何燕超，張靜，馮凈凈，梅周芳，錢(qián)凌，黃琦慧，揭志軍

社區(qū)獲得性肺炎（community acquired pneumonia，CAP）是成人最常見(jiàn)的感染性疾病，既往流行病學(xué)調(diào)查顯示CAP重癥患者的病死率達(dá)20%～30%，其中有不少病例的病原學(xué)仍不明確［1］。由于既往受限于檢測(cè)手段，目前對(duì)CAP病原學(xué)認(rèn)知主要集中在細(xì)菌、真菌等領(lǐng)域，但對(duì)于病毒的認(rèn)知較少。近年來(lái)，隨著核酸檢測(cè)的發(fā)展，呼吸道標(biāo)本病毒檢測(cè)技術(shù)得到長(zhǎng)足進(jìn)展，多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)方法可以對(duì)單樣本進(jìn)行多種病毒檢測(cè)［2］。過(guò)去數(shù)年來(lái)的國(guó)外一些研究發(fā)現(xiàn)CAP患者合并呼吸道病毒感染率超過(guò)四分之一，這更新了臨床對(duì)呼吸道病毒感染的認(rèn)知［3-5］。

在我國(guó)，呼吸道病毒核酸檢測(cè)普及面仍不足，相關(guān)研究仍較少，北京地區(qū)做了初步的細(xì)菌、支原體等常見(jiàn)病原體引起的CAP合并呼吸道病毒感染病毒譜研究，發(fā)現(xiàn)其發(fā)病率與國(guó)外研究類(lèi)似，但其臨床特征未有進(jìn)一步的分析［6］。因此，為了闡明我國(guó)CAP合并呼吸道病毒感染患者的臨床特征并尋找是否存在特異性的生物標(biāo)記物，本研究通過(guò)分析CAP患者合并呼吸道病毒感染情況，以及比較病毒陽(yáng)性組與病毒陰性組的臨床特征和生物標(biāo)記物的差異性，希望從中發(fā)現(xiàn)一些對(duì)于臨床診斷與治療有價(jià)值的信息。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2017年6月—2019年5月復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院住院部收治的CAP患者276例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《中國(guó)成人社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南（2016年版）》（以下簡(jiǎn)稱(chēng)CAP指南）［7］的診斷標(biāo)準(zhǔn)并按照CAP指南進(jìn)行診治：①社區(qū)發(fā)病。②肺炎相關(guān)臨床表現(xiàn)：a.新近出現(xiàn)的咳嗽、咳痰或者原有呼吸道疾病癥狀加重，伴或不伴膿痰、胸痛、呼吸困難及咯血；b.發(fā)熱；c.肺實(shí)變體征和/或聞及濕啰音；d.外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)＞10×109/L或＜4×109/L，伴或不伴細(xì)胞核左移。③肺部影像學(xué)檢查顯示新出現(xiàn)的斑片狀浸潤(rùn)影、葉或段實(shí)變影、磨玻璃影或間質(zhì)性改變，伴或不伴胸腔積液。符合①、③及②中任何1項(xiàng)，并除外肺結(jié)核、肺部腫瘤、非感染性肺間質(zhì)性疾病、肺水腫、肺不張、肺栓塞、肺嗜酸粒細(xì)胞癥及肺血管炎等疾病。（2）年齡≥18周歲。（3）達(dá)到了CAP指南［7］建議住院治療的標(biāo)準(zhǔn)。（4）患者同意參加本次調(diào)查，并自愿接受實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和病原學(xué)檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）過(guò)去90 d內(nèi)曾住院或長(zhǎng)期依賴(lài)護(hù)理者。（2）現(xiàn)處于免疫抑制狀態(tài)（包括HIV感染、應(yīng)用免疫抑制劑、腫瘤化療）的患者。（3）已知或疑似活動(dòng)性肺結(jié)核患者。（4）懷孕或哺乳期。根據(jù)納入與排除標(biāo)準(zhǔn)剔除52例患者，最終納入223例CAP患者，其中男115例，女109例；年齡18～95歲，平均年齡（52.4±20.7）歲。另從上海市閔行區(qū)江川社區(qū)體檢人群中選取24例健康成人為對(duì)照組，其中男12例，女12例；年齡39～64歲，平均年齡（48.6±6.9）歲；納入標(biāo)準(zhǔn)：近2周內(nèi)無(wú)感染表現(xiàn)，胸部影像學(xué)亦未發(fā)現(xiàn)上述③中改變。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)〔（2017）倫審（049備）〕，所有研究對(duì)象已簽署書(shū)面知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 收集并記錄研究對(duì)象的一般情況（包括年齡、性別、吸煙史、合并癥等）、癥狀評(píng)估（咳嗽、咳痰、卡他癥狀）、體征評(píng)估（體溫、脈搏、呼吸頻率、血壓）、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果（包括血常規(guī)、肝功能、凝血功能、血?dú)夥治龅龋?、抗生素使用時(shí)間、住院時(shí)間及疾病轉(zhuǎn)歸等。

