(duì)比不同時(shí)間下柚苷酶的相對(duì)酶活性。

圖8 酶解時(shí)間對(duì)固定化酶的酶活力的影響Fig.8 Effect of time on relative activity of immobilized enzyme

由圖8可知，在脫苦時(shí)間為0.5 h時(shí)，固定化柚苷酶的酶活性反而比游離酶低，這可能是受載體影響，酶與底物接觸需要經(jīng)過(guò)一段傳質(zhì)通道，因而剛開始的時(shí)候固定化酶酶活性會(huì)低于游離酶。隨著時(shí)間的增加，柚苷酶與柚皮苷越來(lái)越充分的接觸，使得催化效果越好，因此固定化柚苷酶的酶活力也逐漸增加，直至催化反應(yīng)時(shí)間為1.5 h時(shí)，酶活性達(dá)到最大值。而游離酶在催化時(shí)間為1 h時(shí)達(dá)到最大酶活力后，隨著時(shí)間推移，酶活力逐漸下降，可能是因?yàn)橛坞x狀態(tài)的酶操作穩(wěn)定性不佳，因而隨時(shí)間的延長(zhǎng)酶活性呈自然下降趨勢(shì)。

2.7 pH值對(duì)酶活力的影響

用不同pH值的緩沖溶液配制柚皮苷溶液，向不同pH的底物中分別加入游離酶和固定化酶膜，50 ℃條件下反應(yīng)1 h測(cè)定酶活力。

由圖9可知，游離柚苷酶和固定化柚苷酶的酶活力均先上升后下降，且同時(shí)在pH為4～5之間時(shí)酶活力達(dá)到最大值。然而在pH為2～4和4～6之間時(shí)，固定化柚苷酶的酶活力均高于游離柚苷酶的酶活力，說(shuō)明經(jīng)固定化后的酶pH穩(wěn)定性得到了提高。

圖9 酶解pH值對(duì)固定化酶的酶活力的影響Fig.9 Effect of pH on relative activity of immobilized enzyme

3 結(jié)論

(1)在PU紡絲液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，紡絲參數(shù)為：接收距離22 cm，紡絲電壓22 kV，注射速率 0.5 mL/h，接收器滾輪轉(zhuǎn)速300 r/h的條件下可獲纖維形貌良好的納米纖維膜。

(2)使用CTS對(duì)PU膜進(jìn)行親水改性，使得納米纖維膜有親水性，膜上接枝了作為親水基團(tuán)的羥基，當(dāng)殼聚糖濃度為0.5%，聚氨酯膜有最佳的載酶量，為83.2 mg/g，對(duì)柚皮苷催化活力達(dá)到最大值。

(3)經(jīng)過(guò)固定化的柚苷酶相較于游離酶，在一定的催化時(shí)間、pH和溫度范圍內(nèi)均表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性。