姚婷 臧國慶 陳小華

丁型肝炎是慢性病毒性肝炎的最嚴(yán)重形式，高達(dá)70%的病人可發(fā)展為肝硬化，增加肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)[1]。 全球超過2.5億人感染HBV, 其中約有1 300萬合并HDV感染[2]。HBV/HDV共感染致病機(jī)制尚待闡明，干擾素作為目前常用藥物，療效甚微且副作用多[3]。雖然還有其他藥物可用于治療HDV，但是治療方法遠(yuǎn)未令人滿意，因此迫切需要新的治療方法用于丁型肝炎抗病毒治療。理想動物模型能深入研究病毒的感染過程、病理生理機(jī)制以及藥物或者疫苗研發(fā)，因此，本文對現(xiàn)有的各種HDV動物模型的優(yōu)缺點(diǎn)及其應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行綜述。

一、HDV介紹

HDV為環(huán)狀負(fù)性RNA病毒，約有1 700個(gè)核苷酸，約70%的堿基配對形成雙鏈桿狀結(jié)構(gòu)(圖1)，通過宿主RNA聚合酶Ⅱ復(fù)制病毒基因組，需要HBV表面抗原(HBsAg)進(jìn)行病毒裝配和傳播，通過人牛磺膽酸鈉共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(humanbile acids transportersodium taurocholate co-transporting polypeptide，hNTCP)感染肝細(xì)胞，具有嗜肝性[4]。HDV僅有一個(gè)開放閱讀框架，編碼HDAg，該蛋白有2種形式，一為由195個(gè)氨基酸殘基組成的24kDa小蛋白(S-HDAg)，二為由214個(gè)氨基酸組成的27kDa大蛋白(L-HDAg)[5]。

圖1 HDV組成圖

HDV有8個(gè)基因型，呈不同區(qū)域分布，我國主要流行基因I型和II型，屬低流行區(qū)域[6]。聚乙二醇干擾素α是目前治療HDV的主要藥物，利巴韋林、拉米夫定、核苷類似物也有一定治療作用，抑制L-HDVAg異戊烯化的藥物或阻斷NTCP受體的藥物有望成為治療丁型肝炎的新型藥物[1-2,5]。

二、HDV感染動物模型

(一)天然動物模型 HBV和HDV具有物種特異性，僅感染人類，高等靈長類動物和樹鼩[7]，常見實(shí)驗(yàn)動物對HBV和HDV具有天然抵抗力[4-5]。黑猩猩作為具有免疫能力的HDV感染動物模型存在價(jià)格昂貴及倫理問題，未能廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究[8]；對于樹鼩和其他未充分研究的物種，存在研究試劑缺乏、研究數(shù)據(jù)有限等問題[9]。土撥鼠肝炎病毒(WHV)具有與HBV相似的基因組、病毒體、復(fù)制機(jī)制及感染途徑，并誘發(fā)肝細(xì)胞癌(HCC)，因此WHV常用來替代研究HBV感染的相關(guān)發(fā)病機(jī)制、抗病毒及抗腫瘤的研究[8]。在土撥鼠模型中，觀察到與患者體內(nèi)一樣的病毒復(fù)制現(xiàn)象：在HDV復(fù)制高峰期，HBV和WHV復(fù)制均受到抑制，同時(shí)發(fā)現(xiàn)環(huán)孢素A具有抗病毒作用[9]。鴨肝炎病毒的包膜蛋白不能包封HDV核糖核蛋白，因此不能協(xié)助HDV傳播[10]。與近交系小鼠等常見的實(shí)驗(yàn)動物相比，天然動物模型一致性較差。

(二)轉(zhuǎn)基因模型 利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以直接構(gòu)建在肝臟中表達(dá)S-HDAg或L-HDAg的轉(zhuǎn)基因小鼠。雖然這些動物能表達(dá)HDAg，但血清轉(zhuǎn)氨酶水平一直處于正常范圍，未發(fā)現(xiàn)明顯的生物學(xué)或組織病理學(xué)證據(jù)提示肝臟疾病[11]。在HBV感染的基礎(chǔ)上發(fā)生HDV重疊感染是丁型肝炎常見的發(fā)病形式，于是有人將HBV轉(zhuǎn)基因小鼠和HDV轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，也未發(fā)現(xiàn)明顯的肝臟損傷證據(jù)[7, 12]。hNTCP被發(fā)現(xiàn)是HDV的功能受體[12]，hNTCP轉(zhuǎn)基因模型隨之出現(xiàn)(圖2 A)。已有研究在小鼠、大鼠、犬、豬等肝細(xì)胞中成功表達(dá)hNTCP，促進(jìn)了HDV感染模型的建立[13]。然而該模型只能維持非常短暫的HDV病毒血癥，HBV也無法感染肝細(xì)胞，由此該模型無法用來研究HBV/HDV共感染的發(fā)病機(jī)制[14]。據(jù)推測，HBV入胞可能除了需要hNTCP之外，還需要其他人類肝細(xì)胞特異性因子的輔助[15]。同時(shí)只有小于17 d的hNTCP轉(zhuǎn)基因幼鼠才能實(shí)現(xiàn)HDV感染，而此時(shí)小鼠的免疫系統(tǒng)還未發(fā)育成熟，因此用該模型來研究機(jī)體免疫系統(tǒng)對HDV的抗病毒作用仍不適用[9]。相比于免疫缺陷型人源化小鼠，hNTCP轉(zhuǎn)基因小鼠的易于操作，具有一致性。利用此模型，研究人員證明HDV感染可被識別HBV包膜蛋白的S1或S結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體阻斷，進(jìn)一步說明了前S1和hNTCP之間的相互作用是HDV入胞的關(guān)鍵[12,15-16]。有研究者還對該模型進(jìn)行了改進(jìn)，將HBsAg結(jié)合的3個(gè)NTCP殘基人源化，由此創(chuàng)造出HBV和HDV共同感染的條件，而且能在免疫系統(tǒng)發(fā)育完全的成年小鼠上完成。但是在HDV表達(dá)蛋白和復(fù)制基因組的第6天，HBV便喪失入胞能力[17]，因此限制了HBV/HDV共同感染的研究。