1.2.2 咽拭子處理 采集受試者咽拭子標(biāo)本后放入內(nèi)含3 ml的 MEM 轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)液（含 1 mg/ml慶大霉素、1 000 U/ml青霉素、2.5 μg/ml兩性霉素B和2%胎牛血清）的帶旋蓋試管中，暫時(shí)存放在-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 呼 吸 道 病 毒 核 酸 檢 測(cè) 采 用 High Pure Viral Nucleic Acid試劑盒（瑞士羅氏公司）抽提咽拭子標(biāo)本中的DNA/RNA，抽提物用50 μl洗脫液溶解，立即放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎枚嘀爻彩椒崔D(zhuǎn)錄酶 - 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（nested multiplex RT-PCR）檢測(cè)試劑盒（日本TaKaRa公司）檢測(cè)8種（10型）呼吸道病毒，包括流感病毒A型（Flu A）、流感病毒B型（Flu B）、腺病毒（ADV）、呼吸道合胞體病毒A型（RSVA）、呼吸道合胞體病毒B型（RSVB）、鼻病毒（RhV），副流感病毒（PIV）、冠狀病毒（CoV）、博卡病毒（BoV）、偏肺病毒（MPV）。采用Prime Script Reverse Transcriptase Kit（日本 TaKaRa 公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，PCR的反應(yīng)程序根據(jù)說(shuō)明書(shū)推薦進(jìn)行。

1.2.4 細(xì)胞因子檢測(cè) 采用Merck Millipore人類(lèi)細(xì)胞因子/趨化因子試劑盒（96孔板，美國(guó)RayBiotech公司）檢測(cè)白介素（IL）-6、IL-8、IL-10、干擾素（IFN）-γ、干擾素誘導(dǎo)蛋白（IP）-10和腫瘤壞死因子（TNF）-α等水平。采用Luminex200TM（美國(guó)Luminex公司）分析結(jié)果并儲(chǔ)存。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件及GraphPad.cameyo 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)表示，兩組比較采用χ2檢驗(yàn)（含校正公式）或Fisher's確切概率法，3組比較采用χ2檢驗(yàn)，對(duì)于有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異采用χ2分割法和Bonferroni校正進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較，對(duì)于超過(guò)20%理論頻數(shù)＜5或理論頻數(shù)＜1的樣本采用Fisher's確切概率法；計(jì)量資料正態(tài)分布以（±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，3組比較采用方差分析，對(duì)于有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異采用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)一步行兩兩比較；計(jì)量資料偏態(tài)分布以M（QR）表示，兩組比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，3組比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CAP患者呼吸道病毒檢出情況及病毒譜分析 223例CAP患者中檢測(cè)到有61例（27.35%）合并呼吸道病毒感染，其中58例（26.01%）為單病毒感染，3例（1.35%）為多種病毒感染（分別是 Flu A+RhV，F(xiàn)lu A+Flu B，RSVA+ RhV+CoV）。單病毒感染中22例（9.87%）為Flu A、14例（6.28%）為RhV、9例（4.04%）為Flu B、5例（2.24%）為ADV、2例（0.90%）為CoV、2例（0.90%）為 RSVA、2例（0.90%） 為 MPV、1例（0.45%） 為BoV、1例（0.45%）為RSVB，PIV未檢出。

2.2 CAP患者呼吸道病毒檢出與年齡的關(guān)系 依據(jù)CAP指南老年標(biāo)準(zhǔn)［7］將CAP患者分為非老年（≤65歲）組158例和老年（＞65歲）組65例，兩組患者病毒檢出率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 老年與非老年CAP患者呼吸道病毒檢出情況比較〔n（%）〕Table 1 Comparison of the respiratory virus detected in elderly and nonelderly patients with community acquired pneumonia

2.3 CAP患者呼吸道病毒檢出與季節(jié)的關(guān)系 研究時(shí)間為2017年6月—2019年5月，按春（3—5月）、夏（6—8月）、秋（9—11月）、冬（12—2月）四季劃分，CAP患者四季均會(huì)有呼吸道病毒感染，其中冬季為高發(fā)季節(jié)，其后依次為秋季、夏季、春季，感染病毒主要有Flu A、RhV、Flu B，見(jiàn)表 2。

表2 223例CAP患者中檢出的病毒與季節(jié)的關(guān)系（例）Table 2 Relationship between viruses detected and seasons in 223 patients with community acquired pneumonia