(三)基于載體的模型 基于載體構(gòu)造HDV模型主要為尾靜脈注射重組質(zhì)?；虿《尽＿@種載體模型相比于其他模型的突出的優(yōu)點(diǎn)是能引入具有任何所需突變或基因型的HDV基因組，從而評估突變及不同基因型的發(fā)病機(jī)制，但是由于小鼠不是HBV和HDV的天然宿主，不能完全模擬病毒的復(fù)制周期，新產(chǎn)生的病毒顆粒不能重新感染肝細(xì)胞[18]。

Bruno B. Bordier等將分別帶有HDV基因型I和Ⅲ的1.2倍全長基因組的質(zhì)粒通過尾靜脈注入HBV轉(zhuǎn)基因鼠體內(nèi)，并且在小鼠體內(nèi)成功檢測到HDV病毒血癥(圖2 B)[19]。然而，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)基因組和反基因組HDV RNA的增加持續(xù)兩周后，從第15天到第30天，HDV RNA逐漸減少。同時(shí)，在這些動物的血清中未檢測到抗HDV抗體，這可能是HBV轉(zhuǎn)基因小鼠處于免疫耐受的狀態(tài)。該模型主要應(yīng)用范圍包括：1. HBV轉(zhuǎn)基因小鼠對病毒抗原具有免疫耐受性，可以模擬慢性乙型肝炎的HDV重疊感染；2. 該模型可用來研究宿主與病毒之間的相互作用[8]。3. 該模型可以用來研究病毒的組裝及釋放。

利用腺病毒為載體，Lester等將重組的HBV和HDV基因組注射入小鼠體內(nèi)(圖2C)，注射后的第7天，小鼠血清中檢測到HBV和HDV基因組；病毒血癥在第21天達(dá)到高峰，第45天開始下降，但是在第21天時(shí)病毒顆粒就喪失傳染性，具體原因尚未明確，猜測可能是第21天時(shí)小鼠產(chǎn)生了HBsAg抗體限制了HDV的傳染性[13]。腺病毒重組HDV可以在無HBV的存在下感染肝細(xì)胞，但是病毒組裝成具有傳染性的病毒顆粒時(shí)必須有HBV的存在。該研究進(jìn)一步證實(shí)了HBV/HDV共同感染時(shí)HBV的病毒載量減少；相對與HDV單獨(dú)感染，抗HDAg水平減低[20]。對于二者現(xiàn)象的推測為HDV競爭性消耗HBsAg，導(dǎo)致HBV病毒量下降；HDAg被包含在病毒顆粒中，減少了與B細(xì)胞的接觸，導(dǎo)致抗體量下降[9]?？傊?，以腺病毒為載體的HDV模型可以用來研究疾病的發(fā)生發(fā)展及免疫應(yīng)答，同時(shí)通過改變病毒的基因組確定病毒感染中的關(guān)鍵元件[13]。

(四)人源化小鼠 免疫缺陷小鼠通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)誘導(dǎo)小鼠肝臟遭受嚴(yán)重的損傷，然后通過移植人類原代肝細(xì)胞生長出帶有人類肝細(xì)胞的小鼠肝臟。HDV感染模型的建立大約需要移植占整個(gè)肝臟組織40%～60%的人原代肝細(xì)胞，即約3×107個(gè)原代肝細(xì)胞/只。通過尾靜脈注射丁型肝炎患者血清，實(shí)現(xiàn)丁型肝炎的感染病程(圖2 D)，大約6周后HDV RNA的拷貝數(shù)大約在106/mL[21]。該模型在固有免疫研究中展示出較高的應(yīng)用價(jià)值，證實(shí)了高水平的干擾素刺激因子、炎癥因子及前纖維化細(xì)胞因子與HDV引起重癥肝炎有關(guān)[22]。同時(shí)可以研究重疊感染HDV對HBV的影響——高滴度(>8 log IU/mL)或長時(shí)間的HDV感染可能觸發(fā)HDV誘導(dǎo)的HBV抑制[23]。該模型有以下幾點(diǎn)不足：1. 人原代肝細(xì)胞無法在體內(nèi)外增殖，限制了可利用動物的數(shù)量； 2. 人原代肝細(xì)胞離體后會迅速去分化，從而失去NTCP的表達(dá)，降低對HBV感染的敏感性；3. 人類肝細(xì)胞植入的小鼠免疫功能缺陷，因此無法用于分析病毒-宿主免疫之間的相互作用研究；4. 該模型耗時(shí)長，技術(shù)復(fù)雜，成本高[7]。

圖2 各HDV模型的構(gòu)造示意圖

表1 HDV感染模型特點(diǎn)比較

三、前景與展望

HDV動物模型為研究HDV的復(fù)制過程、病理機(jī)制、藥物研究及疫苗的研發(fā)等領(lǐng)域提供了重要研究平臺，但是迄今為止開發(fā)的模型尚不能完全呈現(xiàn)HDV感染的所有特征，而且利用鼠類進(jìn)行研究存在物種差異性等問題。尋找理想的HDV感染動物模型可為丁型肝炎發(fā)病機(jī)制研究及藥物研發(fā)提供新的思路與平臺。