2.4 CAP患者臨床特征分析 按照呼吸道病毒檢測(cè)結(jié)果將223例CAP患者分為病毒陽(yáng)性組61例和陰性組162例。病毒陽(yáng)性組死亡率高于陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中病毒陽(yáng)性組死亡患者均為合并流感病毒感染；兩組年齡、性別、吸煙比例、合并癥比例、咳嗽比例、咳痰比例、卡他癥狀比例、體溫、脈搏、呼吸頻率、收縮壓、舒張壓、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、C反應(yīng)蛋白、紅細(xì)胞沉降率、降鈣素原、D-二聚體、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶、pH值、動(dòng)脈氧分壓（PO2）、動(dòng)脈二氧化碳分壓（PCO2）、血氧飽和度（SpO2）、抗菌藥物使用時(shí)間、住院時(shí)間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表3。

表3 病毒陽(yáng)性組和病毒陰性組CAP患者的臨床特征比較Table 3 Clinical characteristics of virus-positive and virus-negative groups of community acquired pneumonia patients

因考慮死亡患者均合并流感病毒感染，遂進(jìn)一步進(jìn)行亞組分析。將呼吸道病毒陽(yáng)性組分為流感組（包括Flu A和Flu B）31例和非流感組27例（不含多病毒感染3例患者），流感組、非流感組和病毒陰性組乳酸脫氫酶水平及死亡率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中流感組乳酸脫氫酶水平高于非流感組，流感組死亡率高于病毒陰性組（P＜0.05）；流感組、非流感組和病毒陰性組年齡、性別、吸煙比例、合并癥比例、咳嗽比例、咳痰比例、卡他癥狀比例、體溫、脈搏、呼吸頻率、收縮壓、舒張壓、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、C反應(yīng)蛋白、紅細(xì)胞沉降率、降鈣素原、D-二聚體、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、pH值、PO2、PCO2、SpO2、抗菌藥物使用時(shí)間、住院時(shí)間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表4。

表4 流感組、非流感組、病毒陰性組CAP患者的臨床資料比較Table 4 Comparison of clinical characteristics across virus-positive community acquired pneumonia patients with and without influenza infection，and virusnegative community acquired pneumonia patients

針對(duì)病毒陽(yáng)性組和陰性組的影像學(xué)特征進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，病毒陽(yáng)性組雙肺病變、多肺葉病變、斑片狀滲出影比例高于病毒陰性組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表5。

表5 病毒陽(yáng)性組與病毒陰性組CAP患者的影像學(xué)特征比較〔n（%）〕Table 5 Imaging characteristics of virus-positive and virus-negative groups of community acquired pneumonia patients

2.5 CAP患者血清細(xì)胞因子分析 按對(duì)照組的性別、年齡等進(jìn)行配對(duì)抽取呼吸道病毒陽(yáng)性CAP患者24例和呼吸道病毒陰性CAP患者24例，比較病毒陽(yáng)性組、病毒陰性組及對(duì)照組血清細(xì)胞因子水平，結(jié)果顯示，病毒陽(yáng)性組、病毒陰性組、對(duì)照組的IL-10、IFN-γ和IP-10水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中病毒陽(yáng)性組IL-10水平高于病毒陰性組，IL-10、IFN-γ、IP-10水平高于對(duì)照組，病毒陰性組IL-10、IP-10水平高于對(duì)照組（P＜0.05）；病毒陽(yáng)性組、病毒陰性組、對(duì)照組IL-6、IL-8和TNF-α水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表6。

表6 病毒陽(yáng)性組、病毒陰性組及對(duì)照組血清細(xì)胞因子水平比較〔M（QR），μg/L〕Table 6 Comparison of serum cytokine levels between virus-positive and virus-negative groups of community acquired pneumonia patients，and control group

3 討論

隨著PCR技術(shù)的發(fā)展，臨床對(duì)呼吸道病毒感染關(guān)注熱度逐漸上升，呼吸道病毒感染在CAP中的作用還有許多問(wèn)題不清楚，需要進(jìn)一步探索。近期國(guó)內(nèi)相關(guān)指南建議，如在診治過(guò)程中不能排除病毒性肺炎，可積極采取抗病毒治療，尤其是流感［7］。然而，目前大多數(shù)呼吸道病毒缺乏有效藥物，如RhV、ADV、RSV和CoV等［8-9］。肺炎合并呼吸道病毒感染是否在臨床特征、臨床轉(zhuǎn)歸上有差異尚未可知。

本研究發(fā)現(xiàn)有27.35%的成人CAP患者合并呼吸道病毒感染，其中Flu A、RhV和Flu B最常見(jiàn)。國(guó)外一些研究報(bào)道亦發(fā)現(xiàn)成人CAP住院患者合并呼吸道病毒感染率為 20%～30%［10-11］，BURK 等［12］對(duì) 2003—2011年發(fā)表的31篇研究進(jìn)行薈萃分析，結(jié)果顯示CAP合并呼吸道病毒感染率為24.5%，其中常見(jiàn)病毒類(lèi)型與本研究結(jié)果基本一致。也有一些報(bào)道與本研究存在較大差異性，TEMPLETON等［13］研究顯示有56%的CAP住院患者合并呼吸道病毒感染。另外，本研究關(guān)于病毒感染的季節(jié)性分析發(fā)現(xiàn)，冬季為病毒感染的高發(fā)期，這與國(guó)外研究基本一致［14-15］。

本研究對(duì)呼吸道病毒感染CAP患者的臨床特征首次做了詳細(xì)地分析和報(bào)道。遺憾的是，并沒(méi)有在病毒陽(yáng)性組和病毒陰性組的臨床特征中發(fā)現(xiàn)有特別價(jià)值的差異性。本研究觀察到病毒陽(yáng)性組的住院時(shí)間、抗生素使用時(shí)間與病毒陰性組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是死亡人數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，由于病毒陽(yáng)性組5例死亡病例均為合并流感病毒感染，進(jìn)一步將病毒感染組按是否為流感病毒感染分為兩個(gè)亞組，亞組分析中，流感組死亡率高于非流感組和病毒陰性組，臨床特征顯示流感組乳酸脫氫酶水平高于非流感組。以上結(jié)果說(shuō)明，對(duì)于流感病毒感染患者需要及時(shí)干預(yù)治療，乳酸脫氫酶升高可作為CAP是否合并流感病毒感染的參考因素。本研究又進(jìn)一步分析病毒陽(yáng)性患者與病毒陰性患者影像學(xué)特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病毒陽(yáng)性患者更容易出現(xiàn)雙肺病變、多肺葉病變、斑片狀滲出影，這可能作為判斷CAP是否合并呼吸道病毒感染的參考依據(jù)。

另外，本研究對(duì)CAP合并呼吸道病毒感染的血清細(xì)胞因子進(jìn)行了初步探索，篩選了6個(gè)常見(jiàn)的與病毒感染相關(guān)的細(xì)胞因子，并在病毒陽(yáng)性組和病毒陰性組各隨機(jī)選取24例，同時(shí)選取24例健康體檢者作為對(duì)照組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病毒陽(yáng)性組IL-10升高且高于病毒陰性組和對(duì)照組，而IP-10、IFN-γ雖然相對(duì)對(duì)照組升高，但與病毒陰性組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。已有研究發(fā)現(xiàn)IL-10為一種多功能的負(fù)向調(diào)節(jié)因子，主要由輔助性T細(xì)胞（Th2）分泌，可激活B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞巨噬系統(tǒng)，在病毒感染中起到對(duì)抗炎性反應(yīng)的作用［16-17］。以上結(jié)果說(shuō)明IL-10可能是CAP患者合并呼吸道病毒感染的參考指標(biāo)。

當(dāng)然，本研究仍存在一定的局限性，咽拭子檢測(cè)呼吸道病毒僅局限于上呼吸道，很難排除是否合并病毒性肺炎，這可能會(huì)對(duì)本研究結(jié)果造成一定影響，但是病毒性肺炎多數(shù)預(yù)后不良，對(duì)抗細(xì)菌治療無(wú)反應(yīng)［7］。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CAP患者合并呼吸道病毒感染較為常見(jiàn)，其臨床特征無(wú)明顯差異，合并多數(shù)呼吸道病毒感染未發(fā)現(xiàn)影響轉(zhuǎn)歸，但合并流感病毒感染可能會(huì)導(dǎo)致死亡率增加，CAP合并呼吸道病毒感染在影像學(xué)上多表現(xiàn)為多肺葉、雙肺浸潤(rùn)影，IL-10可能作為CAP合并呼吸道感染的預(yù)測(cè)指標(biāo)。本研究在一定程度上更新了對(duì)CAP的認(rèn)知，為判斷CAP合并呼吸道病毒感染提供了一些參考。

作者貢獻(xiàn)：何燕超、揭志軍進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，結(jié)果的分析與解釋?zhuān)撐牡男抻?，?fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；何燕超、張靜進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；何燕超、張靜、馮凈凈、梅周芳、錢(qián)凌、黃琦慧進(jìn)行數(shù)據(jù)收集；張靜進(jìn)行數(shù)據(jù)整理；何燕超撰寫(xiě)論文，進(jìn)行英文的修訂；揭志軍對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益沖突。